于靜，王建欣，蘇素文，謝克讓，張玉，楊繼章，蘇悅

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科，石家莊 050031；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，石家莊 050017；3.河北省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究院生殖醫(yī)學(xué)中心，石家莊 050050)

豨薟草提取物對抗多柔比星致大鼠急性肝腎損傷的作用及其機制*

于靜1，王建欣1，蘇素文2，謝克讓2，張玉3，楊繼章1，蘇悅2

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科，石家莊 050031；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，石家莊 050017；3.河北省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究院生殖醫(yī)學(xué)中心，石家莊 050050)

目的 探討豨薟草(HS)提取物對多柔比星(DOX)所致大鼠急性肝腎損傷的影響及其機制。方法將40只大鼠隨機分為4組,各10只:HS提取物低、高劑量組分別灌胃給予HS提取物170和340 mg·kg-1,對照組、模型組灌胃給予等容積純化水,連續(xù)7 d。給藥第5天,除對照組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液外,其他3組均腹腔注射DOX 20 mg·kg-1。于第7天將大鼠麻醉后測定血清各種生化指標、過氧化產(chǎn)物及自由基的含量以及肝臟、腎臟組織過氧化產(chǎn)物及自由基的含量。結(jié)果與模型組比較,HS提取物高、低劑量組血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)及尿素氮(BUN)水平均較低,肝臟及腎臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)及丙二醛(MDA)水平均較模型組有所恢復(fù)。肝臟組織病理結(jié)果顯示HS提取物高、低劑量組可不同程度緩解DOX所致的充血腫脹,腎臟組織病理結(jié)果顯示HS提取物高、低劑量組可不同程度緩解DOX所致的炎細胞浸潤及出血,都以高劑量組作用最為明顯。結(jié)論HS可明顯減輕DOX所致大鼠急性肝腎損傷,其作用機制可能是由于HS提取物能增強機體的抗氧化應(yīng)激能力。

豨薟草；多柔比星；損傷,肝；損傷,腎；氧化應(yīng)激

多柔比星(doxorubicin,adriamycin,DOX),又名羥柔紅霉素、阿霉素,是一種高效廣譜的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物[1]。近年來其心臟毒性已日趨引起人們的重視。筆者在應(yīng)用DOX制備大鼠心肌病模型時,發(fā)現(xiàn)對大鼠肝腎損害也相當嚴重。豨薟草(Herba siegesbeckiae, HS)性味苦寒,歸肝、腎經(jīng),有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、清熱解毒等功效,而酒蒸制后性味甘溫,又兼有補益肝腎、強筋壯骨之效。于雪峰等[2]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方豨薟草膠囊能改善高尿酸血癥腎損害大鼠的腎功能,且可使其肌酐、尿素氮水平接近正常。然而,HS提取物對DOX所致的急性肝腎損傷是否有對抗作用筆者尚未見報道。因此,本研究擬通過DOX單次給藥致大鼠急性肝腎損傷模型,觀察HS提取物對DOX所致的急性肝腎損傷是否有保護作用,并從氧化應(yīng)激的角度對其作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性Sprague-Dwaley(SD)大鼠40只,體質(zhì)量250～350 g,由河北省實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(冀2008-1-003)。動物合格證號: 808046。實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 試藥 DOX購于浙江海正藥業(yè)股份有限公司,批號:110703,臨用前用0.9%氯化鈉溶液配制而成；HS由河北祁新中藥顆粒飲片有限公司提供,產(chǎn)地:湖北,批號:20120701-1,由河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科楊繼章主任藥師鑒定；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒均購于南京建成生物工程公司；生化測定試劑尿素氮(urea nitrogen,BUN)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)均為日本SYSMEX公司的原裝進口試劑。

1.3 HS提取物的制備 豨薟草2 kg水煎2次后濃縮至4 L,加入95%乙醇,邊加邊劇烈攪拌至乙醇濃度為70%,過濾后回收乙醇,置烘干盤中入烘箱烘干,收集粉碎并稱質(zhì)量,共收集HS提取物70 g。實驗前用純化水溶解配制到所需濃度。

1.4 動物模型制備及分組 實驗動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按體質(zhì)量隨機分為4組:對照組、模型組、低劑量藥物組、高劑量藥物組,每組10只。低、高劑量藥物組分別灌胃給予HS提取物170和340 mg·kg-1[3]。對照組、模型組灌胃給予等容積純化水,qd,連續(xù)7 d,灌胃容積均為2 mL·(100 g)-1。給藥第5天除對照組外,其他3組均腹腔注射DOX 20 mg·kg-1,對照組則腹腔注射相同體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.5 血清及組織勻漿制備 末次給予HS提取物30 min后,將大鼠用1%戊巴比妥鈉(5 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后仰位固定于操作盤里,剖開動物的腹腔,自腹主動脈取血約5 mL,將血液靜置約30 min后離心10 min(3 000 r·min-1,r=12.5 cm),取上清液(血清)以備測定血清生化指標(BUN、ALT、AST)。之后取出肝臟、腎臟,用濾紙吸干水分,部分組織用冰0.9%氯化鈉溶液制備成10%勻漿液,組織充分裂解后離心10 min(3 000 r·min-1,r=12.5 cm),取上清液以備測定組織中抗氧化酶(SOD、MDA、CAT)活性[4]。另取部分組織用10%甲醛溶液固定,以備觀察組織病理學(xué)改變。

1.6 取材與石蠟切片制作 將部分肝臟、腎臟組織迅速放入10%甲醛溶液中固定24～72 h。常規(guī)梯度乙醇脫水,二甲苯透明,浸蠟,包埋。切片機上行5 μm厚冠狀切片。切片常規(guī)脫蠟,蘇木精染色,鹽酸乙醇分色,氨水返藍,伊紅復(fù)染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中型樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

1.7 觀察指標與測定方法 ALT的測定采用乳酸鹽脫氫酶-紫外分光光度(LDH-UV)法,AST的測定采用蘋果酸脫氫酶-紫外分光光度(MDH-UV)法,BUN的測定采用尿素酶-谷氨酸脫氫酶(Urease-GLDH)法。SOD的測定采用黃嘌呤氧化酶法,CAT測定采用可見光法,MDA的測定采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)法。

2 結(jié)果

2.1 血清生化指標 與對照組相比,模型組大鼠血清中ALT、AST及BUN均升高(均P＜0.01)。而低劑量藥物組血清中ALT、BUN(均P＜0.05)及AST(P＜0.01)水平降低,高劑量藥物組血清中ALT、AST、BUN水平降低更加明顯(均P＜0.01)。見表1。

2.2 HS對DOX致急性肝腎損傷大鼠肝損傷的影響

2.2.1 肝臟組織過氧化產(chǎn)物及自由基的含量測定 與對照組相比,模型組大鼠肝臟組織的SOD、CAT水平顯著下降(均P＜0.01),MDA水平顯著升高(P＜0.01)；與模型組相比,低劑量藥物組SOD(P＜0.01)、CAT(P＜0.05)水平升高,MDA(P＜0.05)水平降低。而高劑量藥物組SOD、CAT的水平顯著升高(均P＜0.01),MDA水平顯著降低(P＜0.01)。結(jié)果見表2。

2.2.2 肝臟病理切片 對照組大鼠肝細胞排列有序,未見瘀血等現(xiàn)象。模型組大鼠肝細胞可見間隙出血,瘀血擴張,偶見壞死現(xiàn)象。低、高劑量藥物組肝組織間隙出血現(xiàn)象明顯減輕,未見明顯壞死現(xiàn)象,以高劑量藥物組作用最為明顯。結(jié)果見圖1。

表1 4組大鼠血清生化指標的檢測值Tab.1 Results of serum biochemical indicators in four groups of rats ±s

表1 4組大鼠血清生化指標的檢測值Tab.1 Results of serum biochemical indicators in four groups of rats ±s

與模型組比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01;與對照組比較,*3P＜0.01Compared with model group,*1P＜0.05,*2P＜0.01;compared with control group,*3P＜0.01

組別大鼠/只劑量/(mg·kg-1) ALTAST (U·L-1) BUN/(mmol·L-1)低劑量藥物組10 17064.79±21.31*1177.72±36.87*220.07±7.16*1高劑量藥物組10 34060.00±13.35*2133.20±28.67*211.87±3.68*2模型組7 …90.96±20.05*3265.43±70.13*335.17±15.29*3對照組10 …58.29±20.27104.70±23.695.30±0.98

2.3 HS對DOX致急性肝腎損傷大鼠腎損傷的影響

2.3.1 腎臟組織過氧化產(chǎn)物及自由基的含量測定與對照組相比,模型組大鼠腎臟組織中SOD、CAT水平顯著下降(均P＜0.01),MDA水平顯著升高(P＜0.01)；與模型組比較,低劑量藥物組CAT水平升高(P＜0.01),MDA水平降低(P＜0.05),對SOD水平未見明顯影響(P＞0.05),而高劑量藥物組SOD、CAT水平顯著升高(均P＜0.01),MDA水平顯著降低(P＜0.01),SOD、CAT、MDA水平都接近正常組。見表3。

2.3.2 腎臟病理切片 對照組腎間質(zhì)未見出血、腫脹。模型組腎間質(zhì)內(nèi)有片狀出血,而低、高劑量藥物組均明顯緩解,以高劑量藥物組作用更為明顯。結(jié)果見圖2。

3 討論

本研究結(jié)果表明,DOX可引起大鼠血清中ALT、AST和BUN升高,提示DOX可引起嚴重的肝、腎損傷。而HS低劑量即可降低血清中ALT、AST及BUN的水平,HS高劑量可進一步降低血清中ALT、AST及BUN的水平,提示HS提取物對DOX急性中毒所致的肝腎損傷可能有選擇性修復(fù)作用。

對肝腎組織勻漿的分析結(jié)果表明,DOX可降低肝臟、腎臟組織中SOD、CAT的水平,升高MDA水平。DOX進入細胞后能促進活性氧和MDA生成,也能使SOD的活性降低,從而降低SOD的含量,導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷,這一結(jié)果和以前的報道類似[5-6]。與模型組相比,HS高低劑量藥物組均可升高血清中CAT、SOD水平,降低MDA水平,以高劑量藥物組作用最佳。SOD的主要作用機制是把超氧陰離子(O2-)轉(zhuǎn)換為過氧化氫(H2O2)。O2-具有細胞毒性,可使脂質(zhì)過氧化,從而損傷細胞膜引起炎癥、腫瘤和自身免疫性疾病,并可能促使機體衰老,所以其活性高低間接反映了機體清除自由基的能力。盡管H2O2仍是對機體有害的活性氧,但廣泛存在于紅細胞及某些組織內(nèi)的CAT會立即將其分解為完全無害的水。從而將有毒性的O2-和H2O2均轉(zhuǎn)化為無毒的水分子物質(zhì)。MDA是多不飽和脂肪酸過氧化物的降解產(chǎn)物,與脂蛋白交聯(lián)有毒性作用。生物體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng),氧化終產(chǎn)物為MDA,它會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合,且具有細胞毒性,其含量高低間接反映了機體脂質(zhì)過氧化的程度和機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。故此以上指標的變化提示DOX所致肝腎損傷與氧化應(yīng)激過強有關(guān)。而HS提取物不僅能有效清除自由基,保護細胞膜,還能通過增強抗氧化酶SOD和CAT的活性,提高清除自由基的能力,使脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量降低,從而達到保護機體的作用。提示HS提取物對抗DOX所致大鼠急性肝腎損傷的作用機制可能與其增強抗氧化酶的活性,清除自由基,抑制脂質(zhì)過氧化有關(guān)。

表2 4組大鼠肝臟組織過氧化產(chǎn)物及自由基的檢測值Tab.2 Results of overoxidation product and free radical in heptic tissue of four groups of rats ±s

表2 4組大鼠肝臟組織過氧化產(chǎn)物及自由基的檢測值Tab.2 Results of overoxidation product and free radical in heptic tissue of four groups of rats ±s

與模型組比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01;與對照組比較,*3P＜0.01Compared with model group,*1P＜0.05,*2P＜0.01;compared with control group,*3P＜0.01

組別大鼠/只劑量/(mg·kg-1) MDA/(nmol·mL-1) CATSOD (U·mL-1)低劑量藥物組10 17033.60±3.44*188.91±6.87*1205.02±16.01*2高劑量藥物組10 34026.83±3.50*2100.23±7.04*2235.89±15.93*2模型組7 …40.54±6.37*378.88±8.74*3176.08±16.42*3對照組10 …27.93±3.67108.56±8.40251.94±11.86

A.對照組;B.模型組;C.低劑量藥物組;D.高劑量藥物組圖1 4組大鼠肝臟組織切片圖(HE,×40)A.control group；B.model group；C.low dose drug group；D.high dose drug groupFig.1 Histopathological section of heptic tissue in four groups of rats(HE,×40)

表3 4組大鼠腎臟組織過氧化產(chǎn)物及自由基的檢測值Tab.3 Results of overoxidation product and free radical in renal tissue of four groups of rats ±s

表3 4組大鼠腎臟組織過氧化產(chǎn)物及自由基的檢測值Tab.3 Results of overoxidation product and free radical in renal tissue of four groups of rats ±s

與模型組比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01;與對照組比較,*3P＜0.01Compared with model group,*1P＜0.05,*2P＜0.01;compared with control group,*3P＜0.01

組別大鼠/只劑量/(mg·kg-1) MDA/(nmol·mL-1) CATSOD (U·mL-1)低劑量藥物組10 17030.72±3.24*145.82±5.16*227.96±7.71高劑量藥物組10 34026.36±3.46*256.75±4.40*245.71±5.34*2模型組7 …36.58±5.54*334.39±4.15*322.48±6.39*3對照組10 …25.43±3.6258.59±6.0641.25±6.46

A.對照組;B.模型組;C.低劑量藥物組;D.高劑量藥物組圖2 4組大鼠腎臟組織切片圖(HE,×40)A.control group；B.model group；C.low dose drug group；D.high dose drug groupFig.2 Tissue slice image of renal tissue in four groups of rats(HE,×40)

對肝腎組織的組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明,DOX可引起大鼠肝組織和腎小球細胞的間質(zhì)瘀血和炎細胞浸潤,這說明DOX可引起組織細胞膜的毒性反應(yīng),破壞組織形態(tài)和功能的完整性,而HS提取物低、高劑量藥物組均明顯緩解,以高劑量藥物組更為明顯,從而表明HS對DOX所致的肝腎組織結(jié)構(gòu)改變有選擇性修復(fù)作用。

綜上所述,HS提取物可對抗DOX所致大鼠急性肝腎損傷,其可能機制是通過抗氧化應(yīng)激作用而對DOX所致的肝腎損傷產(chǎn)生保護。但是HS提取物的主要成分有萜類、苷類、生物堿等,到底是什么成分發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用還有待進一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.04.003

Preventive Role of Extracts from Herba Siegesbeckiae Against Acute Hepatic and Renal Injury Induced by Doxorubicin in Rats

YU Jing1,WANG Jian-xin1,SU Su-wen2,XIE Ke-rang2,ZHANG Yu3,YANG Ji-zhang1,SU Yue2
(1. Department of Pharmacy,the First Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050031,China;2. Department of Pharmacology,Basic Medical College of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China; 3.Hebei Family Planning Research Institute of Science and Technology in Reproductive Medicine Center, Shijiazhuang 050050,China)

Objective To investigate the potential protective effect of extracts fromHerba siegesbeckiae(HS)on hepatic and renal injury induced by doxorubicin(DOX)in rats.MethodsMale Sprague-Dawley rats were randomly divided into 4 groups with 10 in each.Rats in the low and high dose groups were intragastrically administered with HS extract at the doses of 170 and 340 mg·kg-1·d-1,respectively,for 7 consecutive days.Rats in the control and model groups were given with equal amount of water.On the 5th day,all groups were given with DOX(20 mg·kg-1)intraperitoneally except the control,which was given equal amount of saline.On the 7th day,evaluation of hepatic and renal protection effects by HS extract was performed by analyzing the serum biochemical indicators,contents of preoxidation(MDA),and free radicals in both serum and tissues of the liver and the kidneys.ResultsPretreatment with HS showed significant decrement of serum BUN、ALT and AST levels in a dose-dependent manner compared with DOX group.The increment of MDA production and decrements of SOD and CAT caused by DOX were also recovered dose dependently in HS treated groups.The hepatic cells in the DOX group showed obvious congestion and swelling,whereas the symptoms in HS group were significantly relieved in a dose dependent manner.The renal interstitial in the DOX group showed obvious congestion and swelling,however the symptoms in HS group were significantly relieved.There was no obvious congestive swelling phenomenon in high dose of HS group.ConclusionHS has protective effect against DOX-induced hepatic and renal toxicities in rats which may be caused by its anti-oxidative effect.

Herba siegesbeckiae;Doxorubicin;Hepatic injury;Renal injury;Oxidative stress

R282.71;R285.5

A

1004-0781(2014)04-0422-05

2013-06-10

2013-09-30

*河北省中醫(yī)藥管理局基金資助項目(2012008)；河北省自然科學(xué)基金資助課題(C2011206145)

于靜(1982-),女,河北唐山人,主管藥師,碩士,研究方向:心血管藥理學(xué)。電話:0311-85917354,E-mail：38565914@qq.com。

蘇素文(1971-),女,河北行唐人,教授,博士,碩士生導(dǎo)師,研究方向:心血管藥理學(xué)及藥物毒理學(xué)。電話: 0311-86265644,E-mail：suswmk@163.com。