劉光耀 王海燕 白彩虹 賀海波 鄧 為陳置豐 龔學(xué)謙 次旦多吉 顏為紅

（1.三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學(xué) 中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)院／宜昌市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 宜昌443001；3.天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（三峽大學(xué)），湖北 宜昌 443002）

威靈仙系毛茛科鐵線蓮屬植物威靈仙（Clematis chinensis Osbeck）、棉團(tuán)鐵線蓮（Clematis hexapetala Pall.）或東北鐵線蓮（Clematis manshurica Rupr.）的干燥根和根莖，別名靈仙、黑須公、鐵靈仙、鐵掃帚.威靈仙味辛、咸，性溫，為臨床廣泛使用的中藥.具有祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛之功，傳統(tǒng)多用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨鯁咽喉、乳腺炎、癰瘡等［1-2］.其化學(xué)成分主要有三萜及皂苷、黃酮、揮發(fā)油（有機(jī)酸、有機(jī)酸酯、苯丙素、倍半萜、酚類）、生物堿、香豆素、木脂素、甾體、烷烴及Zn、Ca、Fe、Ni、Mg等［3-4］.隨著對(duì)其化學(xué)成分的日漸明晰，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，威靈仙除了有著突出的抗炎鎮(zhèn)痛作用外，在抗腫瘤、抗菌抑菌、抗利尿、抗瘧、降血糖、降血壓、利膽等方面的顯示了較好的療效［4-6］，能顯著降低實(shí)驗(yàn)小鼠血尿酸、血沉和C反應(yīng)蛋白的水平［7］，抑制T淋巴細(xì)胞的過度增殖、抑制細(xì)胞因子TNF-α、IL－1β和PEG2來發(fā)揮抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用［8］.但威靈仙中各種部位間抗炎作用有否有差異及對(duì)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子的干預(yù)作用研究鮮有報(bào)道.基于此，本研究擬考查威靈仙不同提取部位（石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取部位）對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO生成及iNOS和TNF－α表達(dá)的影響，比較其作用的差異，明確威靈仙脂多糖誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的活性部位，為其抗炎鎮(zhèn)痛的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步研究開發(fā)提供理論依據(jù).

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

威靈仙根和根莖購自宜昌市中醫(yī)醫(yī)院，經(jīng)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（三峽大學(xué)）汪鋆植教授鑒定為威靈仙（Clematis chinensis Osbeck），植物標(biāo)本現(xiàn)保存于天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（標(biāo)本編號(hào)：20120824）.

1.2 細(xì)胞株

小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所.

1.3 儀器與試劑

電子分析天平，中國上海梅特勒-托利多有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，中國無錫市星海王生化設(shè)備有限公司；Labconco低溫冷凍干燥儀，美國Labconco公司；UV－2000型紫外-可見分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司；LDZ5－2自動(dòng)平衡離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；GENios酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；NU－4750E型CO2培養(yǎng)箱，Nu Aire公司；SW－4T－2F潔凈工作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LS－B50L立式壓力蒸汽滅菌器，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；EcoTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀.RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胰酶、二甲基亞砜（DMSO）：Gibco公司；胎牛血清：杭州四季青生物材料有限公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、LPS：美國Sigma公司；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、一氧化氮（NO）測試試劑盒：南京建成生物工程研究所；小鼠TNF－αELISA檢測試劑盒，北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；iNOS、TNF－α以及GAPDH（上海生工生物工程有限公司合成，具體引物序列見表1）；Trizol和DEPC（上海生工生物工程有限公司）；Prime ScriptTM RT reagent Kit、Taq DNA 聚合酶（大連寶生物工程有限公司）；其他試劑均為市售分析純.

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

2 方 法

2.1 威靈仙不同部位的制備

威靈仙根和根莖粉成粗粉，以95%乙醇為溶劑，在65℃條件下常壓回流提取，提取液過濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮（溫度55℃），得深棕色浸膏，將浸膏在通風(fēng)櫥中揮干至無醇味，加入蒸餾水混懸溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯、水飽和的正丁醇萃取.在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮并回收萃取液，回收后的溶劑繼續(xù)用于萃取.合并每一種萃取溶劑的萃取物，于通風(fēng)櫥中揮干溶劑，在冷凍干燥儀上干燥.實(shí)驗(yàn)時(shí)用DMSO溶解樣品配制成質(zhì)量濃度為10mg／mL提取物藥液，再以細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成所需濃度，經(jīng)過0.22μm孔徑濾膜過濾除菌后供實(shí)驗(yàn)用，使用時(shí)用含10%血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋成目標(biāo)濃度.

2.2 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞在37℃，5%CO2條件下，用含10%小牛血清、青霉素（1×105U／L）及鏈霉素（100 mg／L）的DMEM培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長期.

2.3 威靈仙不同提取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性作用

RAW264.7細(xì)胞按5×105／孔接種于96孔板中，貼壁4h后，加入不同質(zhì)量濃度（0、25、50、100、200μg／mL）的威靈仙不同提取部位，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，孵育24h后，每次加入新配制的5mg／mL MTT液20μL，37℃避光孵育4h，終止培養(yǎng).吸去上清液，每孔加入DMSO 150μL，置搖床上低速振蕩10min后，用酶標(biāo)儀于490nm處測量各孔的吸光度值（OD490nm）根據(jù)公式：細(xì)胞抑制率＝（1-藥物孔OD值／陰性對(duì)照孔OD值）×100%.

2.4 LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性作用

為了確定LPS刺激RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)和促炎因子的作用濃度，需要確定LPS影響RAW264.7細(xì)胞安全濃度.取RAW264.7細(xì)胞按5×105／孔接種于96孔板中，貼壁4h后，加入不同質(zhì)量濃度LPS（0.125、0.25、0.5、1、2μg／mL），空白對(duì)照組只加入培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，作用24h，然后測定細(xì)胞活性，檢測方法同2.3.確定無細(xì)胞毒性的最大濃度，以下進(jìn)行LPS刺激RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)和促炎因子實(shí)驗(yàn)時(shí)按照此濃度進(jìn)行.

2.5 威靈仙不同提取部位對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響

RAW264.7細(xì)胞按5×105個(gè)／mL接種于48孔板中，貼壁4h后，然后分別加入不同質(zhì)量濃度（25、50、100μg／mL）的威靈仙不同提取部位孵育2h，再加入終質(zhì)量濃度為1μg／mL的LPS刺激24h，正常對(duì)照孔或模型對(duì)照孔加入等體積的培養(yǎng)基），每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔.作用24h后，收集上清，采用Griess法［9］測定上清中NO含量，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行.

2.6 威靈仙不同提取部位對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞iNOS活性的影響

RAW264.7細(xì)胞按5×105個(gè)／mL接種于48孔板中，貼壁4h后，然后分別加入不同質(zhì)量濃度（25、50、100μg／mL）的威靈仙不同提取部位孵育2h，再加入終質(zhì)量濃度為1μg／mL的LPS刺激24h，正常對(duì)照孔或模型對(duì)照孔加入等體積的培養(yǎng)基），每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔.作用24h后，收集上清液，測定上清液中iNOS，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行.

2.7 威靈仙不同提取部位對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α的影響

RAW264.7細(xì)胞按5×105個(gè)／mL接種于6孔板，貼壁4h后，然后分別加入不同質(zhì)量濃度（25、50、100μg／mL）的威靈仙不同提取部位孵育2h，再加入終質(zhì)量濃度為1μg／mL的LPS刺激24h，正常對(duì)照孔或模型對(duì)照孔加入等體積的培養(yǎng)基），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔.作用24h后，收集上清液，測定上清液中TNF－α含量，具體操作按各ELISA試劑盒說明書進(jìn)行.

2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測威靈仙不同提取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞iNOS和TNF－αmRNA表達(dá)量的影響

RAW264.7細(xì)胞按5×105個(gè)／mL接種于6孔板，貼壁4h后，然后分別加入不同質(zhì)量濃度（25、50、100μg／mL）的威靈仙不同提取部位孵育2h，再加入終質(zhì)量濃度為1μg／mL的LPS刺激24h，正常對(duì)照孔或模型對(duì)照孔加入等體積的培養(yǎng)基），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔.作用24h后，移走培養(yǎng)液，用PBS輕輕洗滌一遍，加入1mL Trizol，室溫靜置5min，用移液槍吹打細(xì)胞，使其充分裂解.將Trizol轉(zhuǎn)移至1.5mL無RNase的EP管中，4℃，12000rpm離心5min，棄沉淀，將上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)1.5mL無RNase的EP管中，按照0.2mL氯仿／mL Trizol加入氯仿，振蕩混勻.室溫靜置15min.4℃，12000rpm 離心15min.吸取上層水相至另一個(gè)1.5mL無RNase的EP管中.按0.5mL異丙醇／mL Trizol加入異丙醇，混勻，室溫靜置10min.4℃，13000rpm離心10min，棄上清，RNA沉于管底.按1mL 75%乙醇／mL Trizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀.4℃，13000 rpm離心15min，盡量棄上清.室溫晾干.用20μL E－lution buffer溶解RNA樣品.立即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄.逆轉(zhuǎn)錄完成后的樣品，立即進(jìn)行熒光定量或放入-80℃保存?zhèn)溆?以GAPAH為內(nèi)參照檢測iNOS和TNF－α基因的表達(dá).每組樣本重復(fù)3次，以空白對(duì)照組RAW264.7細(xì)胞的檢測基因表達(dá)量為1，2-ΔΔCT法計(jì)算各組相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式為：fold＝2-ΔΔCT＝2-（Δct實(shí)驗(yàn)組-Δct空白對(duì)照組），ΔCT＝CT待測樣品-CT內(nèi)參.

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié) 果

3.1 威靈仙不同提取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性作用

利用MTT法測定不同濃度威靈仙不同提取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞的存活率，確定威靈仙不同提取部位是否對(duì)細(xì)胞有毒性作用.圖1結(jié)果顯示，威靈仙不同提取部位（25、50、100μg／mL）對(duì) RAW264.7細(xì)胞的存活率沒有影響，但是威靈仙不同提取部位在200μg／mL時(shí)明顯降低RAW264.7細(xì)胞的存活率，同時(shí)顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)與MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.表明威靈仙不同提取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞無明顯毒性，以下研究均在200μg／mL以下進(jìn)行，即選擇威靈仙不同提取部位質(zhì)量濃度為25、50、100μg／mL進(jìn)一步觀察威靈仙不同提取部位的抗炎作用.

圖1 威靈仙不同提取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性影響

3.2 LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性影響

LPS處理細(xì)胞24h后，隨著LPS濃度的升高RAW264.7細(xì)胞存活率有所下降，當(dāng)濃度達(dá)到2μg／mL時(shí)，可使RAW264.7細(xì)胞存活率顯著降低，與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異（P＜0.01）.因此，本實(shí)驗(yàn)選取的LPS刺激RAW264.7細(xì)胞的安全濃度為1.0μg／mL作用時(shí)間為24h，以此來進(jìn)一步觀察威靈仙不同提取部位的抗炎作用及機(jī)制.

圖2 不同濃度LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性影響

3.3 威靈仙不同提取部位對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞的NO釋放影響

如圖3所示，模型組RAW264.7細(xì)胞釋放NO顯著增加，與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異（P＜0.01）；用威靈仙不同提取部位處理后，它們對(duì)激活狀態(tài)RAW264.7細(xì)胞NO釋放均具有不同程度的抑制作用，并呈良好的劑量依賴關(guān)系.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明威靈仙不同提取部位均能夠抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO釋放，其作用強(qiáng)弱依次為威靈仙乙酸乙酯部位、石油醚部位、正丁醇部位和水部位.

圖3 威靈仙不同提取部位對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響

3.4 威靈仙不同提取部位對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞iNOS的活性影響

圖4所示，模型組iNOS活性明顯增加，與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異（P＜0.01）；用威靈仙不同提取部位處理后，它們對(duì)激活狀態(tài)RAW264.7細(xì)胞iNOS活性均具有不同程度的抑制作用，并呈良好的劑量依賴關(guān)系.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，威靈仙不同提取部位均能夠抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞iNOS表達(dá)，其作用強(qiáng)弱依次為威靈仙乙酸乙酯部位、石油醚部位、正丁醇部位和水部位.

圖4 威靈仙不同提取部位對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞iNOS的活性影響

3.5 威靈仙不同提取部位對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α的影響

圖5所示，模型組TNF－α含量明顯增加，與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異（P＜0.01）；用威靈仙不同提取部位處理后，它們對(duì)激活狀態(tài)RAW264.7細(xì)胞TNF－α含量均具有不同程度的抑制作用，并呈良好的劑量依賴關(guān)系.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明威靈仙不同提取部位均能夠抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞TNF-α分泌，其作用強(qiáng)弱依次為威靈仙乙酸乙酯部位、石油醚部位、正丁醇部位和水部位.

圖5 威靈仙不同提取部位對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞分泌TNF－α的影響

3.6 威靈仙不同提取部位對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞iNOS和TNF-αmRNA表達(dá)量的影響

圖6所示，模型組RAW264.7細(xì)胞iNOS和TNF－αmRNA表達(dá)量顯著升高，與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異（P＜0.01）；用威靈仙不同提取部位處理后，它們均能降低iNOS和TNF-αmRNA表達(dá)量，其作用強(qiáng)弱依次為威靈仙乙酸乙酯部位、石油醚部位、正丁醇部位和水部位.

圖6 威靈仙不同提取部位對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞iNOS和TNF－αmRNA表達(dá)量的影響

4 討 論

炎癥發(fā)生時(shí)，機(jī)體組織常常會(huì)分泌許多抗炎癥因子來保護(hù)組織免受損傷.在生理?xiàng)l件下，促炎因子（TNF－α、IL－1β、IL－6等）和抗炎因子（IL－4、IL－10等）的分泌在體內(nèi)保持一種動(dòng)態(tài)的平衡狀態(tài).然而，當(dāng)持續(xù)過量產(chǎn)生促炎癥因子會(huì)使得整個(gè)炎癥因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的平衡被打破，進(jìn)而誘發(fā)炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)而導(dǎo)致不良的免疫反應(yīng)和炎癥失調(diào)的疾病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等.中藥威靈仙為傳統(tǒng)的抗炎中藥，近年來研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)促炎因子具有顯著的抑制作用［4］，然而對(duì)其不同提取部位間作用的差異性卻鮮見報(bào)道.基于此，本研究LPS刺激RAW264.7細(xì)胞炎癥模型，比較其不同提取部位對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞分泌促炎因子的差異.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)威靈仙威靈仙石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位均能不同程度抑制RAW264.7細(xì)胞分泌產(chǎn)生NO、iNOS、TNF－α，其作用強(qiáng)弱依次為乙酸乙酯部位、石油醚部位、正丁醇部位和水部位.

NO是具有廣泛生物活性的氣體分子，同時(shí)也是細(xì)胞間信息傳遞的重要調(diào)節(jié)因子，具有介導(dǎo)細(xì)胞免疫和炎癥反應(yīng)的功能.NO是以左旋精氨酸為底物，在一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化下合成的，它分為：結(jié)構(gòu)型（constructive NOS，cNOS）和誘導(dǎo)型（inducible NOS，iNOS）兩種，其中iNOS主要存在于巨噬細(xì)胞內(nèi)，生理?xiàng)l件下鈣／鈣調(diào)蛋白非依賴的NOS無活性表達(dá)，LPS僅刺激與炎癥有關(guān)的iNOS的表達(dá)，促使NO水平升高.研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)NO的過量生成與炎癥的發(fā)生密切相關(guān)［10-11］，在炎癥區(qū)域，由于促炎因子的異常分泌，使得NO合成和釋放大量增加.大量生成的NO一方面可對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，另一方面與氧自由基結(jié)合，生成毒性更強(qiáng)的ONOO-等物質(zhì)，從而進(jìn)一步加劇炎癥的損傷［12］，因此抑制機(jī)體NO的異常合成和釋放是治療炎癥相關(guān)疾病的重要手段.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后，其分泌iNOS水平明顯升高，NO釋放顯著增加，用威靈仙不同提取部位處理后，它們對(duì)激活狀態(tài)RAW264.7細(xì)胞iNOS活性和NO釋放均具有不同程度的抑制作用，并呈良好的劑量依賴關(guān)系.

LPS可刺激單核／巨噬細(xì)胞分泌多種促炎因子（如TNF－α、IL－6等）來誘導(dǎo)和加強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)，它們往往具有多種生物學(xué)活性，在炎癥的發(fā)生、發(fā)展以及炎癥的調(diào)控中發(fā)揮重要作用.在炎癥初期，炎癥區(qū)域的巨噬細(xì)胞分泌TNF－α，通過細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)激活其它細(xì)胞因子（如IL－6、IL－1β等）加速炎癥部位的炎癥反應(yīng)［13］；在這個(gè)過程中，NF－κB扮演著極為重要的角色.炎癥初期，炎細(xì)胞分泌的 TNF－α、IL－6、IL－1β可誘導(dǎo)NF-κB核移位，加速促炎因子的轉(zhuǎn)錄，形成惡性循環(huán)［14］.研究結(jié)果顯示LPS刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞后，可見TNF-α分泌的大量增加；威靈仙不同提取部位均能明顯抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌TNF-α，并呈劑量依賴效應(yīng).

綜上所述，威靈仙具有潛在的抗炎藥理作用，其不同提取部位均能明顯抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、iNOS炎癥因子，并且同提取部位的抗炎作用效果不同，其作用強(qiáng)弱依次為威靈仙乙酸乙酯部位、石油醚部位、正丁醇部位和水部位.目前的研究初步證實(shí)，抑制炎癥因子的分泌和釋放可能是威靈仙發(fā)揮抗炎作用機(jī)制之一，但其具體的抗炎通路還有待進(jìn)一步研究.

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