邱紅梅，郝文媛，高淑芹，馬曉萍，鄭宇宏，孟凡凡，范旭紅，王洋，王躍強，王曙明

大豆國家工程研究中心，吉林省農(nóng)業(yè)科學院大豆研究所，長春 130033

大豆含硫氨基酸相關酶基因發(fā)掘

邱紅梅，郝文媛，高淑芹，馬曉萍，鄭宇宏，孟凡凡，范旭紅，王洋，王躍強，王曙明

大豆國家工程研究中心，吉林省農(nóng)業(yè)科學院大豆研究所，長春 130033

大豆(Glycine max)含硫氨基酸合成途徑中的酶基因是含硫氨基酸組分的重要調(diào)控基因，發(fā)掘相關酶基因對高含硫氨基酸分子育種具有重要意義。文章采用大豆物理與遺傳整合圖譜，通過BioMercator2.1將113個含硫氨基酸合成途徑酶基因及33個控制含硫氨基酸含量的QTL整合到遺傳圖譜Consensus Map 4.0上，依據(jù)酶基因位點與QTL的一致性以及QTL的效應值，初步篩選到16個與含硫氨基酸合成相關的候選基因。通過生物信息學方法對候選基因進行拷貝數(shù)、SNP、表達譜等分析，鑒定到 12個相關酶基因，分別位于 D1a、M、A2、K和G等8個連鎖群上。生物信息學分析顯示這些基因所在QTL可解釋含硫氨基酸遺傳變異的6.0%～38.5%，其中9個基因的間接效應值超過10%。12個相關酶基因參與含硫氨基酸代謝的重要途徑，且多在子葉、花中高豐度表達，存在豐富的SNP。這些基因可作為候選基因進行功能標記開發(fā)，將為大豆分子設計育種奠定基礎。

大豆；含硫氨基酸；合成途徑；酶基因；生物信息學

大豆(Glycine max)在世界上被廣泛種植，常用來制做各種豆制品。據(jù)統(tǒng)計，全球 70%的植物蛋白來自大豆[1]。但其含硫氨基酸組分較低，在豆制品中需添加含硫氨基酸。然而，在處理過程中會形成揮發(fā)性硫化物并增加成本[2,3]。發(fā)掘或創(chuàng)制高含硫氨基酸種質(zhì)是提高大豆含硫氨基酸組分最有效的途徑之一[4]。大豆含硫氨基酸包括甲硫氨酸和半胱氨酸，合成途徑受遺傳及環(huán)境等因素的調(diào)控和影響[5]。遺傳因素包括氨基酸代謝途徑酶基因及控制含硫氨基酸含量的QTL等[6]。解析遺傳調(diào)控基礎，挖掘含硫氨基酸合成途徑相關的酶基因，是進行高含硫氨基酸種質(zhì)分子輔助選擇與分子設計育種的基礎。

目前，已知絲氨酸和乙酰CoA在絲氨酸乙酰轉移酶(SAT)催化下形成 O-乙酰絲氨酸；O-乙酰絲氨酸與硫化物在半胱氨酸合成酶(CS)的催化下形成半胱氨酸[7～9]。半胱氨酸與 O-磷酰高絲氨酸在胱硫醚-γ-合酶(CGS)的催化下形成胱硫醚。后者又在 β-胱硫醚酶(CBL)作用下，形成高半胱氨酸，最后在甲硫氨酸合酶(MS)的催化下生成甲硫氨酸[10,11]。在大豆中半胱氨酸與 O-乙酰高絲氨酸在 CGS的催化下可直接形成高半胱氨酸，其在半胱氨酸甲基轉移酶(CMT)的催化下生成甲硫氨酸。大豆基因組測序完成后，在 KEGG數(shù)據(jù)庫上公布了大豆含硫氨基酸合成途徑(http://www.kegg.jp/pathway/gmx00270)，注明了特有的相關酶。這些酶由 113個基因編碼，NCBI數(shù)據(jù)庫收錄了這些酶基因的相關信息(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gene?LinkName= biosystems_gene_all)[12]。于妍等[13]利用大豆基因組物理和遺傳整合圖譜，將17個大豆天冬氨酸代謝途徑酶基因分別定位在F、G、J及I等11個連鎖群上。Panthee等[14]利用RIL群體，發(fā)現(xiàn)10個控制含硫氨基酸含量的QTL，分別定位在F、G、M、D1a、D2等連鎖群上，效應值在 7.6%～22.9%之間。Carlson等[15]利用兩個RIL群體得到21個控制含硫氨基酸含量的QTL，分別定位在K、O、C1、C2、A2、K、G和F等連鎖群上，效應值在3.0%～26.0%之間。Fallen等[16]利用RIL群體，定位了2個控制含硫氨基酸含量的QTL，分別定位在 F、I連鎖群上，效應值分別為 5.2%和6.0%。

上述研究只是從代謝途徑或遺傳調(diào)控基礎單方面解析大豆含硫氨基酸的合成，缺乏兩者間的關聯(lián)性分析。本研究利用大豆物理與遺傳整合圖譜及BioMercator2.1，將113個含硫氨基酸合成酶基因與33個控制含硫氨基酸含量的 QTL共定位到整合遺傳圖譜Consensus Map 4.0上[17]，通過酶基因與QTL一致性位點，篩選與含硫氨基酸合成相關的酶基因。

利用生物信息學方法對候選基因進行基因組拷貝數(shù)、SNP、表達譜等分析，進一步鑒定相關酶基因，為含硫氨基酸功能標記開發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 含硫氨基酸合成酶基因和QTL信息的收集

在NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下載113個含硫氨基酸合成途徑酶基因序列，包括基因名稱、所在染色體、物理位置、基因注釋等。

收集 33個多年多點重復鑒定的控制含硫氨基酸含量的QTL信息，包括QTL名稱、所在染色體位置、臨近標記、染色體位置、LOD值、貢獻率和置信區(qū)間(C.I.)等[14～16]。

1.2 大豆含硫氨基酸合成途徑酶基因的遺傳定位

利用 Soybase(http://www.soybase.org/dlpages/ind-ex.php)物理(Glyma1.1)與遺傳(Consensus Map 4.0)整合圖譜，將酶基因的物理位置轉換為遺傳位置，找到臨近的左右標記，并通過 BioMercator2.1軟件定位到Consensus Map 4.0圖譜上。

1.3 大豆含硫氨基酸相關基因的初步鑒定

根據(jù)BioMercator2.1軟件要求的QTL文件格式整理數(shù)據(jù)，利用 BioMercator2.1軟件將控制含硫氨基酸含量的QTL映射到Consensus Map 4.0圖譜上，構建控制含硫氨基酸含量的QTL“一致性圖譜”。通過酶基因位點與控制含硫氨基酸含量的QTL的一致性，篩選相關酶基因。

1.4 相關酶基因的生物信息學分析

利 用 Soybase(http://soybase.org/GlycineBlast-Pages/)的Blast分析軟件對基因進行拷貝數(shù)分析。利用NCBI/ UniGene(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene)對基因的表達譜進行分析。利用 NCBI/dbSNP (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/snp/)對基因的SNP進行分析。利用 PSORT(http: //psort.hgc.jp/form.html)預測蛋白的亞細胞定位。

2 結果與分析

2.1 含硫氨基酸合成途徑酶基因的遺傳定位

利用大豆物理與遺傳整合圖譜及BioMercator2.1，將 113個大豆含硫氨基酸合成途徑酶基因分別定位到Consensus Map 4.0的20個連鎖群上(表1)。N、H、E連鎖群上的基因最少為3個，A2連鎖群上的基因最多為10個。酶基因在連鎖群的中部、末端均有分布，無位置偏好性。113個酶基因共編碼30個含硫氨基酸合成途徑酶，平均 3.8個基因同源。O、F、I連鎖群上存在3對串聯(lián)重復基因，分別為編碼甲硫基戊烯加雙氧酶(MTD)的100812492和100500632、編碼酪氨酸轉氨酶(TAT)的100800297和100800830、編碼 MTD 的 100500592和 100306042。其中100812492、100500632、100500592和100306042為同源基因。D1a連鎖群上的100799480與100798061為同源基因，編碼胞嘧啶甲基轉移酶(CMT)。N連鎖群上的100819100與OAS-TL1為同源基因，編碼半胱氨酸合成酶(CS)。A2連鎖群上的100793294與100808025為同源基因，編碼羧酸氧化酶(ACO)。編碼亞精胺合成酶(SS)的同源基因有 9個，在 D1a、 D1b、C2、A2、O、B2和 G連鎖群上各 1個，在D2連鎖群上有2個。表明大豆染色體加倍時，重要功能基因也加倍，但隨著進化基因序列發(fā)生變化，在不同連鎖群形成同源基因[18]。

2.2 含硫氨基酸代謝相關酶基因的初步鑒定

通過酶基因位點與控制含硫氨基酸含量的QTL的一致性，篩選到17個含硫氨基酸合成途徑酶基因，分別位于D1a、C1、M、A2和K等10個連鎖群上(圖1)。D1a連鎖群上的100790506，所在半胱氨酸QTL的效應值為8.5%。C1連鎖群上的100776541，所在半胱氨酸QTL的效應值合計23.6%。M連鎖群上的100815091，所在甲硫氨酸QTL的效應值為22.9%。A2連鎖群上的100778925、100793294，所在甲硫氨酸QTL的效應值為9.0%； 100798053所在半胱氨酸QTL的效應值為3.0%，因效應值太小，舍去該基因。K連鎖群上的100799311，所在半胱氨酸和甲硫氨酸QTL的效應值合計18.0%；CYS所在半胱氨酸和甲硫氨酸QTL內(nèi)，效應值合計11.0%。

O 連鎖群上的 100812480、100775420和100808736，所在半胱氨酸QTL的效應值為19.0%。F連鎖群上的100805448，所在半胱氨酸+甲硫氨酸和半胱氨酸 QTL的效應值合計 27.0%；100779947所在半胱氨酸+甲硫氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸QTL的效應值合計38.5%。D2連鎖群上的100791928，所在半胱氨酸+甲硫氨酸QTL的效應值7.6%。G連鎖群上的100776863，所在半胱氨酸QTL的效應值為18.8%；100800410所在半胱氨酸和甲硫氨酸 QTL的效應值合計30.9%。I連鎖群上的100792700，所在半胱氨酸QTL的效應值為6.0%。雖不排除QTL內(nèi)含有其他調(diào)控基因，但相關效應值可作為本研究的篩選依據(jù)。分析結果表明，初步鑒定的16個候選基因，可解釋含硫氨基酸含量的部分遺傳變異。

2.3 候選基因的生物信息學分析

通過上述分析在控制含硫氨基酸含量的QTL位點內(nèi)，得到16個重要酶基因， 這些基因可能與儲藏含硫氨基酸組分有關，但并未包括全部氨基酸合成途徑關鍵酶基因。對這些基因進行生物信息學分析，分別得到候選基因的拷貝數(shù)、SNP、高表達器官等信息(表2)。這些基因多為2～3個拷貝，含有多個 SNP，多在子葉和花中表達，編碼的酶多定位于

細胞質(zhì)。100790506有2個拷貝，9個同源基因，62個SNP，在子葉與花中高豐度表達，編碼的SS定位于細胞質(zhì)。100776863是 100790506的同源基因，在下胚軸高豐度表達，編碼的SS定位于細胞核。氨基酸的合成多在細胞質(zhì)及葉綠體中進行，因此100776863與含硫氨基酸的積累無關。100776541在基因組中有 2個拷貝，在葉芽與莖中高豐度表達，與儲藏含硫氨基酸相關的基因多在子葉或花中表達，因此該基因與含硫氨基酸的積累無關。100779947是100776541基因的拷貝，在子葉與根中高豐度表達。100815091在根中高豐度表達，表明在含硫氨基酸前期積累過程中，可能存在氨基酸從根到子葉的運輸。100778925有2個拷貝，4個同源基因，10個SNP，編碼的氨基環(huán)丙烷羧酸合酶(ACS)定位于細胞質(zhì)。100791928是 100778925的同源基因，編碼的ACS定位于細胞核，因此判定該基因與含硫氨基酸的積累無關。

表1 大豆含硫氨基酸合成途徑酶基因的遺傳定位

圖 1 大豆含硫氨基酸合成途徑酶基因與QTL一致性位點

表2 相關酶基因的生物信息學分析

100793294有 3個拷貝，7個同源基因，10個 SNP，未檢索到其表達譜信息，但在大豆EST數(shù)據(jù)得到多條與其高度比配的序列。CYS在NCBI數(shù)據(jù)庫中未檢索到SNP，但通過本地Blast與Clustal-1.81得到了SNP。100812480是100792700的拷貝，編碼的CMT均定位于細胞核。但100792700在花和子葉高豐度表達，亞細胞定位結果為軟件預測，還需進一步驗證，因此，該基因可能與含硫氨基酸的積累有關，可作為候選基因進一步研究。

2.4 相關酶基因遺傳調(diào)控的代謝途徑

通過生物信息學分析，初步鑒定到12個與大豆含硫氨基酸合成相關的酶基因，分別調(diào)控半胱氨酸與甲硫氨酸合成、甲硫醇的生成及甲硫氨酸循環(huán)途徑(圖2)。圖2結果表明，在甲硫氨酸合成途徑上，半胱氨酸與O-乙酰高絲氨酸在CGL基因的調(diào)控下可直接形成高半胱氨酸，無需CBL基因參與。100815091和 100775420調(diào)控半胱氨酸的合成。100815091編碼的 SAT(2.3.1.30)催化絲氨酸與乙酰 CoA生成 O-乙酰絲氨酸，此反應是可逆反應，受底物濃度調(diào)控[19]。

圖2 相關酶基因調(diào)控的代謝途徑

100775420編碼的CS(2.5.1.47)催化O-乙酰絲氨酸與硫化物生成半胱氨酸，該過程是硫元素進入植物新陳代謝的唯一途徑，受底物濃度、酶活等因素影響[20]。CYS和100779947調(diào)控甲硫氨酸的合成。CYS編碼的CGS(2.5.1.48)催化半胱氨酸與O-乙酰高絲氨酸生成高半胱氨酸。CGS在大豆中能催化5個化學反應，是重要的多功能酶。100779947編碼的CMT(2.1.1.14)催化高半胱氨酸生成甲硫氨酸。100808736編碼的甲硫氨酸-γ-裂解酶(MGL，4.4.1.11)催化甲硫氨酸生成甲硫醇，該反應受甲硫氨酸濃度反饋抑制，研究表明，MGL的活性也影響半胱氨酸的含量[21,22]。

100805448、100792700、100778925、100793294、100800410、100790506和100799311調(diào)控甲硫氨酸循環(huán)途徑。100805448編碼的腺苷甲硫氨酸合酶(AMS，2.5.1.6)催化甲硫氨酸生成腺苷甲硫氨酸，細胞中大約80%的甲硫氨酸都經(jīng)過2.5.1.6形成腺苷甲硫氨酸。在植物中腺苷甲硫氨酸是主要的甲基供體，通常作為底物參與多種生化途徑，包括多胺和乙烯的合成。100778925編碼的氨基環(huán)丙烷羧酸合酶(ACS，4.4.1.14)催化腺苷甲硫氨酸生成氨基酸環(huán)丙烷羧酸鹽，100793294編碼的氨基環(huán)丙烷羧酸氧化酶(ACO，1.14.17.4)催化氨基酸環(huán)丙烷羧酸鹽生成乙烯。ACO是乙烯生物合成的限速酶，ACO基因的表達具有組織和環(huán)境特異性，隨發(fā)育、環(huán)境的不同而變化[23]。在逆境下乙烯含量增加，甲硫氨酸相對含量降低，推測可導致儲藏蛋白及含硫氨基酸含量的減少。

3 討 論

大豆基因組測序后，在 NCBI(http://www.ncbi.nlm. nih.gov)上公布了大豆基因組序列及預測基因的功能注釋。NCBI是一個開放的數(shù)據(jù)庫，研究者可以提交基因的EST、SNP信息，這些都是實驗性的研究結果。利用EST建立了基因的UniGene數(shù)據(jù)庫，這里的表達譜信息是可靠的。通過基因組注釋還構建了許多代謝途徑模型?；蚪M注釋可通過各種電子注釋工具，如KEGG 的自動注釋功能，實現(xiàn)粗模型的數(shù)據(jù)提取[24]。KEGG數(shù)據(jù)庫里收錄了大豆含硫氨基酸合成途徑。本文將KEGG中含硫氨基酸合成途徑與控制含硫氨基酸含量的QTL進行關聯(lián)分析，初步鑒定相關的候選酶基因；再依據(jù)基因的表達譜(來自UniGene數(shù)據(jù)庫)及亞細胞定位信息進一步鑒定候選基因。此方法數(shù)據(jù)來源可靠，候選基因的篩選更準確。

大豆基因組發(fā)生過兩次大規(guī)模復制，形成了一個高度重復的基因組，約 75%的基因存在多個同源基因[12]。本文初步鑒定的12個相關酶基因，均有同源基因。其中編碼CGS(2.5.1.48)的CYS基因有2個同源基因，編碼CS(2.5.1.47)的100775420有11個同源基因。同源基因數(shù)在 3～10個的為非家族(Nonfamily，NF)基因，研究表明 NF基因調(diào)控植物基本生命代謝過程[25]?；虻目截惪梢越档瓦M化的選擇壓，但重復基因之間可能存在功能的冗余[26]。本文通過目標性狀遺傳調(diào)控位點，在同源基因中篩選到含硫氨基酸相關的酶基因，表明并非所有的同源基因都參與某一目標性狀的遺傳調(diào)控，有效排除了基因功能的冗余。

本文初步鑒定到的與大豆含硫氨基酸合成相關酶基因，所在的QTL均可解釋大豆含硫氨基酸的部分遺傳變異。Laxman等[27]發(fā)現(xiàn)合成儲藏蛋白時，游離含硫氨基酸是重要的影響因子，當含硫氨基酸缺乏時，tRNA硫醇化受阻，減少儲藏蛋白的翻譯，進而減少儲藏含硫氨基酸組分。SAT是含硫氨基酸合成途徑的第一個關鍵酶。Tabe等[28]在羽扇豆(Lupinus angustifolius L.)中過表達擬南芥的SAT基因，結果表明O-乙酰絲氨酸的含量增加了5倍，游離含硫氨基酸增加了26倍，但儲藏含硫氨基酸含量無變化。Nguyen等[29]在水稻中異位表達大腸桿菌的SAT基因，研究表明游離甲硫氨酸在葉片中增加2.7倍，在籽粒中增加 1.4倍，但儲藏甲硫氨酸含量無變化。Matityahu等利用種子特異啟動子在煙草中高豐度表達擬南芥CGS基因，結果煙草種子中游離甲硫氨酸、脯氨酸、絲氨酸含量增加[30]。Song等[31]將擬南芥的 CGS基因(AtD-CGS)轉化到大豆品種自貢冬豆中，3個轉基因品系的游離含硫氨基酸增加了 3.8～7倍，其中有 2個品系儲藏含硫氨基酸分別增加1.8和2.3倍。上述研究表明儲藏含硫氨基酸由多基因調(diào)控，通過表達個別基因通常對提高含硫氨基酸組分的效果不顯著。Tabe等[32]在種子成熟前期，檢測到多個含硫氨基酸合成途徑酶基因高水平表達。Liao等[33]在2個菜豆(Phaseolus vulgaris L.)品系中，對 10個含硫氨基酸代謝途徑酶基因進行了表達差異分析，明晰了10個酶基因的轉錄模式，初步構建了多基因遺傳調(diào)控網(wǎng)絡。本研究得到的 100775420與100808736定位于同一半胱氨酸QTL內(nèi)，前者編碼CS，后者編碼MGL。MGL基因轉錄水平與CS基因轉錄水平呈負相關，進而影響半胱氨酸的含量[34]。本研究得到的12個與大豆含硫氨基酸合成相關的酶基因均存在 SNP，表明這些基因可能存在等位基因，因此可以利用這些基因進行候選基因關聯(lián)分析，開發(fā)功能標記，為大豆分子輔助及設計育種奠定基礎。

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(責任編委: 張紅生)

Gene mining of sulfur-containing amino acid metabolic enzymes in soybean

Hongmei Qiu, Wenyuan Hao, Shuqin Gao, Xiaoping Ma, Yuhong Zheng, Fanfan Meng, Xuhong Fan, Yang Wang, Yueqiang Wang, Shuming Wang

National Engineering Research Center for Soybean, Soybean Research Institute, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130033, China

The genes of sulfur-containing amino acid synthetases in soybean are essential for the synthesis of sulfur-containing amino acids. Gene mining of these enzymes is the basis for the molecular assistant breeding of high sulfur-containing amino acids in soybean. In this study, using software BioMercator2.1, 113 genes of sulfur-containing amino acid enzymes and 33 QTLs controlling the sulfur-containing amino acids content were mapped onto Consensus Map 4.0, whichwas integrated by genetic and physical maps of soybean. Sixteen candidate genes associated to the synthesis of sulfur-containing amino acids were screened based on the synteny between gene loci and QTLs, and the effect values of QTLs. Through a bioinformatic analysis of the copy number, SNP information, and expression profile of candidate genes, 12 related enzyme genes were identified and mapped on 8 linkage groups, such as D1a, M, A2, K, and G. The genes corresponding to QTL regions can explain 6%-38.5% genetic variation of sulfur-containing amino acids, and among them, the indirect effect values of 9 genes were more than 10%. These 12 genes were involved in sulfur-containing amino acid metabolism and were highly expressed in the cotyledons and flowers, showing an abundance of SNPs. These genes can be used as candidate genes for the development of functional markers, and it will lay a foundation for molecular design breeding in soybean.

soybean(Glycine max); sulfur-containing amino acids; synthetic pathways; enzyme genes; bioinformatics

2014-01-14;

2014-05-06

國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)項目(編號：2012AA101106)，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系項目(編號：CARS-04-PS11)，吉林省創(chuàng)新工程項目(編號：C32120402)，吉林省自然科學基金項目(編號：20140101142JC)和東北農(nóng)業(yè)大學大豆生物學教育部重點實驗室開放基金項目(編號：SB12A02)資助

邱紅梅，碩士研究生，專業(yè)方向：大豆種質(zhì)資源保存與創(chuàng)新。Tel: 0431-87063237；E-mail: qhm2001-2005@163.com；

郝文媛，博士研究生，專業(yè)方向：大豆基因資源發(fā)掘與利用。E-mail: wenyuan_h@163.com

邱紅梅和郝文媛同為第一作者。

王曙明，博士，研究員，研究方向：大豆分子遺傳育種。E-mail: shumingw@263.net

10.3724/SP.J.1005.2014.0934

時間: 2014-8-12 14:17:59

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140812.1417.002.html