仝建業(yè)，閆洪超

(1徐州醫(yī)學院研究生院，江蘇徐州221002;2徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

WWOX基因是一種抑癌基因［1］。研究證實，WWOX基因突變或缺失與胰腺癌、乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預后密切相關，通過改變WWOX基因的表達可以調節(jié)腫瘤生長［2～4］。Cyclin D1基因是細胞增殖調控的關鍵蛋白，是一種癌基因。在G1期，當Cyclin D1與細胞周期素依賴性激酶(CDK4)結合后，可以激活后者的磷酸酶活性，使腫瘤抑制蛋白Rb發(fā)生磷酸化，促進腫瘤發(fā)生。我們將外源性WWOX基因轉染到人卵巢癌干細胞中，研究其對Cyclin D1、CDK4蛋白的影響，探討治療卵巢癌的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料 卵巢癌干細胞由本課題組篩選并保存［5］，pcDNA3.1-WWOX 真核表達載體由本課題組構建并保存［6］，pcDNA3.1空質粒由徐州醫(yī)學院分子生物學研究中心胡書群老師惠贈，脂質體LipofectamineTM2000轉染試劑盒、G418購自 Invitrogen公司，WWOX、Cyclin D1和CDK4一抗及二抗均由Chemicon公司提供，碘化丙啶(PI)細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人卵巢癌干細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 基因轉染 按 LipofectamineTM2000說明書將pcDNA3.1-WWOX及pcDNA3.1空質粒分別轉染對數生長期的卵巢癌干細胞，以600μg/mL新霉素衍生物G418維持篩選，挑選陽性細胞克隆，擴增培養(yǎng)。分別將成功轉染pcDNA3.1-WWOX和pcDNA3.1質粒的干細胞組命名為 pcDNA3.1-WWOX重組質粒組、空質粒組，以未轉染的卵巢癌干細胞作為未轉染組。

1.3 檢測指標

1.3.1 WWOX蛋白表達 采用Western blot法。常規(guī)提取pcDNA3.1-WWOX重組質粒組、空質粒組及對照組細胞總蛋白，參照BCA法說明書測定蛋白濃度。以10%凝膠進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠泳(SDSPAGE)、轉膜、WWOX單克隆抗體結合，再用堿性磷酸酶結合的二抗結合，增強化學發(fā)光法(ECL)顯色后照相，觀察各組細胞WWOX蛋白表達情況。

1.3.2 細胞周期分布 采用流式細胞儀分析。將對數生長期的三組細胞分別用0.25%胰蛋白酶消化，按3×105/孔細胞在6孔板上接種細胞，分別在細胞接種后48 h收集上述各組細胞，各約1×106個細胞，加入終濃度70%冷乙醇，4℃固定24 h，PBS洗滌離心三遍，加入Rnase A(1 mg/mL)于37℃水浴30 min，再加25 mg/mL的PI染色，4℃避光30 min，經尼龍網過濾后，流式細胞儀檢測各組細胞周期分布情況，計算各組G0/G1期、S期、G2/M期細胞所占百分數。

1.3.3 Cyclin D1及CDK4蛋白表達 采用Western blot法。常規(guī)提取pcDNA3.1-WWOX重組質粒組、空質粒組及對照組細胞總蛋白，參照BCA法說明書測定蛋白濃度。以10%凝膠進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠泳(SDS-PAGE)、轉膜、Cyclin D1及CDK4單克隆抗體結合，再用堿性磷酸酶結合的二抗結合，增強化學發(fā)光法(ECL)顯色后照相，觀察各組細胞Cyclin D1及CDK4蛋白表達情況。

2 結果

2.1 WWOX蛋白表達 重組質粒組WWOX蛋白呈高表達，而空質粒組及未轉染組未檢測到WWOX蛋白的表達，見圖1。

圖1 各組細胞WWOX蛋白的表達

2.2 細胞周期分布 未轉染組、空質粒組、重組質粒組G0/G1期細胞所占百分數分別為33.69% ±1.28%、33.87% ± 0.84%、64.47% ± 0.60%，重組質粒組G0/G1期細胞百分比高于空質粒組及未轉染組(P＜0.01)。未轉染組、空質粒組、重組質粒組S期細胞所占百分數分別為 58.47% ±0.71%、58.03% ±0.72%、27.52% ±0.60%，重組質粒組 S期細胞所占百分數低于空質粒組及未轉染組(P＜0.01)。未轉染組、空質粒組、重組質粒組G2/M期細胞所占百分數分別為7.67% ±0.58%、8.0% ±0.00%、8.00% ±0.00%，重組質粒組 G2/M 期細胞所占比例低于空質粒組及未轉染組(P＜0.01)。

2.3 Cyclin D1及CDK4蛋白表達 未轉染組、空質粒組、重組質粒組Cyclin D1蛋白表達水平分別為1.601 ±0.028、1.607 ±0.045、1.068 ±0.057，重組質粒組Cyclin D1蛋白表達水平高于其他兩組(P＜0.05)。未轉染組、空質粒組、重組質粒組CDK4蛋白表達水平分別為 2.795 ±0.012、2.744 ±0.031、1.296±0.016，重組質粒組 CDK4蛋白表達水平高于其他兩組(P ＜0.05)。

3 討論

WWOX基因約1 Mb大小，cDNA全長2 264個堿基。WWOX基因在多種惡性腫瘤組織中表達異常，可能是一個廣譜的抑癌基因。研究表明WWOX基因在惡性腫瘤尤其是性激素依賴性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［7～9］。Gourley 等［10］研究發(fā)現卵巢癌組織中 WWOX mRNA的表達降低，提示WWOX基因能夠抑制卵巢腫瘤的發(fā)生。

Cyclin D1基因由295個氨基酸組成，分子量為34 kD，是細胞增殖調控的關鍵蛋白，與腫瘤發(fā)生密切相關，被認為是一種癌基因。在G1期，當Cyclin D1與CDK4結合后，可以激活后者的磷酸酶活性，使腫瘤抑制蛋白Rb發(fā)生磷酸化。高磷酸化的Rb蛋白因構象改變而與轉錄因子E2F分離，E2F被釋放而發(fā)揮其轉錄因子的效應，促進與DNA合成有關的基因轉錄，促使細胞由G1期進入S期，從而促進細胞周期。Brown等［11］認為Cyclin D1表達可作為細胞增殖的標志，且表達量增加與卵巢癌的惡性行為與復發(fā)有關。

2000年，Weissman等［12］在干細胞的理論的基礎上首次提出"腫瘤干細胞學說"。該學說認為腫瘤是一種干細胞疾病，腫瘤干細胞是一類能夠導致腫瘤發(fā)生的具有自我更新能力的細胞，能夠進行無限增殖和多向分化，被認為是腫瘤發(fā)生、異常增殖、侵襲、轉移、耐藥以及復發(fā)的根源［13］。Bapat等［14］通過對卵巢癌患者腹水中腫瘤細胞的研究發(fā)現了一些能懸浮生長的球體細胞，這些球體細胞在體外培養(yǎng)中具有極強的克隆能力，能夠自我更新，并且將這些球體細胞接種于裸鼠后能夠在裸鼠體內自我更新并分化成相同性質的腫瘤。證實卵巢癌中有卵巢腫瘤干細胞的存在，是卵巢癌治療的一個潛在的靶點。為進一步深入研究卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程，本課題組以人HO8910細胞(人卵巢低分化漿液性囊腺癌細胞株)為基礎，采用紫杉醇結合無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)法，并通過體內及體外實驗成功的篩選出具有陽性表達特征的卵巢癌干細胞，并對其特異性標記物及生物學特性進行了鑒定［5］，為我們下一步的研究打下了堅實的基礎。

本研究以pcDNA3.1-WWOX為表達載體，采用細胞轉染技術，獲得穩(wěn)定高表達WWOX基因的卵巢癌干細胞重組質粒組，發(fā)現重組質粒組的Cyclin D1和CDK4表達明顯降低，提示WWOX基因參與了Cyclin D1、CDK4的代謝，且重組質粒組細胞被顯著抑制在G0/G1期，其機制可能與WWOX基因下調Cyclin D1、CDK4的表達有關。

綜上所述，WWOX基因是與人卵巢癌發(fā)生和發(fā)展密切相關的一種抑癌基因，將其導入到人卵巢癌干細胞系中可明顯抑制卵巢癌干細胞的生長增殖，為卵巢癌的基因治療提供了依據。

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