李玲，呂磊，董昕，呂狄亞，婁子洋(.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院分析測試中心，上海 00433;.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院藥材科，上海 00438)

·論著·

應(yīng)用RRLC-TOFMS技術(shù)快速鑒別中藥艾葉中的化學(xué)成分

李玲1，呂磊2，董昕1，呂狄亞1，婁子洋1(1.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院分析測試中心，上海 200433;2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院藥材科，上海 200438)

目的應(yīng)用快速液相色譜-高分辨飛行時間質(zhì)譜(RRLC-TOFMS)技術(shù)對中藥艾葉中化學(xué)成分進(jìn)行快速鑒別。方法色譜分離采用Agilent Eclipse C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8μm);流動相:乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫，A相隨時間的變化:5%～30%(0～12min)，30%～80%(12～25min)，80%(25～30min)，進(jìn)樣量1μl，流速0.35ml/min，柱溫40℃。TOFMS、電噴霧離子源(ESI)、正離子模式、質(zhì)量數(shù)掃描范圍m/z100～1500。結(jié)果 一次性鑒別出艾葉中31種化學(xué)成分。結(jié)論建立基于RRLC-TOFMS技術(shù)對艾葉中化學(xué)成分快速鑒別的方法，為中藥艾葉的質(zhì)量控制及體內(nèi)的深入研究奠定基礎(chǔ)。

快速液相色譜;艾葉;化學(xué)成分;飛行時間質(zhì)譜

艾葉為菊科植物艾Artemisia argyi(Levi.et)Vant的干燥葉，性溫，味苦、辛，在我國民間廣泛用于治療養(yǎng)病、食用充饑、辟邪驅(qū)毒［1］。《本草綱目》記載:艾葉具有溫經(jīng)活絡(luò)、驅(qū)寒止痛、美容養(yǎng)顏、延緩衰老的功能。艾葉的主要成分為揮發(fā)油，其次還含有黃酮類、甾醇類、多糖類、鞣質(zhì)、微量元素及其他成分，其主要藥理作用包括抗菌、抗病毒、平喘鎮(zhèn)咳、抗過敏、抗凝血、增強免疫能力、護(hù)肝利膽等［2，3］。目前關(guān)于艾葉化學(xué)成分研究的報道較多［4，5］，但多局限于采用GC或GC-MS技術(shù)對其揮發(fā)性成分的分析，對于其中的非揮發(fā)性成分研究較少?，F(xiàn)代藥理研究證明，藥材中所含各種化學(xué)成分具有不同的藥理作用［6］，確定艾葉色譜圖中各個色譜峰歸屬，對艾葉藥材的質(zhì)量控制及體內(nèi)的深入研究具有重要意義。

隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在中藥化學(xué)成分的分析鑒別中擔(dān)當(dāng)了越來越重要的角色。高分辨飛行時間質(zhì)譜(TOFMS)具有檢測靈敏度高、測定化合物離子范圍寬等優(yōu)點，可以在短時間獲得化合物的準(zhǔn)確相對分子質(zhì)量，通過比對已建立的已知化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，對被測成分進(jìn)行快速分析鑒別，相比傳統(tǒng)的中藥分離手段具有顯著的優(yōu)越性，現(xiàn)已廣泛用于中藥及復(fù)方化學(xué)成分的鑒別分析［7，8］。本研究首次采用RRLC-TOFMS聯(lián)用技術(shù)，對艾葉藥材中各化學(xué)成分進(jìn)行了快速分析和鑒別，為艾葉藥理作用的進(jìn)一步研究和資源的合理利用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 儀器Agilent Infinity1290系列快速液相色譜儀(美國安捷倫公司)，配有在線脫氣機、二元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱;Agilent 6538四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司)，配有標(biāo)準(zhǔn)電噴霧離子源(ESI)，分析軟件為MassHunter在線工作站和Qualiative Analysis離線分析軟件。Mettler AE240型十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒公司);Kudos-SK2200H超聲發(fā)生器(上?？茖?dǎo)超聲儀器公司)。

1.2 藥品與試劑綠原酸、金絲桃苷、木犀草素和槲皮素對照品均購自中國藥品生物制品檢定所(純度＞99.0%)，艾葉藥材購自上海雷允上大藥房(批號20110803)，經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室黃寶康副教授鑒定為菊科植物Artemisia argyi(Levi. et)Vant的干燥葉。乙腈和甲酸為色譜純(Fisher，USA)，水為純凈水，其余試劑均為分析純。

1.3 對照品溶液的制備精密稱取綠原酸、金絲桃苷、木犀草素和槲皮素對照品5.05、5.12、5.20及5. 07 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋定容，配成濃度分別為505、512、520和507μg/ml的混合母液，精密吸取母液1 ml置100 ml量瓶，加甲醇定容后，即得對照品混合溶液。

1.4 樣品溶液的制備精密稱取艾葉藥材粉末0.5 g，加70%乙醇20 ml置于50 ml具塞錐形瓶中，超聲60min，過濾，取續(xù)濾液，10 800 r/min離心10min，取上清液，即為樣品溶液。

1.5 色譜條件色譜柱:采用Agilent Eclipse C18柱(2.1mm×100mm，1.8μm)。流動相:乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫，A相隨時間的變化:5%～30%(0～12min)，30%～80%(12～25 min)，80%(25～30min);質(zhì)譜采集時間25 min。柱平衡時間5 min;進(jìn)樣量1μl;流速0.35ml/min;柱溫40℃。

1.6 質(zhì)譜條件采用ESI源，正離子模式，霧化氣為高純氮氣。具體質(zhì)譜參數(shù):毛細(xì)管電壓4 000 V，霧化氣壓力45psi，干燥氣流速11L/min，干燥氣溫度350℃，碎片電壓120V;質(zhì)量數(shù)掃描范圍m/z 100～1 500;參比離子m/z 121.050 8、m/z 922.009 7。測定樣品之前，使用調(diào)諧液校準(zhǔn)質(zhì)量軸，以保證質(zhì)量精度誤差＜1×10-6。

1.7 艾葉化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的建立根據(jù)國內(nèi)外專業(yè)數(shù)據(jù)庫Pubmed、Chem Spider、中國科學(xué)院化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫及國內(nèi)外相關(guān)研究文獻(xiàn)［9-13］，收集了艾葉各種化學(xué)成分名稱及分子式共82個。采用安捷倫Formula-database generator軟件(含各元素精確質(zhì)量數(shù))，根據(jù)各成分碳、氫、氧的個數(shù)，計算精確相對分子質(zhì)量，建立了包括化合物名稱、分子式、精確相對分子質(zhì)量、M+H和M+Na準(zhǔn)分子離子峰相對分子質(zhì)量的相應(yīng)化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件的優(yōu)化首先考察了提取方法，本實驗選擇操作較簡便的乙醇超聲提取法。分別考察了甲醇、無水乙醇、70%乙醇，發(fā)現(xiàn)采用70%的乙醇提取獲得的峰容量最大，故采用70%乙醇超聲為提取方法。對色譜條件的摸索考察了甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)在乙腈-水系統(tǒng)中基線穩(wěn)定，洗脫效果優(yōu)于甲醇-水系統(tǒng)，且各色譜峰分離效果更好，若加入0.1%甲酸可以提高質(zhì)譜響應(yīng)。故采用乙腈-水(0.1%甲酸)為流動相。

2.2 艾葉藥材TOFMS總離子流圖將艾葉樣品溶液進(jìn)樣分析，采集RRLC-TOFMS總離子流圖，如圖1所示。從圖中搜索出31個色譜峰的相對分子質(zhì)量與已知化合物的數(shù)據(jù)庫相符，大部分化合物在正離子模式下的質(zhì)譜圖顯示［M+H］+，［M+Na］+。

圖1 艾葉藥材TOFMS總離子流圖

2.3 利用對照品鑒別化合物實驗收集艾葉中4個相關(guān)化學(xué)成分對照品:綠原酸(chlorogenic acid)、金絲桃苷(hyperoside)、木犀草素(luteolin)和槲皮素(quercetin)，混標(biāo)進(jìn)樣后，結(jié)合文獻(xiàn)報道［14，15］，無偏差地鑒別出峰3、峰8、峰15和峰22，混合對照品的EIC圖見圖2。

圖2 艾葉混合對照品TOF/MS提取離子流圖

2.4 利用精確質(zhì)量數(shù)和同位數(shù)分布鑒別化合物以峰7蕓香苷(rutin)和峰24異澤蘭黃素(eupatilin)為例，說明艾葉乙醇提取物色譜峰的鑒別過程。峰7保留時間為7.22min，該峰的準(zhǔn)分子離子［M+H］+為611.161 1，［M+Na］+為633.141 9，利用Qualiative A-nalysis數(shù)據(jù)分析軟件的計算工具，比對自建的化合物數(shù)據(jù)庫中已知化合物的質(zhì)荷比，確定元素組成分別為C27H31O16和C27H30O16Na。計算C27H31O16和 C27H30O16Na的核素分布情況，與實際得到的質(zhì)譜圖信息進(jìn)行比對，從圖3(A1、A2)可知核素分布的實測值與理論值吻合良好，確定此峰為蕓香苷。同理可得，保留時間16.27min的24號峰為異澤蘭黃素，該峰的準(zhǔn)分子離子［M+H］+為345.097 9，［M+Na］+為367.079 4，其核素分布情況如圖3(B1、B2)所示。

圖3 蕓香苷(峰7)和異澤蘭黃素(峰24)的準(zhǔn)確質(zhì)量及核素分布圖

2.5 艾葉中化學(xué)成分的鑒別根據(jù)飛行時間質(zhì)譜測得的精確相對分子質(zhì)量，比對所建數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用Qualiative Analysis質(zhì)譜分析軟件計算分子組成，將實測值與理論值進(jìn)行比對(誤差＜3×10-6)，結(jié)合文獻(xiàn)［9-13］報道，對艾葉所得色譜圖上色譜峰進(jìn)行分析，初步鑒別出31個化學(xué)成分(表1)，對部分同分異構(gòu)體，后期可考慮調(diào)節(jié)碎片電壓獲得化合物的裂解規(guī)律以進(jìn)行進(jìn)一步區(qū)分。

表1 艾葉藥材中各化學(xué)成分的RRLC-TOFMS分析結(jié)果

續(xù)表 1

3 結(jié)論

本實驗首次運用RRLC-TOFMS技術(shù)對艾葉藥材中的化學(xué)成分進(jìn)行快速分離和鑒別，初步鑒別出31個化學(xué)成分，其中包括黃酮類、內(nèi)酯類及其他成分。該方法在指紋圖譜研究的基礎(chǔ)上對色譜峰進(jìn)一步明確化，為艾葉藥理作用的進(jìn)一步深入研究和資源的合理開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

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Rapid identification of chem ical com ponents in Artem isiae argyi folium by RRLC-TOFMS

LILing1，LüLei2，DONG Xin1，LV Diya1，LOU Ziyang1(1.Pharmaceutical Analysis Center，School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai200433，China;2.Department of Pharmacy，Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital affiliated to Second Military Medical University，Shanghai200438，China)

Objective Toidentify the chemical components in Artemisiae argyi folium by rapid resolution liquid chromatography-time of flightmass spectrometry(RRLC-TOFMS).MethodsThe separation was performed on an Agilent Eclipse C18column (2.1 mm×100 mm，1.8μm).Themobile phase consisted of acetonitrile(A)and 0.1%formic acid(B)were in gradient elution. The flowing rate was 0.35m l/min，the injection volumewas 1μl and the temperature of column was 40℃.Time of flightmass spectrometer(TOFMS)with electro spray ion source(ESI)was applied to qualitative analysis under the positive ion mode，and mass scan range was m/z 100-1 500.Results31 chemical compounds in Artemisiae argyi folium were identified unequivocally.ConclusionA rapid and efficient RRLC-TOFMSapproach for identifying the chemical constituents of Artemisiae argyi folium had been successfully established，which paved a way for quality control and further in vivo studies of Artemisiae argyi folium.

RRLC;Artemisiae argyi folium;chemical components;TOFMS

R931.5 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A ［文章編號］1006-0111(2014)06-0448-05

10.3969/j.issn.1006-0111.2014.06.012

2013-06-09

2013-11-13［本文編輯］李睿旻

李玲，實驗師.E-mail:316262150@163.com.

婁子洋.Tel:(021)81871335，E-mail:louziyang@126.com.