侯貞秀，李 哲

心肌細胞在缺氧／復(fù)氧過程中有不同程度的自噬參與。在缺氧／復(fù)氧的不同階段，自噬所起的作用不同。在缺氧期，自噬主要起保護作用，而復(fù)氧期則主要起損傷作用［1，2］。如何通過抑制自噬降低缺氧／復(fù)氧心肌細胞的死亡，提高其存活率，是目前研究的熱點［3］。本文采用體外培養(yǎng)心肌細胞，建立缺氧／復(fù)氧模型，模擬在體缺血／再灌注損傷過程，從基因水平上觀察心肌細胞在缺氧／復(fù)氧過程中給予維拉帕米后對心肌細胞的保護作用。為缺血／再灌注心肌細胞的進一步治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 購自博研（上海）生物科技有限公司。

1.2 主要藥品與試劑 鹽酸維拉帕米注射液購自上海禾豐制藥有限公司；胎牛血清購自四季青，浙江天杭生物科技有限公司；DMEM 購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；Trizonal購自北京康為世紀生物科技有限公司；PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；PCR 引物由生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計；3－MA 購自selleckchem 公司；連二亞硫酸鈉購自sigma公司；DMSO 購自sigma公司；MTT（四氮唑藍）Amresco公司；SYBR 染料購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。主要儀器，LS－B50L型立式壓力蒸氣滅菌器：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠L－550型臺式低速大容量離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；倒置顯微鏡：上海電子儀器廠二氧化碳培養(yǎng)箱：Heraeus公司；德國AB104－N 型電子天平：上海電子儀器廠；SW－CJ－2F超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司Q－PCR儀：美國BIO－RAD公司。

1.3 乳鼠心肌細胞的培養(yǎng) H9c2心肌細胞復(fù)蘇后置于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察心肌細胞的形態(tài)，隔天用D－Hanks液為心肌細胞換液，生長至約80%時，傳代培養(yǎng)，采用第3代～4代心肌細胞進行實驗。

1.4 建立缺氧／復(fù)氧模型及實驗分組 缺氧／復(fù)氧模型的建立［4］：采用連二亞硫酸鈉化學(xué)法，用D－Hanks液將其配成濃度為18g／L，分裝，置－20℃冰箱中保存，臨用時稀釋成終濃度為5mmol／L，加入DMEM 培養(yǎng)液中，制成缺氧液。用缺氧液換用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)1h，模擬缺氧過程，再換用正常DMEM 培養(yǎng)液（復(fù)氧液）培養(yǎng)4h，模擬復(fù)氧過程。將培養(yǎng)第3代～4代傳代心肌細胞隨機分為5組，空白對照組：正常DMEM 培養(yǎng)基＋胎牛血清培養(yǎng)；缺氧／復(fù)氧組［4］：將DMEM 培養(yǎng)液換成缺氧液培養(yǎng)1h，再換用復(fù)氧液培養(yǎng)4h，即為缺氧／復(fù)氧處理。缺氧／復(fù)氧＋3－MA 組：在缺氧液中加入終濃度為5mmol／L［5］的3－MA 培養(yǎng)1h［6］，再換用終濃度為5mmol／L的3－MA 復(fù)氧液培養(yǎng)4h。缺氧／復(fù)氧＋維拉帕米組：在缺氧液中加入終濃度為1mg／L 的維拉帕米培養(yǎng)1h，再換用終濃度為1mg／L的維拉帕米復(fù)氧液培養(yǎng)4h。缺氧／復(fù)氧＋3－MA＋維拉帕米組：在缺氧液中加入終濃度為1mg／L的維拉帕米與終濃度為5mmol／L 的3－MA 共同培養(yǎng)1h，再換用含終濃度為1mg／L 的維拉帕米與終濃度為5 mmol／L的3－MA 復(fù)氧液共同培養(yǎng)4h。

1.5 MTT 法檢測心肌細胞的存活率［7］采用對數(shù)生長期的心肌細胞（第3～4代心肌細胞），按上述分組方法進行分組，然后0.25%胰酶消化后用DMEM 培養(yǎng)液調(diào)成濃度為約5×104／mL的單細胞懸液，分配至96板孔中，每孔約100μL，每組設(shè)10個復(fù)孔，置于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，吸棄上清液，加入MTT 工作液（5g／L），每孔約10μL；37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄培養(yǎng)基，加入每孔200μLDMSO 終止反應(yīng)，置于搖床上輕微震蕩10min。在酶標儀570nm 波長下測定吸光度A 值。細胞存活率（survival rate SR）：SR／%＝（A 實驗組／A 對照組）1）100%。

1.6 RT－PCR法檢測Beclin－1、LC－3mRNA及Bcl－2mRNA的表達 采用Trizonal試劑法按照Trizonal試劑說明提取總RNA。MJ PCR 儀進行PCR 反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄液：總RNA2μL，RNAase Free dH2O 6μL，總量10μL，共配5 份；反轉(zhuǎn)錄程序：37℃15 min 85℃5s4℃1h，cDNA 置于1 mL EP 管中。RT－PCR 反應(yīng)液體系：Template 2μL，上游引物0.4μL，下游引物0.4μL，21）mix 10μL，ddH2O 7.2μL，總體積20μL，共配體系20份。總體系配好后，用槍吸打均勻，54μL 每份中加入6μL 模板，分裝至8連管中，每組設(shè)3個復(fù)孔。實驗采用β－actin作為內(nèi)參，置于qPCR 儀中，程序：94℃30s，94℃5s，60℃30s，95℃1h，55℃1h，55℃20s，共擴增45個循環(huán)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理，定量資料采用均數(shù)±標準差描述，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD－t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 對心肌細胞存活率的影響 與正常對照組相比，缺氧／復(fù)氧組心肌細胞存活率降低（P＜0.05），與缺氧／復(fù)氧組相比，維拉帕米組，3－MA 組，維拉帕米組＋3－MA 組心肌細胞存活率均增高（P＜0.05）。詳見表1。

表1 5組心肌細胞存活率的比較

表1 5組心肌細胞存活率的比較

與空白對照比較，1）P＜0.05；與H／R 組比較，2）P＜0.05；與維拉帕米組比較，3）P＜0.05

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2.2 Beclin－1、LC－3 及Bcl－2mRNA 的 表 達 RT－PCR 結(jié) 果 顯示：與 空 白 對 照 組 相 比，缺 氧／復(fù) 氧 組Beclin－1、LC－3 mRNA表達量均上調(diào)（P＜0.0 5），Bcl－2mRNA的表達下降（P＜0.05）；3－MA 組，維拉帕米組及3－MA 組＋維拉帕米組Beclin－1、LC－3mRNA 表 達 量 均 下 降（P ＜0.05），3－MA 組，維 拉 帕米組及3－MA組＋維拉帕米組Bcl－2mRNA的表達增加（P＜0.05）。與缺氧／復(fù)氧組相比，3－MA 組，維拉帕 米組，3－MA組＋維拉帕米組Beclin－1、LC－3mRNA表達量均下降（P＜0.05），維拉帕米組及3－MA 組＋維拉帕米組Bcl－2mRNA表達均上調(diào)（P＜0.05），3－MA 組Bcl－2mRNA 無明顯變化。詳見表2。

表2 3種基因的值比較

表2 3種基因的值比較

與空白對照比較，1）P＜0.05；與缺氧復(fù)氧組比較，2）P＜0.05；與3－MA＋維拉帕米組比較，3）P＜0.05

組別Beclin－1 Bcl－2 LC－3空白對照組 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00缺氧復(fù)氧組 3.48±0.021） 0.74±0.021） 3.14±0.071）3－MA 抑制劑組 1.87±0.021）2）3）0.77±0.031）3） 2.05±0.041）2）3）維拉帕米組 0.59±0.021）2）3）1.79±0.031）2）3）1.71±0.021）2）3）3－MA＋維拉帕米組 0.69±0.021）2） 2.37±0.031）2）1.55±0.021）2）F 值 11 999.16 2 345.03 1 411.94 P 0.001 0.001 0.001

3 討 論

近年來，與傳統(tǒng)死亡方式凋亡相比，人們更加關(guān)注Ⅱ型程序性死亡方式自噬［8］。自噬的發(fā)生是首先形成自噬體，然后自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，最后降解其所包裹的內(nèi)容物。其中，自噬發(fā)生的重要環(huán)節(jié)在于自噬體的形成［9］。自噬體的形成需要多種自噬相關(guān)基因（Atg）的參與［9］，如：Beclin－1（酵母Atg6的同源），Atg5，Atg16，Atg，12，Atg8（LC－3的同源）等。雷帕霉素通路（mTOR 通路）及Bcl－2／Beclin－1通路是兩條熟知的自噬信號調(diào)節(jié)通路。在自噬體調(diào)節(jié)過程中，Atg12－Atg5－Atg16可與LC－3及Atg9一起被轉(zhuǎn)運至自噬泡，參與自噬泡的擴展。同時，磷脂酰激酶3（PI3K）可與Beclin1結(jié)合，形成復(fù)合體負責(zé)調(diào)控自噬體膜的凝集，并包裹蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)復(fù)合體及細胞器。Bcl－2／Beclin－1 通 路 中，Bcl－2 可 通 過 結(jié) 合 并 抑 制PI3K復(fù)合體的重要組成成分Beclin－1來抑制這一過程。而3－MA 作為一種非特異性的PI3K 抑制劑，參與抑制自噬體形成的過程［10］。

在細胞自噬的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)過程中，許多刺激因子均可以誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生自噬，如營養(yǎng)缺乏、缺血、缺氧、細胞內(nèi)鈣超載、氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等。缺氧／復(fù)氧損傷可以導(dǎo)致心肌細胞鈣超載，而鈣離子拮抗劑維拉帕米可通過拮抗鈣超載從而保護心肌細胞［11］。

自噬在缺氧／復(fù)氧過程中的調(diào)節(jié)起“雙刃劍”作用。在缺氧過程中，通過Beclin－1、Atg5，LC－3等的上調(diào)激活自噬，起保護作用，而在再灌注過程中，自噬測過度表達則影響細胞的存活率。

本實驗成功建立體外缺氧／復(fù)氧模型，模擬在體缺血再灌注損傷過程。通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)不同濃度維拉帕米對缺氧／復(fù)氧心肌細胞存活率影響不同，表明濃度為1mg／L 的維拉帕米較其他濃度對缺氧／復(fù)氧心肌細胞存活率高。提示適宜濃度維拉帕米預(yù)處理可發(fā)揮對缺氧／復(fù)氧損傷心肌細胞的保護作用。而自噬抑制劑3－MA 在 復(fù) 氧 時 使 用，使Beclin－1、LC－3 mRNA 表 達量下降，同時，提高了細胞的存活率，而維拉帕米使Bcl－2 mRNA 表達量增加，Beclin－1、LC－3 mRNA 表達量下降，自噬抑制劑3－MA 合用維拉帕米可使Bcl－2 mRNA 表達量增加，與單用維拉帕米差異無統(tǒng)計學(xué)意義，Beclin－1、LC－3 mRNA 表達量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表明維拉帕米可能通過Bcl－2／Beclin－1通路抑制LC－3的表達，提高缺氧／復(fù)氧心肌細胞的存活率，從而保護心肌細胞。維拉帕米處理對缺氧／復(fù)氧心肌細胞有保護作用，推測Bcl－2／Beclin－1 通路在其保護機制中發(fā)揮重要作用。其具體機制有待進一步研究。

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