李洪波，胡 興，李 娜，吳東海

（1.懷化學(xué)院生命科學(xué)系，民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南懷化 418008；2.中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，廣東廣州 510530）

C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白（C1q and tumor necrosis factor related protein，CTRP）是一類與脂聯(lián)素在結(jié)構(gòu)和功能上極為類似的蛋白。這些蛋白與脂聯(lián)素非常相似，一般由4個不同結(jié)構(gòu)域組成：N-末端的信號肽、短的可變結(jié)構(gòu)域、膠原結(jié)構(gòu)域和1個與補(bǔ)體蛋白C1q同源的C-末端的球形結(jié)構(gòu)域，C-末端的球形區(qū)是其功能區(qū)［1］。在已發(fā)現(xiàn)的CTRPs中，CTRP2與脂聯(lián)素的功能最為相似，CTRP2能快速激活A(yù)MPK、ACC及p44/42 MAPK的磷酸化信號通路；CTRP2球狀結(jié)構(gòu)域（gCTRP2）具有增加肝臟糖原合成、促進(jìn)脂肪酸的氧化及胰島素增敏作用。CTRPs作用機(jī)制的研究主要是利用其球狀功能區(qū)蛋白［1－3］。重組全長hCTRP2蛋白已在大腸桿菌中和酵母中實現(xiàn)活性表達(dá)［4－5］，本研究將以大腸桿菌為宿主菌，制備重組hCTRP2的球狀功能區(qū)蛋白（gH2），并對其活性進(jìn)行分析。

1 材料

表達(dá)菌株 BL21-codonplus（DE3）、表達(dá)載體pET32a（＋）購自Invitrogen公司。鎳親和層析樹脂購自Qiagen公司，分子篩Sephadex G-75購自于GE公司，抗體均購自于CST公司。8周齡的C57BL/6♂小鼠由中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院實驗動物中心飼養(yǎng)。

2 方法

2.1 表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)產(chǎn)物的驗證設(shè)計上游引物PF（5′-3′）：5′-GCGGATCCGTGGCAGTGACCAAGAGCTA C-3′（GGATCC BamHI位 點）；下 游 引 物 PR（5′-3′）：5′-GCCTCGAGTCAGATTAGGAAGCCCGTAAA G-3′（CTCGAG XhoI位點）；PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因并構(gòu)建重組載體pET32/gH2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-codonplus（DE3）菌株。隨機(jī)挑取數(shù)個轉(zhuǎn)化子單菌落，接種至20ml含50 g·L－1Amp LB液體培養(yǎng)基的50 ml三角瓶中，37℃、250 r·min－1培養(yǎng)至 A600＝0.6～0.8，加入IPTG至終濃度為0.2mmol·L－1，20℃誘導(dǎo)3 h，取菌液2 ml，離心得菌體，向菌體中加入含1%曲拉通X-100、3mmol·L－1PMSF的PBS溶液200μl，超聲破碎，離心取上清80 μl，向其中加入20μl5×SDS-PAGE上樣緩沖液，加熱變性，SDS-PAGE分析目標(biāo)蛋白的可溶性表達(dá)情況。

2.2 重組蛋白純化取種子菌液1 ml，接種至200 m l抗性LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250 r·min－1培養(yǎng)至 A600＝0.6～0.8，于20℃誘導(dǎo)5 h，離心取菌體。鎳親合純化參照精編分子生物學(xué)實驗指南和文獻(xiàn)進(jìn)行［5－6］。將鎳親合純化后的蛋白利用曲拉通X-114去除內(nèi)毒素并濃縮，Superdex G-75分子篩純化，具體步驟參照文獻(xiàn)進(jìn)行［7］。取不同咪唑濃度的蛋白洗脫液和經(jīng)分子篩純化收集的蛋白，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液、經(jīng)煮沸變性后，15%SDS-PAGE分析純化情況，利用已制備的hCTRP2C-端特異體對蛋白進(jìn)行Western blot驗證［8］。Trx（硫氧還蛋白）的表達(dá)與純化參照文獻(xiàn)進(jìn)行［4］。

2.3 重組蛋白活性分析C2C12于5%胎牛血清中培養(yǎng)至90%細(xì)胞密度，2%馬血清的DMEM培養(yǎng)基分化培養(yǎng)6 d，無血清饑餓12 h，加入終濃度為1 mg·L－1Trx-gH2蛋白溫育不同時間，RIPA裂解細(xì)胞，離心收集蛋白上清，12%SDSPAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜并利用相應(yīng)抗體對相應(yīng)信號通路蛋白進(jìn)行Western blot分析。

C57BL/6小鼠實驗操作嚴(yán)格按照動物委員會的相關(guān)規(guī)定開展。實驗小鼠在實驗前先測定其基礎(chǔ)血糖濃度；之后，按2μg·g－1體重腹腔注射15只經(jīng)12 h饑餓的8周齡♂小鼠，尾靜脈取血10μl，測定注射后0－5 h的血糖濃度；同時，設(shè)注射Trx的對照實驗小鼠15只（2μg·g－1體重）。

3 結(jié)果

3.1 載體構(gòu)建及表達(dá)產(chǎn)物驗證pET32/gH2重組載體測序表明質(zhì)粒構(gòu)建正確。重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)前后的SDS-PAGE結(jié)果如Fig 1所示，可以看出，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)重組載體BL21轉(zhuǎn)化子（泳道6）在35 ku的位置沒有出現(xiàn)明顯的特異表達(dá)產(chǎn)物，而5株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組載體的BL21轉(zhuǎn)化子（泳道1－5）在35 ku有明顯的蛋白表達(dá)（箭頭所示），該蛋白的分子質(zhì)量大小與預(yù)期分子質(zhì)量相符。

Fig 1 SDS-PAGE identification of the expression of Trx-gH2

3.2 重組蛋白的純化SDS-PAGE分析結(jié)果表明，利用含40 mmol·L－1咪唑的漂洗緩沖液幾乎不能將目標(biāo)蛋白從鎳親合層析柱上洗下；當(dāng)咪唑為100 mmol·L－1時，目標(biāo)蛋白的純度最高；當(dāng)咪唑濃度為200和300 mmol·L－1時目標(biāo)蛋白被大量洗脫但有少量雜蛋白（Fig 2-A）。將100 mmol·L－1咪唑洗脫的蛋白樣品收集，曲拉通X-114除去內(nèi)毒素后透析、超濾濃縮，再利用Sephadex G-75分子篩對重組蛋白進(jìn)一步純化，分子篩純化蛋白的洗脫曲線如Fig 2-B所示。洗脫曲線第1個峰的1－5號蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果如Fig 2-C所示，該蛋白在SDS-PAGE結(jié)果中看不到明顯雜蛋白條帶。利用hCTRP2的C-端特異性抗體對該蛋白進(jìn)行了Western blot分析，結(jié)果如Fig 2-D所示，Western blot結(jié)果表明，蛋白洗脫曲線峰1的蛋白是Trx-gH2蛋白。

3.3 活性分析細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的Western blot結(jié)果如Fig 3A所示，經(jīng)2 mg·L－1的Trx-gH2刺激5 min，可以檢測到磷酸化ACC較刺激前加強(qiáng)；刺激細(xì)胞10 min，ACC磷酸化程度有明顯增強(qiáng)；當(dāng)刺激細(xì)胞達(dá)30 min，ACC磷酸化的增加更為明顯。由于Trx不能激活A(yù)CC的磷酸化［4］，細(xì)胞刺激實驗表明，大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白Trx-gH2具有生物活性。降血糖活性測定結(jié)果表明：在注射前，兩組小鼠的血糖水平?jīng)]有明顯差異；在注射1 h后，注射Trx-gH2小鼠的血糖要明顯低于注射Trx的對照小鼠，在注射2 h后兩者之間存在明顯差異；在注射后的1～4 h內(nèi)，注射Trx-gH2的實驗組小鼠的血糖都要明顯低于注射Trx的對照組小鼠，但注射后5 h，兩實驗組小鼠的血糖差異消失（Fig 3B）。動物實驗結(jié)果證明，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的Trx-gH2蛋白具有降血糖活性。

4 討論

Fig 2 Purification and identification of fusion recombinant protein of Trx-gH2

Fig 3 Biological activity assays of purified fusion recombinant protein Trx-gH2

利用酵母表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對hCTRP2的全長蛋白進(jìn)行了表達(dá)，在酵母表達(dá)系統(tǒng)中，重組蛋白被酵母自身分泌的Yapsin蛋白酶降解，因而分泌的hCTRP2蛋白被立即切割成分子量大小不同的片段［4－5，9］；pET32為表達(dá)載體，實現(xiàn)了全長hCTRP2在大腸桿菌中的可溶性融合表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物具有生物活性。hCTRP2的球狀區(qū)是其功能區(qū)，目前在對CTRPs蛋白的功能和作用機(jī)制研究時主要利用其球狀功能區(qū)蛋白。Lee等［10］將hCTRP6與GST融合，也實現(xiàn)了hCTRP6球狀區(qū)的可溶表達(dá)，但其表達(dá)量很低［10］。雖然GST標(biāo)簽也可增加一些重組蛋白的可溶性表達(dá)，但對于CTRPs蛋白，GST標(biāo)簽不能有效地增加CTRPs蛋白的可溶性表達(dá)。本研究最后以N端融合有Trx-tag的pET-32a（＋）為表達(dá)載體，實現(xiàn)hCTRP2球狀區(qū)蛋白的高效可溶表達(dá)。與酵母表達(dá)系統(tǒng)相比，大腸桿菌表達(dá)的Trx-gH2沒有出現(xiàn)產(chǎn)物降解現(xiàn)象，說明CTRP2在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性要比酵母高。

在細(xì)胞刺激實驗時，Trx-gH2和酵母表達(dá)的hCTRP2一樣，有激活A(yù)CC磷酸化的作用，在重組蛋白刺激細(xì)胞5 min后都能檢測到磷酸化水平的增加［5］；在檢測動物水平的降血糖活性時，酵母表達(dá)的全長hCTRP2在注射小鼠1 h時的降血糖活性并不明顯［5］，而注射Trx-gH2蛋白在注射1 h后呈現(xiàn)出降血糖活性，說明Trx-gH2蛋白在動物水平上的活性出現(xiàn)得似乎更快一些；注射酵母表達(dá)的hCTRP2的降血糖活性可以維持至少7 h［5］，而注射Trx-gH2 5 h后，其降血糖活性消失。由于Trx-gH2蛋白融合了Trx片段，雖然注射的蛋白質(zhì)量相同，但與酵母表達(dá)的hCTRP2相比，Trx-gH2蛋白質(zhì)分子要少，因此出現(xiàn)Trx-gH2降血糖持續(xù)活性不如酵母表達(dá)的全長hCTRP2?？傊?，本研究為hCTRP2或相似蛋白的可溶、穩(wěn)定和活性表達(dá)找到了一種高效的蛋白表達(dá)系統(tǒng)和純化方法。

參考文獻(xiàn)：

［1］Wong GW，Wang J，Hug C，etal.A family of Acrp30/adiponectin structural and functional paralogs［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（28）：10302－7.

［2］Wei Z，Peterson JM，Wong GW.Metabolic regulation by C1q/TNF-related protein-13（CTRP13）：Activation of AMP-activated protein kinase and suppression of fatty acid-induced JNK signaling［J］.JBiol Chem，2011，86（18）：652－65.

［3］Kishore U，Gaboriaud C，Waters P，etal.C1q and tumor necrosis factor superfamily：Modularity and versatility［J］.Trends Immunol，2004，25（10）：551－61.

［4］Li H，Gao X，Zhou Y，et al.High level expression，purification and characterization of active fusion human C1q and tumor necrosis factor related protein 2（hCTRP2）in Escherichia coli［J］.Protein Expr Purif，2011，79（1）：1－6.

［5］李洪波，吳東海.重組畢赤酵母高密度發(fā)酵表達(dá)活性hCTRP2的研究 ［J］.中國藥理學(xué)通報，2013，29（12）：1738－42.

［5］Li H B，Wu D H.Large-scale production of active recombinant human C1q/TNFαrelated protein-2 in Pichia pastoris［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（12）：1738－42.

［6］Frederick FM，Brent R，Kingston R E，et al.Short Protocols in Molecular Biology，5thEdition Books［M］.New York：John Wiley and Sons，Inc.，Publishers，2000：343－502.

［7］Li H，Wang Y，Xu A，et al.Large-scale production，puricationand bioactivityassay of recombinant human interleukin-6 in themethylotrophic yeast Pichia pastoris［J］.FEMSYeast Res，2011，11（2）160－7.

［8］李洪波，胡 興，伍賢進(jìn)，等.高度特異性人補(bǔ)體C1q/TNF相關(guān)蛋白-2抗體的制備及驗證 ［J］.中國藥理學(xué)通報，2013，29（10）：1477－8.

［8］Li H B，Hu X，Wu X J，et al.High specific antibody preparation and analysis of human C1q/TNF related protein-2［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（10）：1477－8.

［9］Bourbonnais Y，Larouche C，Tremblay G M.Production of fulllength human pre-elafin，an elastase specific inhibitor，from yeast requires the absence of functional yapsin 1（yps1p）endoprotease［J］.Protein Expr Purif，2000，20（3）485－91.

［10］LeeW，Kim M J，Park E J，etal.C1q TNF-related protein-6 mediates fatty acid oxidation via the activation of the AMP-activated protein kinase［J］.FEBS Lett，2010，584（5）968－72.