孔高飛，金 敏，朱蓮蓮，林高強(qiáng)，劉小川

（浙江理工大學(xué)生物工程研究所，杭州310018）

一種短小芽孢桿菌分離鑒定及培養(yǎng)條件研究

孔高飛，金 敏，朱蓮蓮，林高強(qiáng)，劉小川

（浙江理工大學(xué)生物工程研究所，杭州310018）

為實(shí)施城市垃圾滲透液的生物無(wú)害化處理，分離、篩選、鑒定，獲得特定菌株，并對(duì)其最適培養(yǎng)條件和最佳培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化。從城市垃圾填埋場(chǎng)垃圾滲透液中分離芽孢桿菌，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)鑒定目的菌株。此菌細(xì)胞呈現(xiàn)桿狀，革蘭氏陽(yáng)性，經(jīng)鑒定為短小芽孢桿菌。采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)菌株生長(zhǎng)適宜的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的培養(yǎng)基主要成分為：玉米淀粉0.1%，酵母提取物1.0%，小牛浸膏0.3%，NaCl 0.5%，MgSO4·7H2O 0.49%。在這種條件下，菌株培養(yǎng)10 h，其OD320由1.44上升到6.93，為該菌株的深入研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

垃圾滲透液；短小芽孢桿菌；鑒定；培養(yǎng)條件優(yōu)化

0 引 言

隨著社會(huì)的高速發(fā)展，越來(lái)越多的廢棄物被排放到環(huán)境中，有些化合物含有劇毒，有致癌的作用，且很難自然降解。這些有害的物質(zhì)隨著垃圾滲透液，對(duì)周圍地下水和土壤造成了嚴(yán)重的污染。治理環(huán)境污染已經(jīng)成為世界各國(guó)努力攻克的難題?？茖W(xué)家們采用化學(xué)、物理方法結(jié)合生物方法來(lái)處理污染物，其中微生物方法治理環(huán)境有明顯的優(yōu)勢(shì)。但是由于人們?nèi)粘Ｉ钪谢旧喜粚?duì)垃圾進(jìn)行分類，導(dǎo)致了生活垃圾滲透液中金屬離子含量很高，一些降解垃圾的菌株抗性差，處理垃圾效果不明顯。因此亟待開(kāi)發(fā)出一種高表達(dá)的、抗性強(qiáng)的，且能夠降解垃圾滲透液的優(yōu)良菌株。已經(jīng)有研究報(bào)道短小芽孢桿菌（BaciLLus pumiLus）對(duì)降解垃圾有很好的效果［1］，且短小芽孢桿菌由于繁殖速度快，能產(chǎn)生穩(wěn)定的芽孢，抗逆能力強(qiáng)，成為了越來(lái)越受矚目的生防材料之一。

短小芽孢桿菌為芽孢桿菌屬的一種，顯微鏡下觀察營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞為桿狀，革蘭氏反應(yīng)陽(yáng)性［2］，能運(yùn)動(dòng)。菌落形態(tài)有半透明狀和不透明狀兩種［3］。短小芽孢桿菌能夠分泌活性很強(qiáng)的纖維素酶、脂肪酶［4］、木聚糖酶［5］和果膠裂解酶［6］等，有利于降解大分子物質(zhì)。還可以產(chǎn)生抗菌素及抗菌蛋白等拮抗性物質(zhì)［7］，抑菌范圍廣［8］，對(duì)多種病原菌都有抑制作用［9］。產(chǎn)生的聚-γ-谷氨酸可用于降解塑料［10］。黃慶［11］從成都市垃圾中分離得到一株短小芽孢桿菌能夠產(chǎn)生脫毛蛋白酶，利用該蛋白酶采用酶法脫毛技術(shù)應(yīng)用在皮革工業(yè)中，對(duì)解決皮革的環(huán)境污染問(wèn)題有著重要的意義。Fakhfakh等［12］也報(bào)道了短小芽孢桿菌A1菌株能降解羊毛廢棄物。短小芽孢桿菌發(fā)酵所產(chǎn)生的蛋白酶組成洗滌劑去污效果好［13］，提高了洗滌劑的利用率。Panbangred等［14］報(bào)道短小芽孢桿菌產(chǎn)生的木聚糖酶具有良好的耐堿性，能夠進(jìn)行生物漂白，可以降低有機(jī)氯化物，減少環(huán)境污染。Geetha等［15］通過(guò)優(yōu)化含有農(nóng)業(yè)廢棄物的培養(yǎng)基，提高了短小芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)廢棄物中產(chǎn)木聚糖酶的水平，降低了生產(chǎn)木聚糖酶的成本，又利用了廢棄物，減少污染。游春平等［16］分離得到的短小芽孢桿菌對(duì)稻瘟病菌有一定的抑制作用。Akhtar［17］在治療鷹嘴豆根腐病時(shí)，采用短小芽孢桿菌制劑獲得了很好的防治效果。張蕾［18］篩選到一株短小芽孢桿菌TY079，對(duì)黃瓜枯萎病、棉花黃萎病具有顯著的抑制作用。

由此可以看出短小芽孢桿菌在環(huán)境治理、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都有廣闊的應(yīng)用前景。本文致力于從城市生活垃圾填埋場(chǎng)滲透液中分離得到一株短小芽孢桿菌，研究其最適培養(yǎng)基和最佳培養(yǎng)條件，使培養(yǎng)基的各組分之間保持平衡，得到菌株的最適生長(zhǎng)環(huán)境，可以降低培養(yǎng)成本提高產(chǎn)率，為該菌株的工業(yè)和城市垃圾滲透液處理應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

由某地城市垃圾填埋場(chǎng)滲透液中分離篩選所得。

1.1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（NA培養(yǎng)基）

牛肉膏0.3%，蛋白胨0.5%，葡萄糖0.25%，NaCl 0.5%，用NaOH調(diào)p H至7.2，121℃高壓滅菌20 min。固體培養(yǎng)基向其中加1.6%的瓊脂。

1.1.3 主要試劑

溶菌酶、蛋白酶K、r Taq酶、CTAB、牛肉膏、KNO3、NH4NO3、蛋白胨、酵母提取物、NaCl、葡萄糖、蔗糖、MgSO4·7H2O、玉米淀粉、紅薯淀粉、Zn-SO4·7H2O、馬鈴薯淀粉、小麥淀粉和KH2PO4+ K2HPO4（1∶1）復(fù)合鹽。

1.1.4 儀器設(shè)備

NANODROP 2000分光光度計(jì)（Thermo SCIFNTIFIC）、SynGene凝膠成像系統(tǒng)（Syngene）、PCR儀（S1000 Thermal Cycler）、連續(xù)光譜酶標(biāo)儀（Molecu Lar Devices公司）、電泳儀（BIO-RAD）。

1.2 方法

1.2.1 短小芽孢桿菌的鑒定

1.2.1.1 形態(tài)鑒定

采集某地城市生活垃圾填埋場(chǎng)滲透液，對(duì)滲透液中的細(xì)菌進(jìn)行富集培養(yǎng)。將富集培養(yǎng)的菌液在NA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行稀釋涂布分離培養(yǎng)。觀察菌株的菌落形態(tài)，挑取可疑菌落，培養(yǎng)24 h并染色，在顯微鏡下觀察，依據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［19］初步認(rèn)定是芽孢桿菌者，進(jìn)行單菌分離富集培養(yǎng)。

1.2.1.2 特異性PCR分析鑒定

采用直接PCR擴(kuò)增菌種DNA檢測(cè)技術(shù)。直接PCR技術(shù)是只針對(duì)細(xì)菌的16S rRNA基因堿基序列中的特異序列的部分進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)出幾對(duì)特異性引物，PCR擴(kuò)增16S rRNA基因的特異性片段，通過(guò)分析擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，根據(jù)目的條帶的大小來(lái)判斷所得到的條帶是否為目的條帶。將分離得到的菌株接種于NA培養(yǎng)基，37℃，220 r/min培養(yǎng)10 h。采用改進(jìn)的CTAB法提取菌株的總基因組。通過(guò)對(duì)短小芽孢桿菌16S rRNA堿基序列及gyrA、rpoA基因序列的分析，設(shè)計(jì)出6對(duì)特異性引物（表1），通過(guò)對(duì)菌株的總基因組進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增反應(yīng)，分析其電泳結(jié)果圖，進(jìn)一步從分子水平來(lái)鑒定分離得到的菌株是否為短小芽孢桿菌。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃40 s，61.7℃40 s，72℃45 s，循環(huán)33次；72℃延伸10 min。

表1 特異性PCR引物

1.2.2 短小芽孢桿菌的培養(yǎng)方法

1.2.2.1 菌種活化

將分離得到的短小芽孢桿菌菌株轉(zhuǎn)接到NA固體培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)12 h，備用。

1.2.2.2 種子液的制備

挑取單菌落，接入裝量為20 mL NA培養(yǎng)基的100 mL三角搖瓶中，置于控溫?fù)u床，37℃，220 r/ min培養(yǎng)12 h，備用。

1.2.3 短小芽孢桿菌培養(yǎng)基的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 碳源種類及濃度對(duì)短小芽孢桿菌生長(zhǎng)的

影響

以NA培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、馬鈴薯淀粉、小麥淀粉、紅薯淀粉和玉米淀粉作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳源，其他組分不變。采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件，10 h后，采用酶標(biāo)儀，測(cè)定菌液的OD320，以確定培養(yǎng)基的最佳碳源。確定最佳碳源之后，改變基礎(chǔ)培養(yǎng)基中最佳碳源的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其他組分不變，來(lái)進(jìn)一步研究不同濃度的碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響（每次處理重復(fù)3次，以下所有處理均重復(fù)3次）。

1.2.3.2 氮源種類及濃度對(duì)短小芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

以NA培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用有機(jī)氮源蛋白胨、酵母提取物和無(wú)機(jī)氮源KNO3、NH4NO3作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的氮源，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的其他組分不變，采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件，10 h后，采用酶標(biāo)儀測(cè)定菌液的OD320，以確定培養(yǎng)基的最佳氮源。確定最佳氮源之后，通過(guò)改變最佳氮源的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，來(lái)進(jìn)一步研究不同濃度的氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響。

1.2.3.3 無(wú)機(jī)鹽離子對(duì)短小芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

分別用0.5%的NaCl、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O和KH2PO4+K2HPO4（1∶1）復(fù)合鹽作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽，以不加無(wú)機(jī)鹽的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照，采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件，10 h后，采用酶標(biāo)儀測(cè)定菌液的OD320，以確定最佳無(wú)機(jī)鹽。確定最佳無(wú)機(jī)鹽之后，通過(guò)改變最佳無(wú)機(jī)鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，來(lái)進(jìn)一步研究不同濃度無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，確定了短小芽孢桿菌生長(zhǎng)所需碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽的零水平。將篩選出的最佳碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽3個(gè)重要因素，選用3因素3水平L9（33）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以尋求培養(yǎng)基中各組分的最佳配比。

1.2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定培養(yǎng)基各組分的最佳配比。采用最適培養(yǎng)基配方進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，逐一優(yōu)化初始p H和溫度。

1.2.6 生物量測(cè)定方法

按3%的接種量將種子液接入裝量為20 mL NA培養(yǎng)基的100 mL三角搖瓶中，37℃，220 r/min培養(yǎng)10 h。以接種前培養(yǎng)基為空白對(duì)照，采用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為320 nm處的菌液的OD值。（預(yù)實(shí)驗(yàn)：對(duì)篩選得到的短小芽孢桿菌的發(fā)酵液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，在OD320處有最大吸收峰，因此測(cè)定采用波長(zhǎng)320 nm處的OD值。）

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

由于滲透液中菌株很多，對(duì)滲透液進(jìn)行80℃處理20 min，可以殺死一些不耐高溫的微生物，快速得到芽孢桿菌。菌落形態(tài)分為半透明和不透明兩種狀態(tài)：不透明的為乳白色，圓形，邊緣整齊有規(guī)則，表面濕潤(rùn)，光滑，菌落向外凸出生長(zhǎng)；半透明的菌落，較少存在，乳黃色，濕潤(rùn)，光學(xué)顯微鏡下觀察，菌體為短桿狀，無(wú)莢膜，多數(shù)是單獨(dú)存在，部分成鏈排列（圖1），革蘭氏反應(yīng)呈陽(yáng)性。

圖1 菌株在油鏡下的形態(tài)（×1 000）

在初步鑒定為芽孢桿菌的基礎(chǔ)上，采用特異性PCR分析鑒定。分析特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖（圖2），可以得出該株革蘭氏陽(yáng)性菌為短小芽孢桿菌。即使PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了近緣菌種的DNA片段，但其長(zhǎng)度也是與短小芽孢桿菌有差別的［20］。因此通過(guò)這種方法可以方便、快捷地分析檢測(cè)出短小芽孢桿菌，可省略進(jìn)行16S rRNA基因序列的測(cè)序以及數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析的步驟。

圖2 菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 短小芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 影響菌種生長(zhǎng)的最佳碳源及濃度

NA培養(yǎng)基作為單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以0.25%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、馬鈴薯淀粉、小麥淀粉、紅薯淀粉和玉米淀粉作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳源，發(fā)酵培養(yǎng)10 h后，采用酶標(biāo)儀，測(cè)定菌液的OD320。由圖3可知，短小芽孢桿菌生長(zhǎng)的最佳碳源是玉米淀粉，其次是紅薯淀粉，故選用活性最高的玉米淀粉為最佳碳源。

將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的其他成分固定為蛋白胨0.5%，小牛浸膏0.3%，NaCl 0.5%，最優(yōu)碳源玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別固定為0.1%、0.2%、0.4%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，10 h后，采用酶標(biāo)儀，測(cè)定OD320。由圖4可知，玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%時(shí)，菌體生長(zhǎng)量最大，為最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖3 碳源種類對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

圖4 玉米淀粉濃度對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

2.2.2 影響菌種生長(zhǎng)的最佳氮源及濃度

NA培養(yǎng)基作為單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將0.5%蛋白胨、酵母提取物、KNO3和NH4NO3作為氮源，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的其他成分不變，接種培養(yǎng)10 h后，采用酶標(biāo)儀，測(cè)定OD320。由圖5可知，短小芽孢桿菌對(duì)有機(jī)氮源的利用能力比無(wú)機(jī)氮源高。因?yàn)橛袡C(jī)氮源成分豐富，不僅提供了氮源，還包含有碳源和少量的無(wú)機(jī)鹽，而無(wú)機(jī)氮源成分相對(duì)單一。酵母提取物作為氮源明顯優(yōu)于其他氮源，因此選用酵母提取物作為最佳氮源。

將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的各組分固定在玉米淀粉0.1%，小牛浸膏0.3%，NaCl 0.5%，最佳氮源酵母提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.5%和2.0%，其他成分不變，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。10 h后，采用酶標(biāo)儀，測(cè)定OD320。由圖6可知，OD值隨酵母提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大先增大后減小。當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到1.0%時(shí)，OD值最大。因此選取1.0%為最佳酵母提取物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖5 氮源種類對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

圖6 酵母提取物濃度對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

2.2.3 影響菌種生長(zhǎng)的最佳無(wú)機(jī)鹽及濃度

基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的其他成分不變，分別用0.5%的NaCl、MgSO4·7H2O、KH2PO4+K2HPO4（1∶1）復(fù)合鹽和ZnSO4·7H2O作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽，以不加無(wú)機(jī)鹽的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照，采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件，10 h后，采用酶標(biāo)儀，測(cè)定菌液的OD320，結(jié)果如圖7所示。圖7顯示，鈉離子、鎂離子對(duì)短小芽孢桿菌的生長(zhǎng)都有促進(jìn)作用，鎂離子作用比較明顯，因此選用MgSO4·7H2O為最佳無(wú)機(jī)鹽。據(jù)報(bào)道磷酸鹽和鋅離子可以促進(jìn)芽孢桿菌的生長(zhǎng)，而這項(xiàng)研究表明磷酸鹽和鋅離子對(duì)菌體的生長(zhǎng)稍微抑制，這可能是因?yàn)殡x子濃度過(guò)高的關(guān)系。

將培養(yǎng)基中的其他成分固定在玉米淀粉0.1%，酵母提取物1.0%，NaCl 0.5%，小牛浸膏0.3%，MgSO4·7H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。10 h后，采用酶標(biāo)儀，測(cè)定OD320。由圖8可知，MgSO4·7H2O的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%，菌體的生長(zhǎng)量相對(duì)于其他濃度的生長(zhǎng)量處于較高水平。因此0.3%是MgSO4·7H2O的最優(yōu)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖7 無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

圖8 MgSO4·7H2O濃度對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

2.2.4 碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽的正交優(yōu)化

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定了最佳碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽，分別是玉米淀粉0.1%，酵母提取物1.0%，Mg-SO4·7H2O 0.3%。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)尋找培養(yǎng)基中的各組分之間的最佳配比。實(shí)驗(yàn)因素水平編碼及水平設(shè)置見(jiàn)表2。采用搖瓶培養(yǎng)條件，正交實(shí)驗(yàn)27個(gè)處理組合條件下菌種在發(fā)酵10 h時(shí)的OD320見(jiàn)表3，正交方差分析見(jiàn)表4。

由表3可知，最佳組合為A2B2C3，即玉米淀粉0.10%，酵母提取物1.00%，MgSO4·7H2O 0.49%。通過(guò)極差分析可知RB＞RA＞RC。各因素影響菌體生長(zhǎng)程度從大到小為酵母提取物、玉米淀粉、Mg-SO4·7H2O。由表4可知，玉米淀粉的F=7.915，P=0.112＞0.05，酵母提取物F=32.420，P= 0.030＜0.05，MgSO4·7H2O的F=6.156，P= 0.140＞0.05。表明酵母提取物對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響為顯著差異，玉米淀粉和MgSO4·7H2O為不顯著差異。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素和水平 %

表3 正交實(shí)驗(yàn)指標(biāo)結(jié)果

表4 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

由此得到最佳培養(yǎng)基組成為：玉米淀粉0.10%，酵母提取物1.00%，MgSO4·7H2O 0.49%，小牛浸膏0.30%，NaCl 0.50%。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 初始p H優(yōu)化

短小芽孢桿菌培養(yǎng)過(guò)程中的p H難以控制，通過(guò)控制發(fā)酵液的初始p H來(lái)尋找最適p H。將最佳培養(yǎng)基的初始p H分別調(diào)至3、4、5、6、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、9、10、11、12，在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10 h，采用酶標(biāo)儀，測(cè)菌液的OD320。

由圖9可知，短小芽孢桿菌在初始p H小于5和大于10的時(shí)候，生長(zhǎng)緩慢。在初始p H在6～9之間，OD值很高，說(shuō)明短小芽孢桿菌對(duì)p H的適應(yīng)性比較寬，在p H 6～9之間都能很好地生長(zhǎng)。初始p H為7.2的時(shí)候，菌種生長(zhǎng)最好，因此選用7.2為短小芽孢桿菌的最佳初始p H值。

圖9 初始p H對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

2.3.2 溫度優(yōu)化

溫度也是影響菌體生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素，能夠改變酶的反應(yīng)速率。溫度升高可以增大酶的反應(yīng)速率，促進(jìn)生長(zhǎng)代謝，但酶又會(huì)因?yàn)闇囟冗^(guò)高而失去活性。分別選取28、37、40、43、45、47、49℃和50℃作為搖床溫度，在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10 h，測(cè)菌液的OD320。

由圖10可知，短小芽孢桿菌在28～37℃均可良好生長(zhǎng)，說(shuō)明短小芽孢桿菌對(duì)溫度的適應(yīng)性也較寬，37℃時(shí)菌體生長(zhǎng)最好。高于45℃后，菌體生長(zhǎng)緩慢，OD值急劇下降，表明菌體生長(zhǎng)的最高臨界溫度為45～50℃。由此可以得出，短小芽孢桿菌生長(zhǎng)的最適溫度為37℃。

圖10 發(fā)酵溫度對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

3 討 論

隨著工業(yè)化進(jìn)程的推進(jìn)，科技日益發(fā)達(dá)，工業(yè)、農(nóng)業(yè)、日常生活等方方面面都面臨著廢棄物大量排放的問(wèn)題。廢棄物隨著降雨的沖刷，會(huì)造成土壤、水域的污染，導(dǎo)致了飲用水、食物都受到污染，嚴(yán)重威脅到我們?nèi)祟惖纳?。隨著人們的環(huán)保意識(shí)和健康意識(shí)增強(qiáng)，對(duì)環(huán)境、食品的安全要求越來(lái)越高。環(huán)境污染問(wèn)題成為當(dāng)前社會(huì)一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題。其中，城市垃圾滲透液的無(wú)害化處理一直是待攻克的難題，傳統(tǒng)治理垃圾滲透液的方法是采用化學(xué)物理方法來(lái)處理污染物，但是會(huì)對(duì)環(huán)境造成二次污染。近年來(lái)，針對(duì)不同的污染物采用不用的治理方法，其中微生物方法治理環(huán)境在生物方法中具有明顯的優(yōu)勢(shì)，微生物制劑也成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。其核心是獲得高表達(dá)的、適應(yīng)性廣的優(yōu)良菌種，其中短小芽孢桿菌由于繁殖速度快，能產(chǎn)生穩(wěn)定的芽孢，抗逆能力強(qiáng)，成為了越來(lái)越受矚目的生防材料之一。

傳統(tǒng)方法分離鑒定微生物，主要是通過(guò)選擇性培養(yǎng)微生物，在根據(jù)形態(tài)觀察做出初步鑒定，之后根據(jù)生理生化反應(yīng)再進(jìn)行系統(tǒng)的分類和鑒定。這種方法費(fèi)力耗時(shí)，忽略了微生物具有多樣性，且同一物種不同的菌株也可能有差異。對(duì)相近種也不能準(zhǔn)確鑒定。因此人們利用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法找到了一種快速鑒定菌種的方法，16S rRNA基因序列分析方法。

16SrRNA基因的結(jié)構(gòu)既具有保守性又具高變異性［21-22］，長(zhǎng)度大小適中，既有保守的基因片段，又含有不同菌種間變異的基因片段，因此采用16S rRNA基因序列分析鑒定短小芽孢桿菌。但是由于16SrRNA的進(jìn)化速度緩慢，非常保守，并不能很好地鑒定出相對(duì)近的菌種，因此在采用16SrRNA基因序列分析的同時(shí)，要采用一些生理生化反應(yīng)或者一些其他保守基因序列的分析來(lái)補(bǔ)充。比如可以選擇16S～23S rRNA基因序列和一些比較保守的功能基因序列分析。本實(shí)驗(yàn)首先要從垃圾滲透液中分離得到一株抗性強(qiáng)的短小芽孢桿菌，通過(guò)對(duì)短小芽孢桿菌16SrRNA堿基序列及gyrA、rpoA基因序列的分析，設(shè)計(jì)出6對(duì)特異性引物，通過(guò)對(duì)被初步鑒定為芽孢桿菌的菌株進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增反應(yīng)，分析其電泳結(jié)果圖，進(jìn)一步從分子水平來(lái)鑒定分離得到的菌株是否為短小芽孢桿菌。

短小芽孢桿菌的生長(zhǎng)受外部環(huán)境的影響，環(huán)境不適宜生長(zhǎng)的情況下，就會(huì)由營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)檠挎?，處于休眠狀態(tài)，不能高效快速生長(zhǎng)。碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽都會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)。因此需要篩選出滿足其生長(zhǎng)的最佳碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及最優(yōu)生長(zhǎng)條件。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定了短小芽孢桿菌最佳培養(yǎng)基的成分為：玉米淀粉，酵母提取物，MgSO4·7H2O。利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了短小芽孢桿菌的培養(yǎng)基，得到最適培養(yǎng)基為：玉米淀粉0.10%，酵母提取物1.00%，MgSO4·7H2O 0.49%，小牛浸膏0.30%，NaCl 0.50%。并通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)法確定了最佳培養(yǎng)條件，溫度37℃，初始p H 7.2。采用最優(yōu)培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10 h。測(cè)得OD320值由1.44增長(zhǎng)為6.93。生長(zhǎng)量提高了將近4.8倍。

在今后的研究中，將繼續(xù)優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程的培養(yǎng)條件，以及對(duì)該菌株進(jìn)行誘變，提高短小芽孢桿菌的產(chǎn)率。

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Research of IsoIation and Identification of BaciIIus PumiIus and Its CuIturing Conditions

KONGGao-fei，JIN Min，ZHU Lian-Lian，LIN Gao-qiang，LIU Xiao-chuan
（Bioengineering Institute，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China）

To implement harmless biological treatment of municipal waste penetrating fluid，this paper isolates，screens and identifies the specific strain and optimizes its optimal culturing conditions and culture medium components.The bacillus was isolated from waste penetrating fluid in municipal landfills.The target strain was identified through designing specific primers for PCR reaction.The bacterial cell presented rhabditiform and is Gram-positive.It was identified to be bacillus pumilus.Single factor experiment and orthogonal experiment were adopted to optimize the culture medium most suitable for bacterial strain. Optimized culture medium components include：corn starch 0.1%，yeast extract 1.0%，beef extract 0.3%，NaCl 0.5%，and MgSO4·7H2O 0.49%.Under such conditions，the OD320of the strain after 10 h culture rises to 6.93 from 1.44.This lays a foundation for in-depth study and application of the strain.

waste penetrating fluid；bacillus pumilus；identification；optimization of culturing conditions

Q938.1

A

（責(zé)任編輯：許惠兒）

1673-3851（2014）04-0467-07

2013-11-11

孔高飛（1988-），女，山西晉城人，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锃h(huán)境生態(tài)學(xué)。

劉小川，F(xiàn)-mail：xcliu@zstu.edu.cn