陳先知, 王燕, 史建磊, 朱隆靜, 王克磊, 徐堅(jiān)

1．溫州科技職業(yè)學(xué)院, 溫州 325006;

2．溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 浙南作物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 溫州 325006

黃瓜全基因組熱激轉(zhuǎn)錄因子(HSFs)的鑒定與表達(dá)分析

陳先知1,2, 王燕1,2, 史建磊1,2, 朱隆靜1,2, 王克磊1,2, 徐堅(jiān)1,2

1．溫州科技職業(yè)學(xué)院, 溫州 325006;

2．溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 浙南作物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 溫州 325006

熱激轉(zhuǎn)錄因子 (Heat shock factors, HSFs) 普遍存在于整個(gè)生物界。盡管植物HSFs的DNA 結(jié)合域具有較高的保守性, 但其結(jié)構(gòu)特征、生物功能具有多樣化的特點(diǎn)。本文利用黃瓜(Cucumis sativus L.)全基因組測(cè)序結(jié)果, 運(yùn)用生物信息學(xué)方法鑒定了黃瓜HSFs, 并對(duì)其數(shù)量、序列特征、染色體定位以及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等進(jìn)行分析。結(jié)果表明, 黃瓜至少含有21個(gè)HSFs基因家族成員, 編碼184～560個(gè)氨基酸, 分子量21.2～62.3 kDa, 等電點(diǎn)(PI)4.70～9.10; 序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)這些成員都具有轉(zhuǎn)錄因子特有的DNA結(jié)合域(DNA binding domain, DBD); 染色體定位分析表明, 除Csa026480之外, 其余HSFs不均勻分布在黃瓜7條染色體上。從擬南芥(Arabidopsis thaliana)和黃瓜HSFs系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出, 這些轉(zhuǎn)錄因子分為3個(gè)分支, 其中Ⅰ分支進(jìn)一步可分為3類(lèi)(A、B、C類(lèi)), 系統(tǒng)發(fā)育分析揭示黃瓜HSFs蛋白存在9對(duì)直系同源蛋白, 3對(duì)旁系同源蛋白, 表明HSF轉(zhuǎn)錄因子基因家族的多樣化發(fā)生在黃瓜和擬南芥分化之前。EST表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)這些熱激轉(zhuǎn)錄因子參與黃瓜的果實(shí)、雌花和兩性花的發(fā)育與形成; 通過(guò)qRT-PCR分析, 發(fā)現(xiàn)這些基因在黃瓜苗期應(yīng)對(duì)高溫?zé)峒ろ憫?yīng)中表達(dá)水平存在顯著的差異。研究結(jié)果為進(jìn)一步分析黃瓜熱激轉(zhuǎn)錄因子奠定了基礎(chǔ)。

黃瓜; 熱激轉(zhuǎn)錄因子; 生物信息學(xué); 耐熱性

轉(zhuǎn)錄因子又稱(chēng)反式作用因子, 其主要功能是激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄, 在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育以及對(duì)環(huán)境的響應(yīng)中起重要作用[1]。熱激轉(zhuǎn)錄因子(Heat shock factors, HSFs)是近年來(lái)在植物中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子, 廣泛分布于植物細(xì)胞內(nèi), 在熱脅迫下可以激活熱激基因表達(dá), 作為植物轉(zhuǎn)錄水平上熱脅迫響應(yīng)基因的中心元件, 在植物熱脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及耐熱性調(diào)控中起著關(guān)鍵作用[2]。研究表明, 熱激轉(zhuǎn)錄因子基因和啟動(dòng)子識(shí)別序列都是高度保守的。典型的熱激轉(zhuǎn)錄因子一般包括4個(gè)部分：N端的DNA結(jié)合域(DNA binding domain, DBD)、寡聚化結(jié)構(gòu)域(HR-A/B)、細(xì)胞核定位信號(hào)(Nuclear localization signal, NLS)、細(xì)胞核輸出信號(hào)(Nuclear export signal, NES), 少數(shù)還具有一個(gè) C端激活域 (C-terminal activation domain, CTAD)。植物熱激因子通過(guò)形成回文發(fā)卡結(jié)構(gòu), 特異地結(jié)合高度保守的熱激元件, 從而控制熱激蛋白的表達(dá)[3]。另外, 根據(jù)保守DBD和HR-A/B區(qū)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn), 熱激轉(zhuǎn)錄因子又可以分為A、B和C 3類(lèi)。這三類(lèi)基因的主要區(qū)別表現(xiàn)為：B類(lèi)基因HR-A/B結(jié)構(gòu)域中A和B結(jié)構(gòu)域之間只有7個(gè)氨基酸殘基, 在A類(lèi)和C類(lèi)中, 除了這7個(gè)氨基酸, 還分別有21個(gè)和7個(gè)氨基酸的插入; 另外, CTAD和NES的結(jié)合區(qū)域是A類(lèi)HSFs所特有的結(jié)構(gòu), B類(lèi)和C類(lèi)均不包含CTAD結(jié)構(gòu)域。最早的熱激轉(zhuǎn)錄因子基因在酵母中被克隆得到, 隨后在果蠅(Drosophila melanogaster )和哺乳動(dòng)物中, 這些熱激轉(zhuǎn)錄因子也相繼被克隆[12]。植物中的熱激轉(zhuǎn)錄因子基因首先在番茄(Solanum lycopersicum L.)中克隆得到[13], 隨后在擬南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)中也克隆得到相應(yīng)基因[14,15], 目前在擬南芥、水稻、玉米(Zea mays L.)、蘋(píng)果(Malus pumila Mill.)、楊樹(shù)(Populus adenopoda Maxim.)和大豆(Glycine max L.)中也相繼開(kāi)展了該基因家族的研究[16～20]。番茄(S. lycopersicum)中HSFA1a是調(diào)節(jié)熱激反應(yīng)(Heat shock response, HSR)的關(guān)鍵因子[4], 同時(shí)HSFA2、HSFA3也具有抵抗熱激反應(yīng)的功能[5,6];在擬南芥和向日葵(Helianthus annuus L.)中, HSFA9參與胚胎發(fā)育和種子成熟等生命活動(dòng)[7,8]; 擬南芥HSFA2具有耐熱功能[9]; 水稻 HSFA4a則能提高鎘的耐受性[10]。大豆HSFA1基因GmHSFA1的過(guò)量表達(dá)激活或促進(jìn)其下游 3 個(gè)熱激蛋白基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá), 明顯提高了轉(zhuǎn)基因大豆植株的耐熱能力[11]。這些研究都表明, 植物 HSFs不僅是植物耐熱機(jī)制的重要因子, 同時(shí)也參與植物重要的生命活動(dòng), 對(duì)于提高植物抗性具有重要意義。

黃瓜(Cucumis sativus L.)是一種重要的蔬菜作物, 起源于亞熱帶或熱帶, 喜溫, 但不耐熱, 在夏季栽培或保護(hù)地生產(chǎn)中, 高溫是影響其產(chǎn)量和品質(zhì)的主要非生物脅迫因素之一[21]。然而, 目前還未見(jiàn)黃瓜中有關(guān)HSFs基因的研究報(bào)道。黃瓜全基因組測(cè)序工作的完成, 為其遺傳育種及相關(guān)基因的生物功能鑒定提供了重要的信息參考。本研究利用生物信息學(xué)方法, 在黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索HSFs基因, 分析這些基因的數(shù)量、序列特征、染色體定位以及進(jìn)化關(guān)系等, 研究結(jié)果不僅有助于鑒定黃瓜 HSFs基因家族的功能, 還可進(jìn)一步為培育黃瓜耐熱新品種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

以本實(shí)驗(yàn)室選育的黃瓜自交系‘072-5’為研究材料, 催芽后種植于穴盤(pán)內(nèi), 放置在人工氣候室, 白天25℃、晚間18℃。參考楊寅貴等[21]的研究方法,在4葉期進(jìn)行42℃耐熱處理, 分別取處理0 h和2 h的葉片樣品。每個(gè)取樣點(diǎn)設(shè) 3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。取后立即放液氮速凍, 后貯存于-80℃超低溫冰箱待用。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成

用RNA Pure Plant提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取黃瓜葉片中的總 RNA, 而后用 DNaseⅠ、RNase-free(fermentas)消除 DNA 的污染, 利用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)合成 cDNA 第一鏈。

1.2.2 數(shù)據(jù)檢索

從數(shù)據(jù)庫(kù) http://cucumber.genomics.org.cn/page/ cucumber/index.jsp中下載黃瓜 HSF全基因組數(shù)據(jù),從數(shù)據(jù)庫(kù) http://datf.cbi.pku.edu.cn/下載擬南芥 HSF的基因序列。

1.2.3 黃瓜 HSFs基因家族成員的鑒定與保守基序分析

首先使用 DNATOOLS軟件對(duì)獲得的黃瓜全基因組氨基酸序列數(shù)據(jù)建立數(shù)據(jù)庫(kù), 然后利用Pfam數(shù)據(jù)庫(kù) (http://pfam.sanger. ac.uk/)中的登錄號(hào)PF00447下載 HSFs基因的隱馬爾可夫模型(Hidden Markov Model, HMM)文件, 獲得氨基酸殘基的HSFs蛋白的保守結(jié)構(gòu)域, 用 HSFs結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與已建立的黃瓜全基因組氨基酸序列進(jìn)行 Blast (E-value =0.001)序列比對(duì), 初步篩選出同源氨基酸序列的候選基因, 將這些基因通過(guò)Pfam (E-value =1.0) 進(jìn)行分析, 去除無(wú)HSFs保守結(jié)構(gòu)域的基因序列; 再將候選的HSFs基因序列通過(guò)MEGA 5.0[22]軟件提供的Clustal W 工具進(jìn)行多序列比對(duì), 去除重復(fù)序列。

1.2.4 黃瓜HSFs基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

轉(zhuǎn)錄因子基因家族通常含有高度保守的功能域或有DNA結(jié)合功能的保守域。根據(jù)預(yù)測(cè)得到的黃瓜HSFs基因氨基酸保守序列進(jìn)行聚類(lèi)分析。利用Clustal X (2.0)[23]軟件對(duì)黃瓜和擬南芥的HSFs蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì), 參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。然后, 通過(guò)MEGA 5.0[22]軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建, 采用鄰接法(Neighbor-joining method)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù), 自舉檢測(cè)(Bootstrap)次數(shù)為1000。

1.2.5 黃瓜HSFs基因結(jié)構(gòu)分析和染色體定位

黃瓜HSFs基因的登錄號(hào)、所在染色體、基因組位置等信息從黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得, 蛋白質(zhì)分子量、等電點(diǎn)等參數(shù)用 ProtParam 工具(http://www. expasy. org/tools/protparam)估算。登陸GSDS服務(wù)器(Gene Structure Display Server, http://gsds.cbi.pku. edu.cn)獲得基因的結(jié)構(gòu)[24]。將每個(gè) HSFs基因與黃瓜全基因組進(jìn)行Blast搜索, 尋找最匹配的染色體位置, 從而確定每個(gè) HSFs類(lèi)型基因在染色體上的具體位置。

1.2.6 HSFs轉(zhuǎn)錄因子的EST分析

由葫蘆科數(shù)據(jù)庫(kù) http://www.icugi.org/cgi-bin/ ICuGI/EST/home.cgi?organism=cucumber下載黃瓜的EST數(shù)據(jù)。這些EST數(shù)據(jù)主要來(lái)源于不同性型的花和不同時(shí)期的果實(shí), 共513 801條。將黃瓜HSFs的核苷酸序列作為靶序列, 對(duì)葫蘆科網(wǎng)站黃瓜 EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST檢索, 分析黃瓜HSFs基因在果實(shí)、雌花、兩性花和雄花的表達(dá)情況。參數(shù)設(shè)置為：同源性大于95%, 長(zhǎng)度大于200 bp, E值小于10-10。

1.2.7 黃瓜HSF基因家族成員的表達(dá)分析

利用軟件Primer Premier 6.0 對(duì)黃瓜HSF轉(zhuǎn)錄因子基因設(shè)計(jì)特異引物(表1), 引物的位置不能位于HSF轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域, 并用軟件Oligo 6.0評(píng)估調(diào)整引物, 由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

以 Actin(DQ115883)為內(nèi)參基因, 正向引物為5′-GGTGGTGAACATGTAACCTC-3′, 反向引物為5′-TTCTGGTGATGGTGTGAGTC-3′。

按照SYBR Premix Ex TaqTM 試劑盒(購(gòu)自寶生物工程有限公司)操作指導(dǎo), 在 Bio-Rad 公司的My-IQ2 熒光定量PCR儀上檢測(cè)基因的表達(dá)量?？偡磻?yīng)體系為 20 μL：10 μL SYBR premix Ex TaqTM(2×)混合液, 1 μL cDNA, 1 μL上游引物(10 μmol/L), 1 μL下游引物(10 μmol/L), 7 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s; 95℃變性5 s, 60℃復(fù)性30 s, 40個(gè)循環(huán), 在60℃采集熒光。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

基因表達(dá)水平的計(jì)算參照 Livak和 Schmittgen (2001)的2-ΔΔCT法[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜HSFs基因的序列特征

經(jīng)BLASTp同源搜索和Pfam在線(xiàn)工具分析結(jié)構(gòu)域, 共獲得21條具典型HSF結(jié)構(gòu)域的序列。基因組全長(zhǎng)982～4294 bp, 其中以Csa019047的序列最長(zhǎng),為4294 bp; Csa008853的序列最短, 為982 bp。編碼蛋白序列含184～560個(gè)氨基酸, Csa019876的編碼區(qū)(Coding sequences, CDS)全長(zhǎng)為555 bp, 編碼蛋白序列最短, 為184個(gè)氨基酸; 而Csa005086的CDS最長(zhǎng), 為 1683 bp, 編碼 560個(gè)氨基酸。分子量約為21.2～62.3 kDa, Csa019876 最小, 為 21.2 kDa, Csa005086最大, 為62.29 kDa。等電點(diǎn)變化從4.70～9.10, Csa012865等電點(diǎn)最小, 為4.70, Csa002380等電點(diǎn)最大, 為9.10, 并且發(fā)現(xiàn), 大多數(shù)HSFs蛋白的等電點(diǎn)位于5左右, 即呈酸性形式存在(表2)。

2.2 黃瓜HSFs基因序列比對(duì)

為了揭示黃瓜 HSFs基因家族成員之間序列保守性特征, 本研究將獲得的21條HSFs氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在所有參與比對(duì)的氨基酸中, DBD(DNA binding domain)區(qū)域在進(jìn)化過(guò)程中具有高度的保守性(圖 1A)。DNA 結(jié)合域?yàn)檗D(zhuǎn)錄激活的功能區(qū), 主要負(fù)責(zé) HSFs識(shí)別熱激元件并與其正確結(jié)合, 進(jìn)一步將DBD區(qū)域氨基酸殘基進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè), 除了HSFs Csa012865和Csa019876之外, 發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的HSFs DBD區(qū)域均包含3個(gè)a螺旋(a1～a3)和4個(gè)β(β1～β4)折疊(圖1B)。這在其他植物研究中也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的現(xiàn)象[16～20]。多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn), 這兩個(gè)HSFs在β3、β4區(qū)域發(fā)生氨基酸序列丟失現(xiàn)象。此外, 對(duì)其在21個(gè)HSFs的 DBD區(qū)域編碼95個(gè)氨基酸殘基中, 約 21%(20個(gè))氨基酸殘基在進(jìn)化過(guò)程中完全保持一致(PFKDWFLPFKHNFSFRQLNTY) (圖1C), 表現(xiàn)出完全保守。

2.3 黃瓜HSFs基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

為了揭示黃瓜 HSFs基因在進(jìn)化過(guò)程中的同源關(guān)系, 將黃瓜的21個(gè)HSFs氨基酸序列與擬南芥中的22個(gè)HSFs氨基酸序列進(jìn)行聚類(lèi)分析(圖2)。結(jié)果顯示, 所有的HSFs基因可分為3大分支(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ),其中Ⅰ分支又可分為4個(gè)亞類(lèi)(A、B、C、D)。在A類(lèi)中, 黃瓜的 Csa026480、Csa014653、Csa016743與擬南芥中At3g51910、At3g63350具有較高的同源性而聚集在一起, 其中Csa026480 與Csa014653為旁系同源蛋白, 而Csa000108、Csa011545分別與擬南芥 At3g63350、At2g26150為直系同源蛋白。在B類(lèi)和C類(lèi)中, Csa019047、Csa010629、Csa009195、Csa005086、Csa021238分別與At4g17750、At1g67970、At5g54070、At5g03720、At3g24520為直系同源蛋白,而黃瓜Csa006876、Csa021238和擬南芥At3g24520有很高的同源性聚集在一起。在Ⅱ分支中, Csa012865、Csa006414分別與At4g11660、At1g46264為直系同源蛋白, Csa009386、Csa019876分別與Csa011478、Csa002380為旁系同源蛋白。而Csa011800、Csa017341與擬南芥 At4g13980、At4g18880、At5g45710、At4g18870同源性較高聚為第Ⅲ分支。在黃瓜的 21個(gè)HSFs蛋白序列中, 共有9對(duì)直系同源蛋白, 3對(duì)旁系同源蛋白。通過(guò)進(jìn)化關(guān)系可以說(shuō)明, HSFs蛋白序列多樣性應(yīng)該發(fā)生在黃瓜和擬南芥分化之前。

表1 黃瓜熱激轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)分析引物序列及片段大小

表2 黃瓜HSFs基因家族成員的基本特征

2.4 黃瓜HSFs基因的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)圖

本文從黃瓜數(shù)據(jù)庫(kù)獲得每一個(gè)HSF的基因組序列和編碼區(qū)序列, 借助于在線(xiàn)工具 GSDS(http:// gsds.cbi.pku.edu.cn)繪制其內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)圖(圖3)。黃瓜HSF基因家族成員的內(nèi)含子數(shù)量很少,為 1～3個(gè), 其中 Csa012865內(nèi)含子數(shù)目最多, 為 3個(gè), Csa000108、Csa006414有2個(gè)內(nèi)含子, 其他18個(gè)HSFs基因家族成員內(nèi)含子數(shù)量均為1。然而每一個(gè)HSFs基因內(nèi)含子長(zhǎng)度大小差異很大。

2.5 黃瓜HSFs基因的染色體定位

為了明確各基因在不同染色體上的分布, 根據(jù)黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中基因位置信息, 對(duì)所鑒定的 21個(gè) HSFs基因進(jìn)行染色體定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 除Csa026480在公布的黃瓜測(cè)序結(jié)果中未能定位到具體的染色體上(位于 Scaffold_repeat037858), 其余HSFs基因在黃瓜的染色體上呈不均勻分布(圖 4)。其中2、3號(hào)染色體分布最多, 均為5個(gè), 7號(hào)染色體上分布最少, 為1個(gè), 1號(hào)染色體上有3個(gè)HSFs基因, 4、5、6號(hào)染色體上均有2個(gè)HSFs基因。

圖1 黃瓜HSFs基因的多序列比對(duì)A：21個(gè)HSFs基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì); B：HSFs DBD區(qū)域多序列; C：HSFs DBD結(jié)構(gòu)域的logo圖。

2.6 HSFs轉(zhuǎn)錄因子的EST分析

為了分析黃瓜 HSFs基因的表達(dá)模式, 使用BLAST程序搜索葫蘆科網(wǎng)站黃瓜的 EST數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/tool/blast.cgi)。在葫蘆科基因組的ESTs數(shù)據(jù)庫(kù)中, 共具有513,801個(gè)黃瓜ESTs序列, 分別來(lái)自黃瓜的不同組織類(lèi)型, 包括果實(shí)、雌花、雄花和兩性花, 沒(méi)有葉片、根等營(yíng)養(yǎng)器官的EST數(shù)據(jù)。如表3所示, 黃瓜21個(gè)HSFs基因中, 12個(gè)HSFs在這4個(gè)組織中都有表達(dá), 但每一個(gè)HSFs檢索到的EST數(shù)目是變異的(1～5); 其中,與Csa019047和Csa012865對(duì)應(yīng)的ESTs最多, 達(dá)到5個(gè), 而Csa016743最少, 僅為1個(gè), 其次Csa000108、Csa005086、Csa009386、Csa011478、Csa017341、Csa021238、Csa026480、Csa014653、Csa002380的 ESTs數(shù)量依次為3、3、2、4、2、2、3、3、2。21個(gè)HSFs基因中ESTs的分布依次是：果實(shí)8個(gè), 雌花 6個(gè), 兩性花 5個(gè), 而雄花中均沒(méi)有檢測(cè)到 EST的存在。

2.6 HSFs轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)分析

圖2 黃瓜和擬南芥HSFs基因氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

圖3 黃瓜HSFs基因的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)圖

圖4 黃瓜HSFs基因的染色體定位

表 3 基于葫蘆科基因組的黃瓜 HSFs轉(zhuǎn)錄因子 EST分析

為了檢測(cè)黃瓜HSF轉(zhuǎn)錄因子在葉片中是否表達(dá)以及確定對(duì)逆境脅迫的反應(yīng), 本文利用qRT-PCR分析了21個(gè)HSF轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示, 除了Csa026480外, 其余的20個(gè)HSF轉(zhuǎn)錄因子在黃瓜葉片中都具有轉(zhuǎn)錄活性; 并且在熱激脅迫下, 這些轉(zhuǎn)錄因子具有不同的表達(dá)模式。大部分的基因表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá), 且 11個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在熱激誘導(dǎo)過(guò)程中,他們的表達(dá)水平得到顯著地提高(＞2倍); 6個(gè)HSF轉(zhuǎn)錄因子(Csa019047、Csa0112865、Csa009195、 Csa014653、Csa006414、Csa002380)在正常的黃瓜葉片中是微量表達(dá)的, 然而, 在熱激2小時(shí)后, 這些基因的表達(dá)得到明顯的增強(qiáng)。4個(gè) HSF轉(zhuǎn)錄因子(Csa006876、Csa008853、Csa005086、Csa0116743)在正常葉片和熱激后表達(dá)量無(wú)明顯差異。此外, 5個(gè)HSF轉(zhuǎn)錄因子(Csa011800、 Csa011545、Csa010236、Csa009386、Csa021238)在熱激誘導(dǎo)過(guò)程中, 他們的表達(dá)水平表現(xiàn)為下調(diào)(＜0.5倍)。

3 討 論

隨著植物基因組研究的深入, 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物基因表達(dá)的研究成為現(xiàn)今植物基因功能研究的熱點(diǎn)之一。植物熱激轉(zhuǎn)錄因子家族成員在調(diào)節(jié)分子和細(xì)胞抵御脅迫方面具有關(guān)鍵作用[26,27], 不同植物種類(lèi)的HSF基因家族成員及大小已得到分析[27], 擬南芥、番茄、水稻, 玉米、蘋(píng)果、楊樹(shù)和大豆中分別含有21、27、25、30、25、27、52個(gè)HSFs。目前擬南芥是 HSFs家族成員數(shù)目最少的植物, 只有 21個(gè), 而包含 52個(gè) HSFs的大豆是最多的, 被子植物的 HSFs家族成員的多樣性可能是植物在進(jìn)化的不同時(shí)期發(fā)生了基因重復(fù)和基因組重復(fù)[28]。近年來(lái),黃瓜基因組測(cè)序的完成為我們?cè)谌蚪M水平上分析熱激轉(zhuǎn)錄因子奠定了基礎(chǔ)[29]。本研究基于黃瓜全基因組測(cè)序的完成, 對(duì)黃瓜全基因組進(jìn)行BLASP搜索, 共鑒定出21個(gè)具有典型HSF結(jié)構(gòu)域的熱激轉(zhuǎn)錄因子。通過(guò)與擬南芥轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析,將其分為 3類(lèi)(Ⅰ～Ⅲ), 每一類(lèi)含有的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目是變異的, 表明HSF轉(zhuǎn)錄因子家族成員分布是不均勻的, 他們之間存在著廣泛的多樣性, 這將為深入研究HSFs的功能奠定基礎(chǔ)。

圖5 黃瓜HSFs基因在葉片熱激條件下的表達(dá)模式

熱激轉(zhuǎn)錄因子 N端的 DBD結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)HSFs識(shí)別熱激元件并與其正確結(jié)合, 即轉(zhuǎn)錄激活的功能區(qū)[30], 黃瓜HSFs多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn), DBD結(jié)構(gòu)域具有高度的保守性, 二級(jí)結(jié)構(gòu)由3個(gè)α螺旋和4個(gè)β折疊組成, 這與Carl等[30]的研究結(jié)果一致。此外, 盡管黃瓜和擬南芥具有相同數(shù)目的HSFs, 但是從黃瓜與擬南芥HSFs系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系發(fā)現(xiàn), 存在9對(duì)直系同源蛋白和3對(duì)旁系同源蛋白, 表明黃瓜HSFs基因在黃瓜和擬南芥分化之前就已經(jīng)構(gòu)建, 并且在在各自物種進(jìn)化過(guò)程中進(jìn)行了擴(kuò)展。這種現(xiàn)象在植物其他基因家族的研究中也得到了廣泛的驗(yàn)證[31～33]。前期研究表明, 基因家族成員可以通過(guò)串聯(lián)重復(fù)擴(kuò)展成簇存在于染色體上, 或者通過(guò)片段重復(fù)分散于不同的染色體上[34]。本研究發(fā)現(xiàn), 黃瓜HSFs以分散形式分布于黃瓜 7條染色體上, 表明他們?cè)谶M(jìn)化過(guò)程中可能經(jīng)歷片段重復(fù)事件。

另外, 為了分析黃瓜HSFs基因的表達(dá)情況, 本研究進(jìn)一步利用葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫(kù), 發(fā)現(xiàn)共有 12個(gè)基因檢索到了相應(yīng)的EST序列, 分別來(lái)自于黃瓜果實(shí)、雌花、兩性花, 而雄花中沒(méi)有檢測(cè)到HSFs基因的ESTs序列, 表明這些基因在黃瓜果實(shí)、雌花和兩性花中得到表達(dá), 可能參與了雌花形成和果實(shí)發(fā)育。此外, 本研究還運(yùn)用qRT-PCR方法分析了HSF轉(zhuǎn)錄因子在熱激脅迫下的表達(dá)模式, 大部分的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量得到顯著上升, 尤其是 Csa019047、Csa0112865、Csa009195、Csa014653、Csa006414和Csa002380的表達(dá)量都提高2倍以上, 表明了這些轉(zhuǎn)錄因子參與了黃瓜苗期葉片應(yīng)對(duì)熱激脅迫的反應(yīng),在調(diào)節(jié)黃瓜對(duì)熱激的反應(yīng)過(guò)程中具有重要的作用。

總之, 近幾年的研究表明, HSFs不僅參與植物熱脅迫的調(diào)控, 還參與了其他逆境脅迫的調(diào)節(jié), 如氧化脅迫[35,36], 但HSFs上游調(diào)控的機(jī)制尚不清楚。本文基于黃瓜全基因組測(cè)序的完成, 鑒定并分析了黃瓜HSFs的基因結(jié)構(gòu), 進(jìn)化關(guān)系、染色體定位以及表達(dá)模式等信息, 為未來(lái)解析熱激轉(zhuǎn)錄因子在黃瓜耐熱性機(jī)理方面奠定基礎(chǔ), 也為深入了解黃瓜熱激轉(zhuǎn)錄因子在黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育和其他逆境脅迫中作用提供基因資源和初步依據(jù)。

[1] Arce AL, Gabello JV, Chan RL. Patents on plant transcription factors. Recent Pat Biotechnol, 2008, 2(3): 209-217.

[2] 秦丹丹, 彭惠茹, 倪中福, 許甫超, 董靜, 張俊成, 孫其信, 李梅芳. 植物熱激轉(zhuǎn)錄因子及其與耐熱性關(guān)系的研究進(jìn)展. 麥類(lèi)作物學(xué)報(bào), 2012, 32(1): 178-183.

[3] Baniwal SK, Bharti K, Chan KY, Fauth M, Ganguli A, Kotak S, Mishra SK, Nover L, Port M, Scharf KD, Tripp J, Weber C, Zielinski D, von Koskull-D?ring P. Heat stress response in plants: a complex game with chaperones and more than twenty heat transcription factors. J Biosci, 2004, 29(4): 471-487.

[4] Mishra SK, Tripp J, Winkelhaus S, Tschiersch B, Theres K, Nover L, Scharf KD. In the complex family of heat stress transcription factors, HsfA1 has a unique role as master regulator of thermotolerance in tomato. Genes Dev, 2002, 16(12): 1555-1567.

[5] Scharf KD, Heider H, H?hfeld I, Lyck R, Schmidt E, Nover L. The tomato Hsf system: HsfA2 needs interaction with HsfA1 for efficient nuclear import and may be localized in cytoplasmic heat stress granules. Mol Cell Biol, 1998, 18(4): 2240-2251.

[6] Bharti K, Schmidt E, Lyck R, Heerklotz D, Bublak D, Scharf KD. Isolation and characterization of HsfA3, a new heat stress transcription factor of Lycopersicon peruvianum. Plant J, 2000, 22(4): 355-365.

[7] Almoguera C, Rojas A, D??az-Mart??n J, Prieto-Dapena P, Carranco R, Jordano J. A seed-specific heat-shock transcription factor involved in developmental regulation during embryogenesis in sunflower. J Biol Chem, 2002, 277(46): 43866-43872.

[8] Kotak S, Vierling E, B?umlein H, von Koskull-D?ring P. A novel transcriptional cascade regulating expression of heat stress proteins during seed development of Arabidopsis. Plant Cell, 2007, 19(1): 182-195.

[9] Qin F, Kakimoto M, Sakuma Y, Maruyama K, Osakabe Y, Tran LS, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. Regulation and functional analysis of ZmDREB2A in response to drought and heat stresses in Zea mays L. Plant J, 2007, 50(1): 54-69.

[10] Shim D, Hwang JU, Lee J, Lee S, Choi Y, An G, Martinoia E, Lee Y. Orthologs of the class A4 heat shock transcription factor HsfA4a confer cadmium tolerance in wheat and rice. Plant Cell, 2009, 21(12): 4031-4043.

[11] 陳曉軍, 葉春江, 呂慧穎, 徐民新, 李葳, 張利明, 王超,羅淑萍, 朱保葛. GmHSFA1基因克隆及其過(guò)量表達(dá)提高轉(zhuǎn)基因大豆的耐熱性. 遺傳, 2006, 28(11): 1411-1420.

[12] Wiederrecht G, Seto D, Parkker CS. Isolation of the gene encoding the S. cerevisiae heat shock transcription factor. Cell, 1988, 54(6): 841-853.

[13] Nover L, Bharti K, Doring P, Mishra SK, Ganguli A, Scharf KD. Arabidopsis and the heat stress transcription factor world: how many heat stress transcription factors do we need?. Cell Stress and Chaperones, 2001, 6(3): 177-189.

[14] Huhel A, Schoffl F. Arabidopsis heat shock factor: isolation and characterization of the gene and the recombinant protein. Plant Mol Biol, 1994, 26(1): 353-362.

[15] Yamanouchi U, Yano M, Lin H, Ashikari M, Yamada K. A rice spotted leaf gene, Spl7, encodes a heat stress transcription factor protein. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(11): 7530-7535.

[16] Guo J, Wu J, Ji Q, Wang C, Luo L, Yuan Y, Wang Y, Wang J. Genome-wide analysis of heat shock transcription factor families in rice and Arabidopsis. J Genet Genomics, 2008, 35(2), 105-118.

[17] Lin YX, Jiang HY, Chu ZX, Tang XL, Zhu SW, Cheng BJ. Genome-wide identification, classification and analysis of heat shock transcription factor family in maize. BMC Genomics, 2011, 12(1): 76.

[18] Wang F, Dong Q, Jiang H, Zhu S, Chen B, Xiang Y. Genome-wide analysis of the heat shock transcription factors in Populus trichocarpa and Medicago truncatula. Mol Biol Rep, 2012, 39(2): 1877-1886.

[19] Giorno F, Guerriero G, Baric S, Mariani C. Heat shock transcriptional factors in Malus domestica: identification, classification and expression analysis. BMC Genomics, 2012, 13(1): 639.

[20] Chung E, Kim KM, Lee JH. Genome-wide analysis and molecular characterization of heat shock transcription factor family in Glycine max. J Genet Genomics, 2013, 40(3): 127-135.

[21] 楊寅貴. 黃瓜耐熱性及熱脅迫響應(yīng)基因研究[學(xué)位論文].南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

[22] Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol, 2011, 28(10): 2731-2739.

[23] Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG. Clustal W and Clustal X version 2. 0. Bioinformatics, 2007, 23(21): 2947-2948.

[24] 郭安源, 朱其慧, 陳新, 羅靜初. GSDS: 基因結(jié)構(gòu)顯示系統(tǒng). 遺傳, 2007, 29(8): 1023-1026.

[25] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTMethod. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[26] von Koskull-D?ring P, Scharf K D, Nover L. The diversity of plant heat stress transcription factors. Trends Plant Sci, 2007, 12(10): 452-457.

[27] Scharf KD, Berberich T, Ebersberger I, Nover L. The plant heat stress transcription factor (Hsf) family: structure, function and evolution. Biochim Biophys Acta, 2012, 1819(2): 104-119.

[28] Schmutz J, Cannon SB, Schlueter J, Ma J, Mitros T, Nelson W, Hyten DL, Song Q, Thelen JJ, Cheng J, Xu D, Hellsten U, May GD, Yu Y, Sakurai T, Umezawa T, Bhattacharyya MK, Sandhu D, Valliyodan B, Lindquist E, Peto M, Grant D, Shu S, Goodstein D, Barry K, Futrell-Griggs M, Abernathy B, Du J, Tian Z, Zhu L, Gill N, Joshi T, Libault M, Sethuraman A, Zhang XC, Shinozaki K, Nguyen HT, Wing RA, Cregan P, Specht J, Grimwood J, Rokhsar D, Stacey G, Shoemaker RC, Jackson SA. Genome sequence of the palaeopolyploid soybean. Nature, 2010, 463(7278): 178-183.

[29] Huang S, Li R, Zhang Z, Li L, Gu X, Fan W, Lucas WJ, Wang X, Xie B, Ni P, Ren Y, Zhu H, Li J, Lin K, Jin W, Fei Z, Li G, Staub J, Kilian A, van der Vossen EA, Wu Y, Guo J, He J, Jia Z, Ren Y, Tian G, Lu Y, Ruan J, Qian W, Wang M, Huang Q, Li B, Xuan Z, Cao J, Asan, Wu Z, Zhang J, Cai Q, Bai Y, Zhao B, Han Y, Li Y, Li X, Wang S, Shi Q, Liu S, Cho WK, Kim JY, Xu Y, Heller-Uszynska K, Miao H, Cheng Z, Zhang S, Wu J, Yang Y, Kang H, Li M, Liang H, Ren X, Shi Z, Wen M, Jian M, Yang H, Zhang G, Yang Z, Chen R, Liu S, Li J, Ma L, Liu H, Zhou Y, Zhao J, Fang X, Li G, Fang L, Li Y, Liu D, Zheng H, Zhang Y, Qin N, Li Z, Yang G, Yang S, Bolund L, Kristiansen K, Zheng H, Li S, Zhang X, Yang H, Wang J, Sun R, Zhang B, Jiang S, Wang J, Du Y, Li S. The genome of the cucumber, Cucumis sativus L. Nat Genet, 2009, 41(12): 1275-1281.

[30] Wu C. Heat shock transcription factors: structure and regulation. Annu Rev Cell Dev Biol, 1995, 11: 441-469.

[31] Bai J, Pennill L A, Ning J, Lee SW, Ramalingam J, Webb CA, Zhao B, Sun Q, Nelson JC, Leach JE, Hulbert SH. Diversity in nucleotide binding site-leucine-rich repeat genes in cereals. Genome Res, 2002, 12(12): 1871-1884.

[32] Zhang SB, Chen C, Li L, Meng L, Singh J, Jiang N, Deng XW, He ZH, Lemaux PG. Evolutionary expansion, gene structure, and expression of the rice wall-associated kinase gene family. Plant Physiol, 2005, 139(3): 1107-1124.

[33] Jain M, Tyagi AK, Khurana JP. Genome-wide analysis, evolutionary expansion, and expression of early auxinresponsive SAUR gene family in rice (Oryza sativa). Genomics, 2006, 88(3): 360-371.

[34] Nover L, Scharf KD, Gagliardi D, Vergne P, Czarnecka-Verner E, Gurley WB. The Hsf world: classification and properties of plant heat stress transcription factors. Cell Stress Chaperones, 1996, 1(4): 215-223.

[35] Busch W, Wunderlich M, Sch?ffl F. Identification of novel heat shock factor-dependent genes and biochemical pathways in Arabidopsis thaliana. Plant J, 2005, 41(1): 1-14.

[36] Panchuk II, Voikov R A, Schoffl F. Heat stress-and-heat shock transcription factor-dependent expression and activity of ascorbate peroxidase in Arabidopsis. Plant Physiol, 2002, 129(2): 838-853.

(責(zé)任編委: 李紹武)

Genome-wide identification, sequence characteristic and expression analysis of heat shock factors (HSFs) in cucumber

Xianzhi Chen1,2, Yan Wang1,2, Jianlei Shi1,2, Longjing Zhu1,2, Kelei Wang1,2, Jian Xu1,2

1. Wenzhou Vocation College of Science & Technology, Wenzhou 325006, China;
2. Wenzhou Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Crop Breeding in South Zhejiang, Wenzhou 325006, China

Heat shock factors (HSFs) are ubiquitous in eukaryotes with diversification in structural feature and biological function in plants. Based on the availability of whole cucumber genome sequences, we characterized the cucumber HSFs gene family which contains at least 21 members. Sequence alignments show that all HSFs possess a specific DNA binding domain (DBD). These HSFs genes are unevenly distributed in the seven cucumber chromosomes except for Csa026480 (located on Scaffold_repeat037858). Phylogenetic analysis shows that HSFs in cucumber could be divided into three fami-lies, in which family I included three categories (A, B and C). Phylogenetic tree also reveals nine pairs of orthologous genes and three pairs of paralogous genes, suggesting that HSFs gene family have existed before the separation of cucumber and Arabidopsis thaliana. EST analysis shows that cucumber HSFs may be involved in the development of fruit, female flower and hermaphrodite flower. qRT-PCR analysis demonstrated that these genes exhibit different expression levels in heat stress treatment. These results will provide a foundation for the functions of the HSF gene family.

cucumber; heat shock factors; bioinformatics; heat resistance

2013-10-30;

2013-12-10

溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：N20090017)和大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系經(jīng)費(fèi)(編號(hào)：CARS-25)資助

陳先知, 碩士, 助理研究員, 研究方向：瓜類(lèi)蔬菜育種與栽培生理。E-mail: 53186029@qq.com

徐堅(jiān), 副研究員, 研究方向：蔬菜栽培生理。E-mail: zwxuj@qq.com

10.3724/SP.J.1005.2014.0376

時(shí)間: 2014-3-3 12:41:40

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140303.1241.002.html