徐盈 張建芳郭芬芬 黎昱 燕鳳 徐慧 任菊霞 宋婷婷王德堂 辛?xí)匝?陳必良

（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710032）

三種單基因遺傳病的產(chǎn)前分子診斷

徐盈 張建芳*郭芬芬 黎昱 燕鳳 徐慧 任菊霞 宋婷婷王德堂 辛?xí)匝?陳必良

（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710032）

目的探討脊髓性肌萎縮癥（SMA）、苯丙酮尿癥（PKU）和先天性軟骨發(fā)育不全（ACH）產(chǎn)前基因診斷的高效的臨床檢測(cè)方法。方法根據(jù)不同單基因病的基因突變類(lèi)型，本研究應(yīng)用DHPLC技術(shù)對(duì)1例SMA陽(yáng)性家族史的胎兒絨毛樣本進(jìn)行SMN1基因7號(hào)外顯子缺失檢測(cè)，選擇正常人及SMA患者作對(duì)照。通過(guò)直接測(cè)序法分別對(duì)PKU家系和ACH家系的患者、表型正常的個(gè)體及其胎兒進(jìn)行PAH致病基因和FGFR3基因第10外顯子進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果SMA陽(yáng)性家系中，胎兒未檢測(cè)到SMN1基因7號(hào)外顯子的純合缺失，建議繼續(xù)妊娠，結(jié)果順利產(chǎn)出1名正常兒。PKU陽(yáng)性家系通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)患者在PAH基因上確實(shí)存在無(wú)義突變，c.781C＞T（p.Arg261Ter）和錯(cuò)義突變c.842C＞T（p.Pro281Leu），均為雜合子。但是胎兒與患者母親的突變類(lèi)型一致，為攜帶者，不發(fā)病，建議繼續(xù)妊娠。軟骨發(fā)育不全患者送檢標(biāo)本FGFR3基因外顯子10發(fā)現(xiàn)1處序列異常，為c.1138G＞A，導(dǎo)致編碼氨基酸改變Gly380Arg，但其胎兒羊水標(biāo)本檢測(cè)FGFR3基因外顯子10未發(fā)現(xiàn)序列異常。結(jié)論根據(jù)單基因病不同的基因突變類(lèi)型，選擇合適的方法可快速、準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)單基因病產(chǎn)前基因的診斷，盡早避免單基因病患兒的出生。

單基因??；產(chǎn)前分子診斷；脊髓性肌萎縮癥；苯丙酮尿癥；先天性軟骨發(fā)育不全

目前，遺傳病與心血管病、癌癥一起成為嚴(yán)重危害人類(lèi)健康和致死率最高的前三名疾病，也是我國(guó)出生缺陷的重要原因之一［1］。其中單基因病是遺傳病中最主要的一個(gè)類(lèi)型，它是指由于單個(gè)基因異常導(dǎo)致且以孟德?tīng)柗绞竭z傳的疾病。根據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)顯示［2］，全球出生人口單基因病累計(jì)發(fā)病率高達(dá)10／1000。盡管單個(gè)單基因疾病非常罕見(jiàn)，但所有單基因病累計(jì)占嬰兒死亡率約為20%，兒科住院率達(dá)10%。脊髓性肌萎縮癥（SMA）、苯丙酮尿癥（PKU）和先天性軟骨發(fā)育不全（ACH）是高發(fā)率、高致畸率的遺傳病，這些單基因遺傳病不僅影響著患兒及其后代的生存質(zhì)量，而且已經(jīng)成為影響人們正常生活的社會(huì)問(wèn)題，進(jìn)行這些單基因遺傳病的產(chǎn)前診斷是防止患兒出生的強(qiáng)有力的手段。

單基因病的檢測(cè)方法很多，產(chǎn)前基因診斷存在高風(fēng)險(xiǎn)性、時(shí)間緊迫性等缺點(diǎn)，因此準(zhǔn)確、高效的一線(xiàn)檢測(cè)手段迫切需要。導(dǎo)致單基因病發(fā)生的主要原因有基因的缺失、重復(fù)、點(diǎn)突變等，因此，在臨床檢測(cè)中需要根據(jù)不同單基因病的基因突變類(lèi)型，建立可靠高效的方法。通過(guò)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)［3-5］，SMN1第7、8號(hào)外顯子在98.6%的SMA患者中有純合缺失或截?cái)?，是兒童型SMA發(fā)病的主要原因；而PAH基因的突變是導(dǎo)致苯丙酮尿癥（PKU）發(fā)生的主要致病基因；先天性軟骨發(fā)育不全的致病基因FGFR3存在一個(gè)突變熱區(qū)是FGFR3基因第10號(hào)外顯子的1138位核苷酸。根據(jù)這3種不同的基因突變類(lèi)型，本研究分別應(yīng)用DHPLC技術(shù)和直接測(cè)序法對(duì)具有脊髓性肌萎縮癥、苯丙酮尿癥和先天性軟骨發(fā)育不全患者家庭中孕婦絨毛或者羊水樣本進(jìn)行產(chǎn)前分子診斷，以期達(dá)到避免SMA、PKU和ACH患兒出生的目的。

1 材料與方法

1.1 基本資料

1.1.1 孕10周，第二胎，已育1男孩，8月時(shí)表現(xiàn)為四肢肌力，肌張力較差，不能活動(dòng)，勉強(qiáng)可以坐。

1.1.2 孕21周，第二胎，已育1男孩，臨床診斷為苯丙酮尿癥。

1.1.3 孕18周，第一胎，孕婦為軟骨發(fā)育不全患者。

1.2 方法

1.2.1 樣本的采集 外周血采集：用一次性無(wú)菌注射器取受試者靜脈血4 ml，于紫色收集管（EDTA抗凝）內(nèi)，4℃保存?zhèn)溆?。胎兒樣本的采集：孕婦排空膀胱，平臥位，無(wú)菌消毒條件下，在B超定位下經(jīng)腹部行絨毛或者羊水穿刺術(shù)，采集胎兒樣本。

1.2.2 DNA提取 采用天根公司全血DNA提取試劑盒提取絨毛、羊水和外周血DNA，采用分光光度計(jì)和0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA濃度檢測(cè)，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 基因檢測(cè)方法

1.2.3.1 脊髓性肌萎縮癥的基因檢測(cè)［6］PCR反應(yīng)液體系：2μl d NTP（0.25 m M），1μl引物（F-R）（10p），0.5μl Mg（0.25 m M），0.18μl Qiagen熱啟動(dòng)Taq E（5U／μl），1μlDNA模板，其余用dd H2O補(bǔ)足到5μl。正向引物SMN1 F：5′-TGTCTTGTGAAACAAAATGCT-3′；反向引物SMN1 R：5′-AAAAGTCTGCTGGTCTGCCTA-3′。

SMN1基因外顯子7缺失篩查PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃10分鐘；變性95℃15秒；退火60℃60秒，延伸60℃60秒（循環(huán)40次）；最后延伸60℃10分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)后，以正常個(gè)體的樣本為參照，取PCR產(chǎn)物5μl，先采用美國(guó)環(huán)球基因公司DHPLC分析儀對(duì)SMN1基因外顯子7缺失篩查，分析柱溫度為54℃，片段長(zhǎng)度426bp，自動(dòng)加樣，洗脫，檢測(cè)SMN1外顯子缺失和基因拷貝數(shù)檢測(cè)。DHPLC峰值可通過(guò)WAVE MAKER軟件自動(dòng)測(cè)量每個(gè)外顯子產(chǎn)物峰的高度。計(jì)算公式［（樣本組求出檢測(cè)峰／參照峰）÷（正常對(duì)照組求出檢測(cè)峰／參照）］校正后比值后約等于1.0，則檢測(cè)的基因外顯子正常（雙拷貝）；如得到的數(shù)值約等于0.5，則顯示檢測(cè)的基因外顯子存在雜合性缺失；如得到的數(shù)值大于2.0，則顯示檢測(cè)的基因外顯子拷貝數(shù)存在異常重復(fù)。

1.2.3.2 苯丙酮尿癥檢測(cè)［7］設(shè)計(jì)苯丙酮尿癥的致病基因PAH基因的外顯子及其側(cè)翼序列的引物，PAH基因檢測(cè)PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃5分鐘；變性95℃35秒；退火56℃35秒，延伸72℃35秒（循環(huán)29次）；最后延伸72℃10分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工直接測(cè)序。

1.2.3.3 先天性軟骨發(fā)育不全的檢測(cè)過(guò)程 FGFR3基因外顯子10引物序列參考文獻(xiàn)［8］，由上海生工公司合成，PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃5分鐘；變性95℃30秒；退火61℃30秒，延伸72℃30秒（循環(huán)32次）；最后延伸72℃10分鐘。

2 結(jié) 果

經(jīng)DHPLC技術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者SMN1基因exon7純合缺失，拷貝數(shù)為0，其父母親均為SMA致病基因攜帶者，SMN1基因的exon7拷貝數(shù)為1，可推測(cè)出患者的致病基因分別遺傳自父親和母親。明確突變位點(diǎn)后，對(duì)胎兒絨毛組織進(jìn)行檢測(cè)，STR遺傳位點(diǎn)分析顯示無(wú)母體細(xì)胞污染。胎兒的SMN1基因第7外顯子未見(jiàn)缺失，拷貝數(shù)為2，根據(jù)SMN基因缺失頻率分析表明胎兒90%以上是正常兒，建議其繼續(xù)妊娠，胎兒已經(jīng)出生，發(fā)育正常，取外周血重復(fù)診斷，結(jié)果與產(chǎn)前診斷結(jié)果一致（圖1）。

圖1 脊髓性肌萎縮癥家系產(chǎn)前基因診斷

對(duì)苯丙酮尿癥家系進(jìn)行PAH基因測(cè)序顯示：先證者在PAH基因上存在無(wú)義突變c.781C＞T（p.Arg261Ter）和錯(cuò)義突變c.842C＞T（p.Pro281Leu），均為雜合子。先證者父親在PAH基因上存在無(wú)義突變c.781C＞T（p.Arg261Ter），為雜合子；不存在錯(cuò)義突變c.842C＞T（p. Pro281Leu）。先證者母親在PAH基因上不存在無(wú)義突變c.781C＞T（p.Arg261Ter）；存在錯(cuò)義突變c.842C＞T（p.Pro281Leu），為雜合子。推測(cè)出患者的兩個(gè)突變分別來(lái)自父親和母親，為復(fù)合雜合突變類(lèi)型，經(jīng)相關(guān)文獻(xiàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該復(fù)合雜合突變類(lèi)型可能是導(dǎo)致患者發(fā)病的原因。對(duì)胎兒羊水細(xì)胞檢測(cè)顯示：胎兒羊水樣本在PAH基因上不存在無(wú)義突變c.781C＞T（p.Arg261Ter）；存在錯(cuò)義突變c.842C＞T（p.Pro281Leu），為雜合子，與患者母親的突變類(lèi)型一致，可以推測(cè)胎兒為攜帶者，不發(fā)病，可以繼續(xù)妊娠（圖2）。

圖2 苯丙酮尿癥家系產(chǎn)前基因診斷測(cè)序圖

軟骨發(fā)育不全患者經(jīng)基因測(cè)序：患者在FGFR3基因外顯子10發(fā)現(xiàn)1處序列異常，c.1138G＞A，導(dǎo)致編碼氨基酸改變Gly380Arg。檢測(cè)結(jié)果在人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索分析，c.1138G＞A（Gly380Arg）改變與軟骨發(fā)育不全密切相關(guān)。胎兒羊水樣本在FGFR3基因外顯子10未發(fā)現(xiàn)序列異常，STR遺傳位點(diǎn)分析顯示無(wú)母體細(xì)胞污染，其遺傳方式符合孟德?tīng)栠z傳定律（圖3）。建議其繼續(xù)妊娠，胎兒已出生，發(fā)育正常。

3 討 論

單基因病具有親代向子代遺傳傳遞的特性，患者一旦被診斷為遺傳性疾病，對(duì)家庭的打擊是巨大的，患者及其親屬常常難以接受和承認(rèn)患病的事實(shí)，該類(lèi)遺傳病只有通過(guò)產(chǎn)前診斷才能有效防止患兒出生。產(chǎn)前分子診斷主要針對(duì)有生育患兒風(fēng)險(xiǎn)夫婦的胎兒進(jìn)行診斷，通過(guò)分子診斷可對(duì)明確診斷為某種疾病的胎兒采取干預(yù)措施，如對(duì)目前尚無(wú)治愈可能的單基因病的胎兒可建議實(shí)施選擇性流產(chǎn)［9］。目前國(guó)內(nèi)外已實(shí)現(xiàn)多種取材方法（絨毛、羊水、臍血、母體外周血富集胎兒有核細(xì)胞）和多種分子學(xué)檢測(cè)手段（PCR-RFLP、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性、DNA測(cè)序、高效液相色譜等）結(jié)合，對(duì)單基因病進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷?；驒z測(cè)是單基因病產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，避免了產(chǎn)前超聲容易造成的誤診和不必要的治療性引產(chǎn)。

Migita等［10］認(rèn)為早期絨毛膜細(xì)胞易被母體組織細(xì)胞污染，在SMA家系產(chǎn)前診斷研究中，我們采用經(jīng)腹絨毛活檢術(shù)，獲取胎兒絨毛膜細(xì)胞進(jìn)行SMN1基因第7號(hào)外顯子的DHPLC方法檢測(cè)，同時(shí)以STR遺傳位點(diǎn)判斷是否存在母體細(xì)胞污染，可在早期進(jìn)行取材，安全性較高，結(jié)果準(zhǔn)確［11］。絨毛活檢在單基因病中具有重要的臨床價(jià)值，單基因病家庭可在孕早期選擇合適妊娠方式，若胎兒未檢測(cè)出突變位點(diǎn)，建議繼續(xù)妊娠，減輕家庭的心理負(fù)擔(dān)。若胎兒檢測(cè)出突變位點(diǎn)，且該單基因病無(wú)法治療，可建議其終止妊娠。若胎兒為攜帶者，建議其后代也應(yīng)進(jìn)行產(chǎn)前分子診斷，有效地避免患兒的出生。因此，妊娠早期采集絨毛進(jìn)行單基因病的分子學(xué)診斷可以達(dá)到早診斷、早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)的目的。

圖3 軟骨發(fā)育不全家系產(chǎn)前基因診斷測(cè)序圖

此外，羊膜腔穿刺已成為當(dāng)今世界最常用且安全可靠的產(chǎn)前診斷取材方法，本研究中我們分別對(duì)PKU家系孕18周和ACH家系孕24周羊水細(xì)胞進(jìn)行直接測(cè)序法檢測(cè)。在PKU家系中，患者在其PAH基因編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)1個(gè)無(wú)義突變c.781C＞T（p.Arg261Ter），為雜合子，該突變?cè)斐蒔AH氨基酸編碼提前終止，很可能影響其蛋白功能。已有該位點(diǎn)致病性的相關(guān)報(bào)道，且其在人群中發(fā)生頻率極低［12，13］。在其PAH基因編碼區(qū)還發(fā)現(xiàn)1個(gè)錯(cuò)義突變c.842C＞T（p.Pro281Leu），為雜合子，經(jīng)SIFT和Polyphen對(duì)其進(jìn)行蛋白功能預(yù)測(cè)，結(jié)果均顯示為有害。已有該位點(diǎn)致病性的相關(guān)報(bào)道，且其在人群中發(fā)生頻率極低［14］。而在胎兒羊水細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)PAH基因上的無(wú)義突變c.781C＞T（p.Arg261Ter）和錯(cuò)義突變c.842C＞T（p.Pro281Leu），胎兒為攜帶者。在ACH家系中，ACH患者胎兒羊水樣本在FGFR3基因外顯子10未發(fā)現(xiàn)序列異常，未遺傳到母親突變位點(diǎn)c.1138G＞A（Gly380Arg），其母親的突變位點(diǎn)是與目前的研究報(bào)道相一致的，99%的ACH是由于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3基因（FGFR3）第l0外顯子發(fā)生G1138A（98%）或G1138C（1%）突變，導(dǎo)致跨膜區(qū)第380位密碼子甘氨酸被精氨酸取代［15］。從以上研究結(jié)果可以看出，苯丙酮尿癥和先天性軟骨發(fā)育不全以點(diǎn)突變?yōu)橹饕蛔冃问?，并可?jiàn)到明顯的突變熱點(diǎn)，而脊髓性肌萎縮癥98.6%的患者存在SMN1基因純合缺失，這些突變基因譜提示不同的單基因遺傳病致病基因的突變特點(diǎn)是不同的，某些致病基因在一個(gè)種族人群中的突變性質(zhì)、分布、熱點(diǎn)及其與其他民族地區(qū)的差異，對(duì)遺傳病診斷、遺傳咨詢(xún)和建立有效的基因診斷程序是非常重要的。在臨床檢測(cè)中，對(duì)于基因拷貝數(shù)發(fā)生變化的單基因病，可應(yīng)用DHPLC技術(shù)具有較高的靈敏度和特異度，而點(diǎn)突變的檢測(cè)采用直接測(cè)序法方法簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠。

總之，根據(jù)不同單基因病的突變特點(diǎn)，應(yīng)用DHPLC技術(shù)以及直接測(cè)序法對(duì)其進(jìn)行分析，可快速、準(zhǔn)確做出判斷，基因診斷已成為有效的診斷性檢查，且在孕早期絨毛活檢，孕中期羊膜腔穿刺以及孕晚期臍帶血采集這些為單基因病產(chǎn)前診斷提供了安全，有效的保證，值得臨床推廣應(yīng)用。

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ObjectiveTo investigate methods for prenatal diagnosis of spinal muscular atrophy（SMA），PKU and achondroplasia（ACH）.MethodDifferent test methods are applied based on different mutational pattern.The chorionic villus of 1 fetus with SMA positive family history was collected.The exon 7 of telomeric survial motor neuron（SMN1）gene was detected by DHPLC.Normal member and SMA patient were selected as controls.The hot mutation in exon 10 of FGFR3 gene and PAH gene were detected by DNA sequencing in patients，normal phenotype individuals and pregnancy fetus.Results‘Homozygous deletion of the SMN1 exon7 wasn′t detected in pregnancy fetus.The pedigree diagnosed as negative continued to pregnancy，and gave birth to a normal baby.c.781C＞T（p.Arg261Ter）and c.842C＞T（p.Pro281Leu）mutations of PAH gene were detected in patient with PKU positive family history.Fortunately，Sequencing analysis revealed the fetus shows the mutation of PAH gene as same as his mother c.842C＞T（p.Pro281Leu）.The pedigree diagnosed as carrier continued to pregnancy.The mother of the fetus diagnosed as achondroplasia had G1138A mutation，but the fetus had normal nucleotide at nucleotide 1138 in exton 10 of FGFR3，therefore were excluded from achondroplasia.ConclusionsThe application of different test methods is efficient and practical ways in different monogenic disease.

monogenic disease；prenatal molecular diagnosis；spinal muscular atrophy；PKU；achondroplasia

R714.55

A

2014-06-10）

編輯：鄒剛

10.13470／j.cnki.cjpd.2014.04.011

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程（2012KTCL03-09）

*通訊作者：張建芳，E-mail：zhangjf＠fmmu.edu.cn