張蕾, 隋御, 王婷, 李利堅(jiān), 李元杰, 金彩霞, 徐方

1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院, 寧夏生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 銀川 750004;

2. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心, 上海 200072

hMMS2基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)的影響

張蕾1, 隋御1, 王婷1, 李利堅(jiān)1, 李元杰1, 金彩霞2, 徐方1

1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院, 寧夏生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 銀川 750004;

2. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心, 上海 200072

為探討hMMS2(Human methyl methanesulfonate sensitive mutant 2)基因?qū)θ私Y(jié)腸癌細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)的影響,文章以人高分化耐奧沙利鉑結(jié)腸癌細(xì)胞(THC8307/L-OHP)為實(shí)驗(yàn)材料, 采用脂質(zhì)體-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建了帶有干擾目的基因hMMS2的miRNA片段并攜帶綠色熒光蛋白標(biāo)記重組質(zhì)粒(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-MMS2)的細(xì)胞系, 通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(qRT-PCR)和免疫熒光技術(shù)(Immunostaining technique)檢測(cè)該細(xì)胞系的干擾效率。選擇 hMMS2低表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的上述細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞, 同時(shí)將未曾作過處理的 THC8307/ L-OHP細(xì)胞作為空白對(duì)照組, 轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白空質(zhì)粒(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR)的 THC8307/L-OHP細(xì)胞作為陰性對(duì)照組, 以噻唑藍(lán)比色分析實(shí)驗(yàn)(MTT colorimetric analysis assay)、克隆形成實(shí)驗(yàn)(Colony formation assay)對(duì) 3組細(xì)胞的存活率和克隆形成率進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的奧沙利鉑半數(shù)抑制濃度(Half inhibition concentration, IC50)、耐藥指數(shù)(Resistance index, RI)及克隆形成率(Colony-forming efficiency, CFE)均比對(duì)照組細(xì)胞明顯降低(P＜0.05), 而相對(duì)逆轉(zhuǎn)率(Relative reverse efficiency, RRE)增高(P＜0.05), 提示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力減弱; 以羅丹明123實(shí)驗(yàn)(Rhodamine 123 assay)結(jié)合倒置熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)等觀測(cè)細(xì)胞的凋亡變化, 結(jié)果顯示, 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率較對(duì)照組細(xì)胞顯著增高(P＜0.05); 兩對(duì)照(空白、陰性)組間并無細(xì)胞增殖或凋亡的顯著性差異。研究結(jié)果提示：下調(diào)hMMS2基因表達(dá)可逆轉(zhuǎn)人高分化耐奧沙利鉑結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)L-OHP的耐藥性并促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。

RNA干擾; 鉑類耐藥; hMMS2; 人高分化耐奧沙利鉑結(jié)腸癌細(xì)胞(THC8307/L-OHP); 細(xì)胞凋亡

結(jié)腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一, 隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活方式的改變, 其患病率也逐年上升, 嚴(yán)重危害人類生命健康[1]?；熓墙Y(jié)腸癌綜合治療的重要手段, 其中奧沙利鉑(Oxaliplatin, L-OHP)是臨床上治療結(jié)腸癌最常用的化療藥物, 尤其對(duì)于中晚期結(jié)腸癌的治療及預(yù)防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有重要的意義。臨床上腫瘤的化療是一個(gè)多種藥物聯(lián)合使用的漫長(zhǎng)過程, 隨著大劑量多種藥物的同時(shí)使用, 細(xì)胞的多藥耐藥(Multidrug resistance, MDR)問題也隨之產(chǎn)生, 并且成為結(jié)腸癌等惡性腫瘤細(xì)胞治療中“攻而未解”的難題[2]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)手段的發(fā)展,以RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)調(diào)控目的基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的耐藥性逆轉(zhuǎn)成為腫瘤治療的一條新思路。本課題組曾對(duì)鉑類藥物耐藥分子機(jī)制密切相關(guān)的跨損傷DNA合成系統(tǒng)[3](Translesion DNA synthesis, TLS)進(jìn)行了研究, 將該系統(tǒng)的易誤修復(fù)途徑(Error-prone repair, EPR)中的關(guān)鍵基因 REV3L (REV3-like, polymerase (DNA directed), zeta, catalytic subunit)作為靶基因, 研究其與逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌的耐藥性關(guān)系[4], 為更深入地探討多藥耐藥性提供相應(yīng)的支持與保障。本文繼續(xù)這一思路, 對(duì)該系統(tǒng)的無誤修復(fù)途徑(Error-free repair, EFR)的關(guān)鍵基因 hMMS2 (Human methyl methanesulfonate sensitive mutant 2)與逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌的耐藥性進(jìn)行研究。hMMS2基因?qū)儆赗AD6上位群基因[5], 在細(xì)胞分化及腫瘤的發(fā)生中扮演著重要角色, 它編碼一種泛素綴合酶樣蛋白, 其氨基酸序列及二、三級(jí)結(jié)構(gòu)類似于泛素綴合酶(Ubiquitin-conjugating enzyme)[6]。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究表明：通過抑制DNA聚合酶ζ或者跨損傷修復(fù)途徑, 可逆轉(zhuǎn)卵巢癌、肺癌等多種腫瘤耐藥細(xì)胞的耐藥性[7～10]。目前, 主要開展了 polη介導(dǎo)的無誤性修復(fù)途徑和polζ介導(dǎo)的易誤性修復(fù)途徑與鉑類耐藥性關(guān)系的研究。本研究通過下調(diào)人高分化耐奧沙利鉑結(jié)腸癌細(xì)胞(THC8307/L-OHP)的hMMS2基因表達(dá), 檢測(cè)其相應(yīng)的細(xì)胞增殖和凋亡變化情況, 以此來評(píng)價(jià)目的基因、鉑類藥物與細(xì)胞耐藥性形成和逆轉(zhuǎn)之間的關(guān)系, 為臨床腫瘤治療提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

人高分化結(jié)腸癌細(xì)胞系(THC8307)及人高分化耐奧沙利鉑結(jié)腸癌細(xì)胞系(THC8307/L-OHP)由天津醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室湯華教授建立并惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 hMMS2 miRNA的構(gòu)建

根據(jù)GenBank hMMS2基因(NM_003350)已知序列的基因信息, 設(shè)計(jì) miRNA的靶序列: 5′-TGCTGTTACGAGGAACTTTAACTCCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGGAGTTAGTTCCTCGTAA-3′, 反義鏈為5′-CTGTTACGAGGAACTAACTCCTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAGGAGTTAAAGTTCCTCGTAAC-3′,將設(shè)計(jì)合成的 miRNA oligos復(fù)性連接至 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體, 構(gòu)建完成的hMMS2基因沉默載體經(jīng)轉(zhuǎn)化 DH5α感受態(tài)細(xì)胞后, 選取陽性克隆純化后送上海松正生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

THC8307(親本系)常規(guī)培養(yǎng), THC8307/L-OHP (耐藥系)需加入 6 μg/mL的奧沙利鉑(南京制藥廠,產(chǎn)品批號(hào)：20100602)維持其耐藥性。實(shí)驗(yàn)前1周耐藥細(xì)胞需撤去藥物常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染, 按 LipofectamineTM2000試劑盒(Invitrogene公司)說明書進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)分3組進(jìn)行：①空白對(duì)照組：未經(jīng)任何處理的THC8307/L-OHP細(xì)胞; ②陰性對(duì)照組：為轉(zhuǎn)染陰性空質(zhì)粒(pcDNA6.2-GW/ EmGFP-miR)的THC8307/L-OHP細(xì)胞; ③實(shí)驗(yàn)組：為轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組質(zhì)粒(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-MMS2)的THC8307/L-OHP細(xì)胞。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞hMMS2基因的表達(dá)量

將親代THC8307及3組耐藥THC8307/L-OHP細(xì)胞(空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組), 分別于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng) 24 h 后在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況及細(xì)胞形態(tài)變化。再繼續(xù)培養(yǎng)24 h后, 1 000 r/min 離心收集上述3組耐藥細(xì)胞及親代細(xì)胞 THC8307, 按總 RNA提取試劑盒說明書提取RNA, 反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA, 并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞目的基因的相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR擴(kuò)增體系：10 μg/mL的樣品cDNA 5 μL, 2×Real-time PCR Master Mix 12.5 μL, 上、下游引物各 0.5 μL, 去離子水 6 μL, Passive Reference Dye (PRD) 0.5 μL, 總反應(yīng)體系 25 μL。根據(jù) NCBI中GenBank公布的 cDNA序列(NM_003350), 應(yīng)用軟件Primer 5設(shè)計(jì)擴(kuò)增hMMS2基因的引物。上游引物：5′-CGGTCTCCACAGGAGTTAAAGT-3′; 下游引物：5′-TGTCCAGGTCATGTTTACCAGC-3′。為避免基因組DNA污染, 引物設(shè)計(jì)原則為上、下游引物跨兩個(gè)外顯子[11]。內(nèi)參基因GAPDH上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′, 下游引物 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。qRT-PCR擴(kuò)增條件為：95℃ 3 min; 93℃ 30 s, 59℃ 30 s, 72℃ 1 min, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min。3次實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)通過比較CT值法( 2-ΔΔCT) 進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.4 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后 THC8307/L-OHP細(xì)胞 MMS2蛋白表達(dá)的變化

細(xì)胞轉(zhuǎn)染 48 h后, 各組細(xì)胞按 4 ×105/ mL、2 mL/孔接種于6孔板中; 4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min, PBS洗3遍, 每次5 min; 0.5%TritonX-100對(duì)細(xì)胞透化處理10 min, PBS洗3遍, 每次5 min; 10%山羊血清封閉30 min, PBS洗3遍; 滴加1∶200一抗(兔抗人MMS2單克隆抗體, 美國(guó)abcam公司), 4℃過夜, PBS洗3遍, 每次5 min; 滴加1:100二抗(FITC標(biāo)記山羊抗兔 IgG, 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司), 37℃孵育 l h, PBS洗3遍, 每次5 min; 加入0.5 μg/mL DAPI (DAPI染色試劑盒, 南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)染色10 min, PBS 洗3遍, 在避光條件下, l h內(nèi)倒置熒光顯微鏡下拍照并分析結(jié)果。

1.2.5 MTT 法(噻唑藍(lán)比色分析實(shí)驗(yàn))檢測(cè)轉(zhuǎn)染后THC8307/L-OHP細(xì)胞的增殖活性

取THC8307及轉(zhuǎn)染24 h后的THC8307/L-OHP各組細(xì)胞5×104/孔接種于96孔板中, 設(shè)5個(gè)藥物濃度梯度：0.06 μg/mL、0.6 μg/mL、6 μg/mL、60 μg/mL和600 μg/mL, 加入100 μL/孔。培養(yǎng)48 h后, 按MTT試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)說明書操作, 在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)OD490值, 取5個(gè)復(fù)孔的平均吸光度(OD)值, 每組重復(fù) 3次, 根據(jù)吸光度報(bào)告計(jì)算細(xì)胞存活率(%)=OD加藥組/ OD對(duì)照組×100%, 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=1-細(xì)胞存活率=1-OD加藥組/ OD對(duì)照組× 100%, 運(yùn)用改良寇氏法(改良Logit法)確定奧沙利鉑對(duì)各組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(Half inhibition concentration, IC50), 進(jìn)一步計(jì)算出耐藥指數(shù)(Resistance index, RI)=耐藥細(xì)胞 IC50/親本細(xì)胞 IC50和相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率(Relative reverse efficiency, RRE)=(未轉(zhuǎn)染組IC50-轉(zhuǎn)染組 IC50)/(未轉(zhuǎn)染組 IC50-親本細(xì)胞 IC50) ×100%。

1.2.6 Rh123單染法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后 THC8307/L-OHP細(xì)胞凋亡情況

取上述轉(zhuǎn)染24 h后的各組THC8307/L-OHP細(xì)胞按4×105個(gè)/孔接種與六孔板中, 培養(yǎng)24 h后收獲細(xì)胞懸液, 按羅丹明 123試劑盒(Rh123, 南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)染色細(xì)胞, 在同一曝光率下,倒置熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)及其熒光強(qiáng)度,并以IPP 6.0軟件統(tǒng)計(jì)平均熒光強(qiáng)度。

1.2.7 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后

THC8307/L-OHP細(xì)胞聯(lián)合L-OHP的凋亡率

取上述轉(zhuǎn)染24 h后的THC8307/L-OHP各組細(xì)胞, 調(diào)整濃度至4×105/mL, 以2 mL/孔接種于 6孔板, 培養(yǎng)24 h后加入終濃度為 60 μg/mL L-OHP, 置于 37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)16 h, 分別收集各處理組細(xì)胞, 按 Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)操作說明采用AV/PI雙染, 避光放置10 min, 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.8 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力和細(xì)胞增殖情況

轉(zhuǎn)染24 h后, 將3組THC8307/L-OHP細(xì)胞按50、100、200、500、1000、2000的細(xì)胞密度分別接種于3個(gè)6孔板中, 向相應(yīng)每孔中分別加入0 μg/mL、0.06 μg/mL、0.6 μg/mL、6 μg/mL、60 μg/mL 和600 μg/mL濃度的奧沙利鉑, 常規(guī)培養(yǎng)10 d后, 甲醇固定15 min、姬姆薩染色30 min, 肉眼計(jì)數(shù)含有50個(gè)細(xì)胞以上、直徑＞ 0.5 mm 的克隆數(shù)量, 計(jì)算細(xì)胞克隆形成率?？寺⌒纬陕?%)=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.9 微核的測(cè)定檢測(cè)基因表達(dá)改變所致的遺傳不穩(wěn)定現(xiàn)象

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后取出各組細(xì)胞各一皿, PBS沖洗后, 姬姆薩染色, 鏡檢。在高倍鏡下, 選擇細(xì)胞均勻的視野, 隨機(jī)選取1000個(gè)完整的細(xì)胞, 計(jì)數(shù)所含微核的細(xì)胞數(shù)。微核的判斷標(biāo)準(zhǔn)：分布在主核邊、形態(tài)為圓形或橢圓形, 并且染色與主核相同但又獨(dú)立于主核的、大小約為主核的1/20～1/4的微小核。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù) 3 次, 所有數(shù)據(jù)均用 SPSS 16.0 軟件分析, 以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 組間比較采用單因素方差分析(SNK 法), P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 hMMS2基因沉默載體的測(cè)序結(jié)果

構(gòu)建完成的hMMS2基因沉默載體經(jīng)轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后, 取陽性克隆純化后進(jìn)行測(cè)序, 經(jīng)比較, 測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列相同, 表明 pre-miRNA 片段完整正確地插入到載體 pcDNA 6.2-GW/EmGFP-miR 中, 提示針對(duì)靶基因hMMS2的miRNA干擾質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 干擾效能鑒定

2.2.1 hMMS2基因在細(xì)胞中表達(dá)的變化

qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示：THC8307/L-OHP細(xì)胞中hMMS2的相對(duì)表達(dá)量是THC8307細(xì)胞的(3.24 ± 0.78), 顯著高于敏感株細(xì)胞中的表達(dá)量(P＜0.05,圖 1A) , THC8307/L-OHP細(xì)胞轉(zhuǎn)染含hMMS2-miRNA實(shí)驗(yàn)組質(zhì)粒 24 h 后, 細(xì)胞中hMMS2基因的相對(duì)表達(dá)量是THC8307/L-OHP細(xì)胞的(0.302 ± 0.136) (P＜0.05); 轉(zhuǎn)染陰性空質(zhì)粒細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量是THC8307/L-OHP細(xì)胞的(0.923±0.256) (P＞0.05, 圖1B)。結(jié)果表明：小RNA干擾片段成功抑制實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞hMMS2基因的表達(dá), 而空質(zhì)粒對(duì)hMMS2基因表達(dá)無大影響。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)hMMS2基因在細(xì)胞中的表達(dá)A: qRT-PCR檢測(cè)hMMS2 在THC8307 和THC8307/L-OHP細(xì)胞中的表達(dá)(將THC8307表達(dá)量設(shè)為100%); B: qRT-PCR檢測(cè)hMMS2 在轉(zhuǎn)染THC8307/L-OHP 細(xì)胞后的表達(dá)。K：空白組; Y：陰性組; S：實(shí)驗(yàn)組; 將空白組表達(dá)量設(shè)為100%; *表示P＜0.05。

2.2.2 MMS2蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平的測(cè)定

IPP 6.0軟件分析各組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度顯示(表 1), 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比, MMS2蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。在蛋白水平上證明基因下調(diào)成功(圖2)。

表1 各組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度

圖2 倒置熒光顯微鏡觀察MMS2蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)(400倍)

2.3 下調(diào)hMMS2基因后THC8307/L-OHP細(xì)胞對(duì)L-OHP敏感性的變化

MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(表 2), 實(shí)驗(yàn)組與兩對(duì)照組比較, RI值明顯降低, 而相對(duì)逆轉(zhuǎn)率明顯增高(P＜0.05)。從圖 3可以看出, 經(jīng)48 h連續(xù)給藥(L-OHP)處理后,均可抑制各組細(xì)胞生長(zhǎng)增殖并呈濃度依賴性。在同一藥物濃度下, 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞抑制率較兩對(duì)照組顯著升高, 說明下調(diào) hMMS2基因可以抑制 THC8307/ L-OHP細(xì)胞的生長(zhǎng), 提高 THC8307/L-OHP細(xì)胞對(duì)化療的敏感性。

圖3 不同劑量的L-OHP對(duì)各組細(xì)胞的殺傷作用

表2 各組細(xì)胞對(duì)L-OHP的敏感性

2.4 下調(diào)hMMS2基因?qū)?xì)胞凋亡的影響

2.4.1 Rh123熒光染色

同一視野和曝光率下, 各組細(xì)胞熒光照片, 兩對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)完整, 染色均勻; 實(shí)驗(yàn)組多為凋亡細(xì)胞, 形態(tài)出現(xiàn)殘缺, 染色不均勻(圖4)。IPP 6.0分析平均熒光強(qiáng)度顯示(表3)：基因下調(diào)組平均熒光強(qiáng)度強(qiáng)于空白組和陰性對(duì)照組(P＜0.05), 空白組和陰性對(duì)照組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。結(jié)果表明：hMMS2基因下調(diào)后促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。

2.4.2 流式細(xì)胞術(shù)分析 Annexin V-FITC/PI熒光染色結(jié)果

圖4 倒置熒光顯微鏡觀察下調(diào)hMMS2基因后Rh123熒光染色細(xì)胞形態(tài)(400倍)

表3 各組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度

經(jīng)L-OHP處理16 h后, 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組與兩對(duì)照組相比凋亡率增高, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 空白組和陰性對(duì)照組之間無顯著性差異(P＞0.05) (圖5, 表4)。結(jié)果表明, 沉默hMMS2 基因可通過誘導(dǎo)凋亡增強(qiáng) THC8307/L-OHP細(xì)胞對(duì)L-OHP的敏感性。

2.5 基因下調(diào)對(duì)細(xì)胞克隆形成能力和增殖能力的影響

由表5可見, 3組細(xì)胞在L-OHP ＞0.6 μg/mL時(shí),隨藥物濃度增加, 克隆形成率均明顯降低, 且轉(zhuǎn)染組較兩對(duì)照組細(xì)胞克隆形成率明顯降低(P＜0.05),但600 μg/mL時(shí)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), 提示下調(diào) hMMS2基因增加 THC8307/L-OHP細(xì)胞對(duì)L-OHP的敏感性。

2.6 基因下調(diào)對(duì)細(xì)胞微核產(chǎn)生的影響

實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞微核數(shù)值如表6所示：較兩對(duì)照組細(xì)胞的微核數(shù)值明顯降低, 差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 而兩對(duì)照組細(xì)胞之間微核數(shù)值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示hMMS2基因可能與微核的產(chǎn)生有關(guān)系。

3 討 論

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)下調(diào)hMMS2基因?qū)o予L-OHP處理的THC8307/L-OHP細(xì)胞凋亡的影響

表4 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率(%,±s)

表4 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率(%,±s)

注：實(shí)驗(yàn)組與兩對(duì)照組比較, *P＜0.05; 兩對(duì)照組比較, P＞0.05。

組別 早期細(xì)胞凋亡 晚期細(xì)胞凋亡THC8307/L-OHPblank11.48±0.423.92±0.26THC8307/L-OHPcontrol12.93±0.634.27±0.17THC8307/L-OHPhMMS2↓19.76±0.78*6.06±0.34*

化療是結(jié)腸癌治療的重要手段之一, 然而長(zhǎng)時(shí)間多種藥物的聯(lián)合使用會(huì)產(chǎn)生多藥耐藥現(xiàn)象, 導(dǎo)致療效的降低甚至化療的失敗, 鉑類耐藥現(xiàn)象是結(jié)腸癌治療中較為常見的現(xiàn)象, 因此研究鉑類耐藥是解決結(jié)腸癌耐藥的路徑之一, 國(guó)內(nèi)外大量的研究已證實(shí)跨損傷 DNA合成途徑與逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類藥物敏感性存在一定的因果關(guān)系, 明確了跨損傷DNA合成途徑在修復(fù)鉑類藥物引起的 DNA交連損傷中起關(guān)鍵作用[12,13], 可以通過抑制跨損傷 DNA 合成途徑來提高鉑類化療敏感性[14]。Albertella等[7]發(fā)現(xiàn)polη可以通過跨損傷合成途徑幫助腫瘤細(xì)胞跨越順鉑引起的損傷, 缺失 polη細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性顯著增加。Doles等[8]通過構(gòu)建耐藥性非小細(xì)胞肺腺癌小鼠模型, 運(yùn)用RNA干擾技術(shù)靶向降低mREV3的表達(dá), 腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)順鉑作用的顯著增敏。這與Lin等[9]用同樣方法進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。同時(shí)Okuda等[10]發(fā)現(xiàn)易誤性修復(fù)途徑的 REV1L 基因也在修復(fù)鉑類引起的 DNA 損傷中扮演重要作用, 抑制其表達(dá)后, 耐藥性卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性增加 1.5倍。這些研究結(jié)果均表明, 可通過抑制跨損傷DNA合成途徑的相關(guān)基因表達(dá)來逆轉(zhuǎn)鉑類耐藥。盡管對(duì)于 hMMS2與鉑類耐藥性逆轉(zhuǎn)的研究目前開展尚少, 然而 hMMS2與增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)泛素化過程密切相關(guān)已是相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明了的事實(shí), PCNA泛素化過程可調(diào)控聚合酶的轉(zhuǎn)換, 從而啟動(dòng)跨損傷復(fù)制過程[15～17],因此提示 hMMS2與鉑類耐藥性逆轉(zhuǎn)可能存在一定的相關(guān)性。

表5 不同濃度L-OHP作用后細(xì)胞克隆形成率(±s)

表5 不同濃度L-OHP作用后細(xì)胞克隆形成率(±s)

注：與0 μg/mL組比較, *P＜0.05 ; 實(shí)驗(yàn)組與兩對(duì)照組比較,△P＜0.05; 兩對(duì)照組比較, P＞0.05。

組別藥物濃度(μg/mL) 0 0.06 0.6 6 60 600THC8307/L-OHPblank1.0000.754±0.064*0.746±0.039*0.668±0.066*0.416±0.041*0.021±0.002*THC8307/L-OHPcontrol1.0000.734±0.071*0.706±0.030*0.610±0.029*0.388±0.049*0.024±0.004*THC8307/L-OHPhMMS2↓1.0000.609±0.020*△0.545±0.019*△0.486±0.021*△0.321±0.034*△0.019±0.005*

表6 hMMS2表達(dá)量的不同對(duì)細(xì)胞微核產(chǎn)生的影響

本研究通過 qRT-PCR、MTT、平板克隆形成等實(shí)驗(yàn)研究和分析, 發(fā)現(xiàn) hMMS2可能參與了結(jié)腸癌細(xì)胞的多藥耐藥形成, 下調(diào) hMMS2基因可以增加THC8307/L-OHP細(xì)胞對(duì) L-OHP的敏感度。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)hMMS2體外轉(zhuǎn)染到結(jié)腸癌THC8307/L-OHP細(xì)胞后, hMMS2低表達(dá)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng), 促進(jìn)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用, 提高化療的敏感性, 并對(duì)化療藥物有劑量依賴性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), 在相同劑量L-OHP作用下, 下調(diào)hMMS2 基因表達(dá)可以促進(jìn)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞的自發(fā)凋亡, 提示由TLS介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞耐藥過程中可能有凋亡機(jī)制的參與, 這與Philip等[18]發(fā)現(xiàn)TLS可使P53凋亡信號(hào)通路中的調(diào)控分子表達(dá)和功能失常引起腫瘤細(xì)胞凋亡的報(bào)道是一致的。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明下調(diào)hMMS2基因的表達(dá)對(duì)逆轉(zhuǎn)人高分化耐奧沙利鉑結(jié)腸癌細(xì)胞(THC8307/L-OHP)的耐藥性有一定影響, 在一定程度上恢復(fù)了耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性, 或許這是通過抑制 PCNA 的泛素化作用來實(shí)現(xiàn)的, 因?yàn)閔MMS2可與UBC13-RAD5結(jié)合形成Rad8Rad5/Mms2-Ubc13復(fù)合物對(duì)PCNA進(jìn)行泛素化修飾[16], 而PCNA泛素化修飾主要介導(dǎo)了細(xì)胞 DNA 在 S 期的損傷應(yīng)答作用, 從而降低鉑類藥物所引起的細(xì)胞凋亡,引起鉑類耐藥性的產(chǎn)生[19]。同時(shí)PCNA 泛素化修飾可誘發(fā)基因組DNA交連的產(chǎn)生及DNA 高突變[15],這也是鉑類藥物產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵, 以及在使用過程中加劇機(jī)體毒副作用的機(jī)制之一[20]。由此可見,下調(diào)hMMS2基因一方面可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡, 另一方面又可作為耐藥逆轉(zhuǎn)劑, 增加了結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)鉑類藥物敏感性, 使得化療藥物對(duì)腫瘤的殺傷作用增強(qiáng), 由此可減少化療藥物的劑量, 從而減輕其對(duì)機(jī)體的毒副作用, 為臨床治療腫瘤提供一種新思路。

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(責(zé)任編委: 盧大儒)

Roles of hMMS2 gene in reversing the oxaliplatin tolerance of human colon carcinoma cells

Lei Zhang1, Yu Sui1, Ting Wang1, Lijian Li1, Yuanjie Li1, Caixia Jin2, Fang Xu1

1. Ningxia Key Laboratory of Reproduction and Genetics, College of Inspection, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China;
2. Center for Translational Medicine, School of Medicine, Tongji University, Shanghai 200072, China

In this study, the roles of hMMS2 (human methyl methanesulfonate sensitive mutant 2) gene encoding the hu-man ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 2 in the drug resistance in human colon carcinoma were investigated by using a well-differentiated human colorectal carcinoma L-OHP-resistant cell line, THC8307/L-OHP. THC8307/L-OHP cells were transfected via liposome along with plasmid pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-MMS2 expressing both miRNA against hMMS2 and GFP, followed by real-time fluorescent quantitative PCR and immunofluorescence to select stable transfectants with significantly reduced hMMS2 expression. Compared with untransfected or pcDNA6.2-GW/EmGFP vector-transfected cells, the hMMS2-depleted cells displayed significantly (P＜0.05) reduced half inhibition concentration(IC50) resistance index (RI) and colony-forming efficiency (CFE) upon treatment with oxaliplatin (L-OHP), while its relative reverse efficiency(RRE) was significantly higher (P＜0.05) than the control cells, indicating compromised ability of cell proliferation. Indeed, Rhodamine 123 staining and flow cytometry analyses revealed an increased rate of apoptosis in hMMS2-depleted cells while no difference in cell proliferation or apoptosis was observed between the two control cell lines. The above observations collectively indicate that suppression of hMMS2 reverses L-OHP tolerance in differentiated human colorectal carcinoma cells by promoting apoptosis.

RNA interference; platinum resistance; hMMS2; human well-differentiated colorectal carcinoma L-OHP-resistant cell line; apoptosis

2013-10-12;

2014-01-29

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81060170, 31360251); 教育部“春暉計(jì)劃”項(xiàng)目(編號(hào)：Z2011056); 銀川市應(yīng)用研究開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：銀財(cái)發(fā)(2012)249)資助

張蕾, 在讀碩士研究生, 專業(yè)方向：DNA損傷與修復(fù)。E-mail: 2427084464@qq.com

徐方, 教授, 博士生導(dǎo)師, 研究方向：DNA損傷與修復(fù)。E-mail: xufang@nxmu.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0346

時(shí)間: 2014-3-27 14:33:05

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140327.1433.002.html