吳青云，熊雪婷，許碧蓮，，陳文雙，崔 燎，，吳 鐵，張新樂

（廣東醫(yī)學(xué)院1.藥理學(xué)教研室、2.廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524023）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為特征的慢性全身性自身免疫性疾病，通?？蓪?dǎo)致不可逆的關(guān)節(jié)破壞、畸形，甚至殘疾、死亡。其在疾病發(fā)展和治療過程中容易并發(fā)骨質(zhì)疏松［1］。骨關(guān)節(jié)的破壞和骨質(zhì)疏松是其致殘的主要原因［2］。有研究顯示，在第1年，68%的RA患者骨質(zhì)丟失（＞－0.003 g·cm－2）加速，四肢骨密度的丟失與進(jìn)展性關(guān)節(jié)損害相關(guān)［1］。RA及其并發(fā)癥給社會(huì)和家庭帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前雖然有許多藥物治療RA，如免疫抑制劑、非甾體類抗炎藥、改變病情的抗風(fēng)濕性藥物等，糖皮質(zhì)激素類藥物（Glucocorticoids，GCs）因其強(qiáng)大的抗炎及免疫抑制作用，依然是臨床上治療RA的一個(gè)無可替代的藥物。近年來臨床研究顯示，GCs能有效地控制RA癥狀及降低炎性指標(biāo)，具有改善病情、抑制骨關(guān)節(jié)破壞的作用［3－4］。但也有文獻(xiàn)報(bào)道，長(zhǎng)期應(yīng)用 GCs治療RA會(huì)加重骨質(zhì)丟失，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生率增加［2］。

因此，本實(shí)驗(yàn)采用Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠模型，利用骨生物力學(xué)和micro-CT等技術(shù)，觀察潑尼松（prednisone，PDN）給藥3個(gè)月后對(duì)股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨微觀結(jié)構(gòu)及骨生物力學(xué)性能的影響，為GCs治療RA的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40只♂6周齡Lewis大鼠，由北京維通利華公司提供，體質(zhì)量（135±16）g。

1.2 藥品及儀器醋酸潑尼松片購自廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司（批號(hào)：120901），牛源性Ⅱ型膠原蛋白購自四川大學(xué)，弗氏不完全佐劑（IFA）購自美國(guó)Sigma公司。viva micro-CT 40（SCANCO Medical AG，瑞士）、858 Mini Bionix型材料測(cè)試機(jī)及測(cè)試系統(tǒng)（MTS，美國(guó)）。

1．3 CIA模型的建立及動(dòng)物分組6周齡Lewis♂大鼠40只，適用性飼養(yǎng)2周后，隨機(jī)分出6只為正常對(duì)照（control，CON）組，其余34只用來造模。此模型制備是將牛源性Ⅱ型膠原蛋白（collagenⅡ，CⅡ）溶解于0.05 mol·L－1的醋酸溶液中，4℃過夜，再與等體積的弗氏不完全佐劑混合，充分乳化（操作在冰上進(jìn)行），將乳化后的液體滴在水中后不擴(kuò)散且成形視為乳化完全，制得1.5 g·L－1Ⅱ型膠原乳劑。剃除大鼠背部周圍毛，取配置好的乳劑，自鼠尾根部開始，在脊柱兩旁皮內(nèi)多點(diǎn)注射。每只鼠注射乳劑0.4 ml，1周后以相同方法、劑量加強(qiáng)免疫1次［5］。正常對(duì)照組按相同方法注射0.05 mol·L－1醋酸0.4 ml。免疫3周后篩選出發(fā)生關(guān)節(jié)炎（關(guān)節(jié)評(píng)分≥4）的大鼠，進(jìn)行隨機(jī)分成CIA組（n＝7）、CIA加潑尼松 4.5 mg·kg－1·d－1［CIA＋PDN（4.5 mg·kg－1·d－1）］組（n＝6）、CIA加潑尼松 9 mg·kg－1·d－1［CIA＋PDN（9 mg·kg－1·d－1）］組（n＝7）。每組大鼠按5 ml·kg－1·d－1灌胃給藥，連續(xù)給藥90 d。每周稱體重1次，并按體重變化調(diào)整給藥量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大鼠麻醉后心臟抽血處死，迅速取出左股骨用生理鹽水紗布、錫紙包裹，－20℃保存。

1.4 骨生物力學(xué)參數(shù)的測(cè)定檢測(cè)時(shí)，將－20℃保存的左股骨常溫解凍，生理鹽水復(fù)濕，剔除股骨上面殘存的肌肉，將股骨置于流變儀上分別進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，加載速度為 0.01 mm·s－1，跨距為 15 mm［6］。記錄載荷－變形曲線，從曲線上直接獲取或依公式計(jì)算出相應(yīng)的力學(xué)指標(biāo)：彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷、剛度參數(shù)。

1．5 M icro-CT測(cè)量將處理好的左股骨遠(yuǎn)心端（已截?cái)啵?biāo)本沿長(zhǎng)軸垂直固定于樣品固定器內(nèi)。vivaCT 40選擇掃描參數(shù)：圖像矩陣為2 048×2 048，整合時(shí)間（integration time）為200 ms，能量/強(qiáng)度為70 kVp、114μA、8 W。以00旋轉(zhuǎn)，進(jìn)行掃描。掃描完成后，選取距生長(zhǎng)板遠(yuǎn)端1.0 mm、層厚3.0 mm的骨組織為松質(zhì)骨感興趣區(qū)域（ROI）行三維重組，以最低閾值為190提取圖像信息。獲得重組圖像后，使用micro-CT自帶的軟件進(jìn)行定量分析。物理參數(shù)分析如下：骨密度（bone mineral density，BMD）、骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume/total volume，BV/TV）、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（structuremodel index，SMI）、骨小梁數(shù)量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.Sp）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均以±s形式表示，采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及組間比較。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠股骨生物力學(xué)參數(shù)的變化與CON組比較，CIA組大鼠股骨彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷、剛度均明顯減小（P＜0.01）。與CIA組比較，潑尼松2個(gè)劑量組骨生物力學(xué)參數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見Tab 1。

2．2 各組大鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨M icro-CT定量參數(shù)的變化與CON組比較，CIA組股骨BMD、Tb.Th、Tb.N、BV/TV均明顯減小（P＜0.05，P＜0.01），而 SMI、Tb.Sp明顯增加（P＜0.01），骨小粱形態(tài)結(jié)構(gòu)從板狀向桿狀化轉(zhuǎn)變。與CIA組比較，潑尼松2個(gè)劑量組 Tb.Sp均減小（P＜0.05，P＜0.01），而Tb.N、BV/TV均增加（P＜0.05，P＜0.01），但 SMI、BMD、Tb.Th均無明顯變化（P＞0.05）。潑尼松2個(gè)劑量組之間各參數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見Tab 2。

2．3 各組大鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨M icro-CT的3D圖

Micro-CT的三維可視化成像結(jié)果形象地展示了各組大鼠股骨遠(yuǎn)心端松質(zhì)骨的形態(tài)變化情況。

CON組骨小梁走向一致，粗細(xì)均勻，形狀規(guī)則，排列密集；CIA組骨小梁稀疏、排列不均、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失、呈現(xiàn)出明顯的骨微結(jié)構(gòu)破壞，不能保持完整的微觀構(gòu)筑。潑尼松2個(gè)劑量組的骨微結(jié)構(gòu)破壞較CIA組有所減輕，表現(xiàn)為骨小梁增多，間隙變小，出現(xiàn)較多完整的骨小梁連接結(jié)構(gòu)。潑尼松2個(gè)劑量組之間變化無差別。見Fig 1。

Tab 1 Changes of biomechanical properties of femur in rats in different groups（±s）

Tab 1 Changes of biomechanical properties of femur in rats in different groups（±s）

**P＜0.01 vs CON

Group n Elastic load/N Maximum load/N Break load/N Stiffness/N·mm－1 CON 6 105.7±19.0 145.7±15.0 142.8±15.3 456.6±60.2 CIA 7 55.6±12.9** 85.1±10.6** 77.7±17.0** 259.2±45.1**CIA＋PDN（4.5 mg·kg－1·d－1） 6 65.3±13.5 94.8±14.5 90.5±16.9 305.3±43.7 CIA＋PDN（9 mg·kg－1·d－1）7 66.8±9.3 91.6±5.4 82.11±16.01 286.6±35.2

Tab 2 Changes ofm icrostructural parameters of distal femur in rats in different groups（±s）

Tab 2 Changes ofm icrostructural parameters of distal femur in rats in different groups（±s）

*P＜0．05，**P＜0．01 vs CON；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 vs CIA

Group n SMI Tb.N/mm－1 Tb.Th/mm Tb.Sp/mm BV/TV/% BMD/mg·cm－2 CON 6 1.94±0.11 2.57±0.31 0.08±0.00 0.41±0.05 0.16±0.02 652.44±14.50 CIA 7 2.99±0.31** 0.61±0.17** 0.06±0.01** 1.77±0.41** 0.01±0.01**624.17±16.96*CIA＋PDN（4.5mg·kg－1·d－1） 6 2.79±0.26 1.04±0.29Δ 0.07±0.01 1.05±0.28Δ 0.04±0.02Δ 642.16±15.26 CIA＋PDN（9mg·kg－1·d－1） 7 2.77±0.24 1.17＋0.31ΔΔ 0.06±0.01 0.92±0.20ΔΔ 0.04±0.01ΔΔ630.21±22.73

Fig 1 Segmented（SEG）image ofm icro-CT of distal femur in rats in different groups

與CON組比較，CIA組紅色部分明顯增多，橙色、黃色也多，提示CIA組分離度增大，骨小梁之間的距離明顯變大。與CIA組比較，潑尼松2個(gè)劑量組綠色增多，紅色、橙色、黃色減少，提示潑尼松2個(gè)劑量組骨小梁分離度變小，骨小梁之間的距離變小。潑尼松2個(gè)劑量組之間變化無顯著性差別。見Fig 2。

與CON組比較，CIA組紅色部分明顯減少，說明骨小梁變薄。與CIA組比較，潑尼松2個(gè)劑量組紅色部分都沒有明顯增多，說明厚度增加不明顯。潑尼松2個(gè)劑量組之間變化無顯著性差別。見Fig 3。

3 討論

骨生物力學(xué)主要是研究骨組織在外界作用下的力學(xué)性能和骨在受力后的所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，是評(píng)價(jià)藥物對(duì)骨質(zhì)量的指標(biāo)［6－7］，骨量的減少以及骨質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的改變均能影響骨生物力學(xué)，可降低生物力學(xué)強(qiáng)度。另外，micro-CT通過X線掃描和三維重建，極大地解決了骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)測(cè)量方面存在切片方向的不固定性和二維平面的局限性的問題，成為研究分析骨微觀結(jié)構(gòu)的新興技術(shù)，是理想的研究骨形態(tài)學(xué)的工具［5－6］。本實(shí)驗(yàn)所用到的vivaCT 40能夠在不破壞樣品的前提下，對(duì)骨骼進(jìn)行高分辨率X線成像，顯示骨骼內(nèi)部詳盡的三維信息，各項(xiàng)參數(shù)通過自帶的軟件便可獲得的優(yōu)點(diǎn)，且獲得了二維測(cè)量所無法獲得的三維參數(shù)，并可對(duì)分割不同的骨密度的部位進(jìn)行定量分析，避免因取材部位不一致造成誤差。

Fig 2 Trabecular separation image ofm icro-CT of distal femur in rats in different groups

Fig 3 Trabecular thickness image ofm icro-CT of distal femur in rats in different groups

由Tab 1可知，與正常對(duì)照組比較，CIA大鼠彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷、剛度均明顯減小。最大載荷即強(qiáng)度，能反映整個(gè)骨綜合的抗外力沖擊能力，與骨的尺寸和幾何形狀有關(guān)。剛度又稱外在硬度，反映抗變形的能力。CIA大鼠股骨的結(jié)構(gòu)破壞、骨生物力學(xué)性能降低，易變形和斷裂，骨折風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。另外，CIA大鼠股骨 BMD、Tb.Th、Tb.N、BV/TV明顯減小，SMI、Tb.Sp明顯增加。SMI是用于評(píng)價(jià)骨小梁的形態(tài)結(jié)構(gòu)，定義骨小梁板狀和桿狀的程度，理想板狀結(jié)構(gòu)為0，理想桿狀結(jié)構(gòu)為3，發(fā)生骨質(zhì)疏松時(shí)，骨小梁從板狀向桿狀轉(zhuǎn)變，SMI數(shù)值增加。CIA組的SMI比CON組明顯增加，接近3，表明建模后骨小粱形態(tài)結(jié)構(gòu)桿狀化［8－9］。SMI值增加可能是由于關(guān)節(jié)炎大鼠破骨細(xì)胞在骨表面的吸收功能增加，破骨細(xì)胞吸收功能大于成骨細(xì)胞骨形成功能，使得吸收范圍逐漸擴(kuò)大，進(jìn)而發(fā)展到由板狀結(jié)構(gòu)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闂U狀結(jié)構(gòu)。由板狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)闂U狀結(jié)構(gòu)，骨小梁之間的連接逐漸變細(xì)、斷裂，最后被破壞，甚至消失，大鼠股骨松質(zhì)骨網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的完整性遭到破壞，發(fā)生骨折的危險(xiǎn)性增加，這與生物力學(xué)的參數(shù)結(jié)果一致，表明松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)的改變影響了骨承載能力，對(duì)生物力學(xué)性能產(chǎn)生影響，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［8－9］。三維結(jié)構(gòu)重建后的大鼠股骨遠(yuǎn)心端股骨分割圖可直接觀察骨小梁的結(jié)構(gòu)形態(tài)。骨小梁分離度圖可直接反映骨小梁的距離情況，從綠到紅，反映了骨小梁之間的距離越來越大，骨質(zhì)疏松越來越嚴(yán)重。骨小梁厚度圖除了可見骨小梁的結(jié)構(gòu)和幾何信息外，還可直接反映骨小梁的厚度分布情況，從綠到紅，反映了骨從薄到厚，給出骨骼的結(jié)構(gòu)參數(shù)及力學(xué)參數(shù)的定量數(shù)值，觀察骨微結(jié)構(gòu)變化。從micro-CT的3D圖可見，CIA組大鼠骨小梁變稀疏、數(shù)目減少、變細(xì)、斷裂、間距變寬、形態(tài)不規(guī)則、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失、排列不均，呈現(xiàn)出明顯的骨微結(jié)構(gòu)破壞，不能保持完整的微觀構(gòu)筑，表明大鼠股骨骨微結(jié)構(gòu)發(fā)生了骨質(zhì)疏松樣改變。

由Tab 2可見，與CIA組比較，潑尼松2個(gè)劑量組Tb.N均增加，Tb.Sp均降低。由micro-CT的3D圖也可見，潑尼松2個(gè)劑量組大鼠股骨骨小梁增多，間隙變小，小梁連接結(jié)構(gòu)增多，骨微結(jié)構(gòu)破壞減輕。提示潑尼松灌胃治療3個(gè)月后，CIA大鼠股骨的松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)破壞有所改善。GCs可下調(diào)多種炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，抑制白細(xì)胞的遷移，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞功能。另外通過抑制致炎因子TNF-α、IL-6、IL-17等，調(diào)節(jié)核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κb ligand，RANKL）的表達(dá)，而抑制破骨細(xì)胞的活性［10－11］。

與CIA組比較，潑尼松2個(gè)劑量組大鼠股骨松質(zhì)骨SMI、骨小梁厚度、骨密度及生物力學(xué)參數(shù)均無明顯變化。提示經(jīng)潑尼松治療3個(gè)月后，CIA大鼠骨小粱形態(tài)結(jié)構(gòu)仍是桿狀化，其松質(zhì)骨的板狀結(jié)構(gòu)沒有恢復(fù)，未能明顯修復(fù)骨小梁穿孔的結(jié)構(gòu)。由于結(jié)構(gòu)和骨小梁厚度無明顯改善，從而使股骨的生物力學(xué)性能及骨密度都沒有明顯改善。GCs可直接抑制成骨細(xì)胞的產(chǎn)生，加速成骨細(xì)胞的凋亡，同時(shí)可抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子在成骨細(xì)胞的表達(dá)，降低骨的轉(zhuǎn)換率［12］。因此，GCs雖然可以抑制炎癥因子，對(duì)CIA大鼠股骨的松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)破壞有所改善，但是GCs抑制骨形成作用，導(dǎo)致松質(zhì)骨的板狀結(jié)構(gòu)、生物力學(xué)性能和骨密度都無法恢復(fù)。

由結(jié)果可見，潑尼松 4.5、9 mg·kg－1·d－1對(duì)CIA大鼠股骨松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)的作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果提示，通過增加潑尼松的劑量，并不能獲得更好的效果。進(jìn)一步提示，單用GCs治療RA，即使增加GCs的劑量，也不能阻止骨質(zhì)疏松的發(fā)生，因此，必須聯(lián)合用藥。如何通過聯(lián)合用藥防治RA誘發(fā)的骨質(zhì)疏松，還有待于進(jìn)一步的研究。

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