張麗萍 王玉春,2 趙 勇,3 馬雪征 甄 維 胡孔新

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 北京 100123；2.河南師范大學(xué)；3.吉林大學(xué)）

1 前言

原子力顯微鏡（Atomic force microscopy，AFM）是一種適合于觀察非導(dǎo)電物質(zhì)的生物力學(xué)工具，具有很高的分辨率，橫向和縱向分辨率分別可達(dá)2-3nm和0.5nm。其突出特點(diǎn)是制樣簡(jiǎn)單，不需要染色、固定以及其他復(fù)雜的制樣過程，并可以在液相實(shí)現(xiàn)觀測(cè)。因此AFM非常適合進(jìn)行病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)分析，成為近年來病毒形態(tài)學(xué)研究熱點(diǎn)之一。

新布尼亞病毒（SFTSV）屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬，是一種有包膜分階段的負(fù)鏈RNA病毒。病毒基因組包括L、M、S三個(gè)片段，分別編碼RNA依賴的RNA聚合酶和包膜糖蛋白G1、G2以及核蛋白。

中國(guó)疾控中心病毒病所通過大量的調(diào)查研究，明確SFTSV致病的臨床表現(xiàn)和流行病學(xué)特征。該病主要發(fā)生在丘陵、山區(qū)，患者以成年農(nóng)民為主，部分患者有被蜱叮咬史。流行期為4-10月，高峰為5-7月，這也是蜱蟲活躍的時(shí)間段。同時(shí)經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，在200多位患者的血清標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)70%左右有感染史。這些患者來自湖北、河南、山東、江蘇、安徽和遼寧，分布很廣，這也提示SFTSV的傳播范圍可能廣泛。

目前，SFTSV形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究主要依賴于透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM），利用AFM對(duì)SFTSV形態(tài)學(xué)方面的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用AFM和TEM兩種方法對(duì)SFTSV HB29株進(jìn)行成像分析，獲得TEM圖像的同時(shí)獲得了該病毒的原子力顯微鏡形貌圖和三維圖、相位圖以及各項(xiàng)表征指標(biāo)，以期探討AFM在SFTSV形態(tài)結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 病毒

SFTSV HB29株為中國(guó)疾控中心病毒病預(yù)防控制所提供。

2.1.2 儀器

TECNAI12TEM：美國(guó)FEI公司；Nano2Scope (R) Ⅲa和catalystAFM：美國(guó)Buruker公司。

2.1.3 試劑

左旋多聚賴氨酸：美國(guó)sigma公司。

2.2 方法

2.2.1 TEM的制樣和觀測(cè)

采用負(fù)染制片技術(shù)處理病毒培養(yǎng)液及鼠源單抗37℃孵育30min處理的病毒培養(yǎng)液，用PBS緩沖液（pH7.2）適當(dāng)稀釋，將載有碳膜的銅網(wǎng)翻扣插入稀釋液中，用濾紙從邊緣吸去多余的液體，1%的磷鎢酸（pH6.8）染色1min，空氣中自然干燥后通過TEM觀察拍照，加速電壓為80kv。該部分工作在中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病所完成。

2.2.2 AFM樣品制備

1%左旋多聚賴氨酸浸泡直徑15mm的蓋玻片5min后，取出置暗處晾干，取5μL病毒濃縮液，均勻涂于處理好的蓋玻片限定區(qū)域，靜置5min，濾紙吸去樣本表面多余液體，去離子水洗滌3次，3min/次，氮?dú)獯蹈桑缓髮⑸w玻片固定于鐵片上進(jìn)行掃描觀察；5μL病毒濃縮液，均勻涂于處理好的蓋玻片限定區(qū)域，靜置5min，濾紙吸去樣本表面多余液體，加5μL鼠源單抗均勻涂于樣片限定區(qū)域，37℃濕盒孵育30min，濾紙吸去樣本表面多余液體，去離子水洗滌3次，3min/次，氮?dú)獯蹈?，然后將蓋玻片固定于鐵片上進(jìn)行掃描觀察。

2.2.3 AFM成像

SFTSV HB29株的AFM圖像通過Nano2Scope(R) Ⅲa 和catalystAFM控制器，在室溫大氣條件下以Tapping模式采集圖像，圖像采用高度、振幅與相位3種信號(hào)輸出，并經(jīng)Nanoscope Image Analysis分析處理軟件進(jìn)行病毒形貌的截面和粗糙度等參數(shù)的測(cè)量和分析。

3 結(jié)果

3.1 TEM觀察結(jié)果

從圖1可以看出，本次試驗(yàn)使用的SFTSV HB29株在電子顯微鏡下可以看到病毒粒子的負(fù)染形態(tài)結(jié)構(gòu)：完整粒子呈球形，粒子在PTA負(fù)染液襯托下呈白色外觀，顆粒周圍可見包膜。鼠源單抗處理的病毒顆粒球形（圖2所示），病毒顆粒周圍可見負(fù)染狀態(tài)下暗色的包膜，電鏡狀態(tài)病毒與抗體處理的病毒形貌未見明顯差異。

圖1 SFTSV HB29株TEM的負(fù)染狀態(tài)

圖2 SFTSV HB29株抗體處理后TEM的負(fù)染狀態(tài)

3.2 AFM觀察結(jié)果

3.2.1 AFM觀察到的SFTSV形貌圖

用E型掃描器，所用探針為由硅制成的RTESP探針，其微懸臂的長(zhǎng)度為115-135μm，彈性常數(shù)K為20-80N/nm，共振頻率為200-400kHz，針尖曲率半徑為5-10nm，掃描速度為1Hz和2.8Hz；選取不同掃描范圍的SFTSV HB29株病毒AFM圖片，展示病毒形態(tài)和相關(guān)特性。在367nm×367nm和190nm×190nm范圍掃描的圖片中通過形貌圖、振幅圖和相位圖（圖3）可見SFTSV球形顆粒，邊界清晰，形狀規(guī)則，大小80-100nm。鼠源單抗處理后的SFTSV348nm×348nm和172nm×172nm掃描范圍圖片（圖4）中可見，病毒顆粒形狀不規(guī)則，未見規(guī)則球形病毒顆粒，大小100nm左右，可見邊界不平滑銳利邊緣。

3.2.2 AFM觀察到的SFTSV的三維立體分析圖

利用AFM對(duì)所獲得的結(jié)果進(jìn)行一系列分析，獲得圖中SFTSV的長(zhǎng)度約100nm，階高約30nm，表面平均粗糙度和表面均方粗糙度值分別約為0.420nm和0.342nm。圖5為600nm×600nm AFM結(jié)果三維分析圖，顯示病毒的三維相貌，可見病毒球形，邊界清晰，表面不平，可見起伏。截面分析圖獲得顆粒兩端的表面距離為95.33nm，截面水平距離110.45nm，同時(shí)還獲得病毒顆粒的垂直距離等相關(guān)信息。

圖3 不同掃描范圍下的SFTSV形貌圖

圖4 不同掃描范圍下的抗體處理后的SFTSV形貌圖

圖5 600nm×600nm視野下SFTSV的三維立體分析圖

4 討論

SFTSV屬于布尼亞病毒科，白蛉病毒屬，病毒顆粒呈球形，直徑80-100nm，外有脂質(zhì)包膜，表面有棘突，其基因組為單股負(fù)鏈RNA，包含L、M、S3個(gè)片段[1-3]。SFTSV作為一種新發(fā)現(xiàn)的病毒，其宿主和傳播途徑尚無定論。中國(guó)CDC病毒病所李德新等曾經(jīng)在蜱中檢測(cè)到SFTSV核酸[1]，江蘇CDC鮑昌俊等在牛、羊、狗血清中檢測(cè)到SFTSV抗體[4]，因此SFTSV為人獸共患病。

1986年，Gbinning等在掃描隧道顯微鏡基礎(chǔ)上發(fā)明了一種力學(xué)顯微鏡－AFM，是SPM 家族的主要成員[5]。AFM的分辨率很高，其橫向分辨率為2nm-3nm，縱向分辨率為0.5nm，可直接用來觀察物質(zhì)的分子或原子，是人類探索微觀世界的理想工具。AFM的工作原理是將探針裝在彈性微懸臂的一端，另一端固定，當(dāng)探針在樣品表面掃描時(shí)，探針與樣品表面原子間的排斥力會(huì)使得微懸臂輕微變形，這樣，微懸臂的輕微變形就可以作為探針和樣品間排斥力的直接量度。一束激光經(jīng)微懸臂的背面反射到光電檢測(cè)器，可以精確測(cè)量微懸臂的微小變形，這樣就實(shí)現(xiàn)了通過檢測(cè)樣品與探針之間的原子排斥力來反映樣品表面形貌和其他表面結(jié)構(gòu)。

本研究對(duì)制備獲得的SFTSV及經(jīng)抗體處理的SFTSV首先進(jìn)行TEM進(jìn)行觀察，獲得成功后再利用AFM對(duì)SFTSV病毒進(jìn)行觀察，并和TEM獲得的病毒形態(tài)進(jìn)行比較。TEM電鏡結(jié)果顯示雖然本研究所用的SFTSV標(biāo)本顆粒分散，但可見到完整的球形病毒粒子，且與抗體處理后的病毒顆粒相比，電鏡下未見明顯差異。用AFM觀察SFTSV獲得了比較理想的相位圖，相位圖比高度圖更清晰的展示了病毒表面的精細(xì)結(jié)構(gòu)，通過190nm×190nm視野下相位圖可見球形病毒粒子，表面粗糙，但未見病毒表面的刺突結(jié)構(gòu)；通過172nm×172nm視野下的相位圖可見經(jīng)抗體處理后的SFTSV表面不規(guī)則起伏，邊界不平滑。對(duì)于AFM結(jié)果中未見病毒粒子的典型刺突，推測(cè)主要原因可能在于探針針尖有一定的寬度，無法獲得小于針尖寬度的病毒表面顆粒，但是粗糙度等量化指標(biāo)以及相位圖展示的病毒表面結(jié)構(gòu)三維圖從另一個(gè)角度描述了病毒形態(tài)。

5 結(jié)論

本研究利用TEM和AFM相結(jié)合的方法首次成功展示了SFTSVHB29株的三維圖并獲得病毒形貌參數(shù)，為SFTSV的形態(tài)研究提供依據(jù)。作為一種新的病毒形態(tài)學(xué)研究工具，AFM在病毒研究中的應(yīng)用還需要進(jìn)一步完善，相信隨著研究的不斷深入，它將會(huì)在病毒形態(tài)學(xué)以及相關(guān)研究中發(fā)揮重要作用。

［1］Yu X J,Liang M F,Zhang S F,et al.Fever with Thrombocytopenia Associated with a Novel Bunyavirus in China[J].The new England journal of medicine,2011,364:1523-1532.

［2］李德新.發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒概述[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2011，25（2）：81-84.

［3］張永振，周敦金，熊衍文，等.中國(guó)淮陽(yáng)山地區(qū)新蜱傳布尼亞病毒引起的出血熱[J].中華流行病學(xué)雜志，2011，32（3）：209-220.

［4］Bao C J,Qi X,Wang H.A novel bunyavirus in China[J].N Engl J Med,2011,365(9):862-863.

［5］Nettikadan S R,Johnson J C,Mosher C,et al.Virus particle detection by solid phase immunocapture and atomic force microscopy[J].Biochem Biophys Res Commun，2003,311(2):540-545.