陳曉晶　潘振　趙軍

摘要[目的]研究玉米抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ABP9在玉米抗逆應(yīng)答中的功能及其表達(dá)調(diào)控機(jī)理。[方法]以2葉期玉米葉片為材料分離原生質(zhì)體，通過(guò)PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，建立玉米葉肉原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)ABP9的系統(tǒng)。利用該系統(tǒng)，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR和Western blot分別檢測(cè)ABP9genomic∷FLAG融合基因在原生質(zhì)體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯；并通過(guò)轉(zhuǎn)化ABP9∷GFP融合表達(dá)載體和GFP熒光檢測(cè)，對(duì)ABP9進(jìn)行亞細(xì)胞定位。[結(jié)果]玉米原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)ABP9系統(tǒng)中，ABP9genomic∷FLAG融合基因能夠正確轉(zhuǎn)錄出mRNA并翻譯出蛋白質(zhì)；利用該系統(tǒng)進(jìn)行亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示ABP9定位于細(xì)胞核中。[結(jié)論]玉米原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)ABP9體系的建立，為進(jìn)一步探究玉米中ABP9的表達(dá)和調(diào)控提供了良好的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。

關(guān)鍵詞玉米（Zea mays L.）；轉(zhuǎn)錄因子；ABP9（ABRE Binding Protein 9）；原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)

中圖分類號(hào)S513文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）09-02554-05

基金項(xiàng)目國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（編號(hào)：2013ZX08003-004）。

作者簡(jiǎn)介陳曉晶（1988-），女，河北晉州人，碩士研究生，研究方向：植物抗逆分子生物學(xué)。*通訊作者，研究員，博士，從事植物抗逆分子生物學(xué)和基因工程研究。

玉米（Zea mays L.）是全球種植范圍最廣、產(chǎn)量最大的谷類作物，居3大糧食（玉米、小麥和大米）之首[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前我國(guó)玉米種植面積為35 029 820×103 km2，總產(chǎn)量20 561.41×104 t，玉米已經(jīng)成為我國(guó)種植面積最大、總產(chǎn)量最高的糧食作物（國(guó)家統(tǒng)計(jì)局 2012）。玉米同時(shí)也作為重要的飼料作物和工業(yè)原料，是世界糧食安全和能源安全不可或缺的一部分。然而，自然環(huán)境下，玉米的生長(zhǎng)經(jīng)常受到干旱、低溫、鹽漬等逆境的脅迫，嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量，威脅糧食安全。

轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖、胞間信號(hào)、細(xì)胞周期、代謝以及應(yīng)答外界環(huán)境中起著重要的作用[2]。近年來(lái)，研究者相繼從高等植物中分離出一些調(diào)控逆境相關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。增強(qiáng)一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的作用，就可通過(guò)其促使多個(gè)抗逆基因發(fā)揮作用。因此，在植物抗逆分子育種中，與導(dǎo)入或改良個(gè)別功能基因來(lái)提高某種抗性的傳統(tǒng)方法相比，改良或增強(qiáng)一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子是綜合改良植株性狀更為有效的方法和途徑[3]。

bZIP轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中分布最廣泛、最保守的一類轉(zhuǎn)錄因子。實(shí)驗(yàn)室前期工作通過(guò)酵母單雜交的方法，從授粉后17 d的玉米幼胚cDNA文庫(kù)中篩選出了與玉米Cat1（catalase isozyme 1）基因順式元件ABRE2相互作用的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子ABP9（ABRE Binding Protein9），并證明其在酵母細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄激活功能[4]?；驑屴D(zhuǎn)化玉米懸浮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)分析表明，ABP9在植物細(xì)胞中也具有ABRE結(jié)合特性和轉(zhuǎn)錄激活功能[5]。已有研究通過(guò)轉(zhuǎn)基因的手段，分析了轉(zhuǎn)ABP9基因的擬南芥[5]、小麥[6]、黑麥草、高羊茅[7]、水稻[8]等的耐非生物逆境的抗性，結(jié)果表明ABP9過(guò)表達(dá)植株對(duì)干旱、寒冷和鹽漬等非生物脅迫的耐受能力明顯增強(qiáng)。Zhang等研究表明，過(guò)表達(dá)ABP9的擬南芥中，ABP9通過(guò)調(diào)節(jié)一系列ROS清除相關(guān)的抗氧化酶類基因（CSD1，CAT3等）的表達(dá)以及ROS 信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的調(diào)節(jié)基因（Zat10，SRO5等）的表達(dá)，參與植物體內(nèi) ROS代謝的調(diào)節(jié)；ABP9還通過(guò)調(diào)節(jié)多種逆境/ABA應(yīng)答相關(guān)功能基因（COR15a，KIN1，RD29B等）和調(diào)節(jié)基因（CBF1，PP2C，MYB2等）的表達(dá)，參與ABA信號(hào)傳導(dǎo)和寒冷、干旱、鹽漬等逆境防御反應(yīng)，從而提高植物耐多種非生物逆境的能力[9-10]。前期研究中，實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)ABP9可能存在某種特殊的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。

植物中瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)具有檢測(cè)速度快、高通量等特點(diǎn)，結(jié)合報(bào)告基因GUS[11]、CAT[12]、LUC[13]、GFP[14]、EGFP[15]等使用，該技術(shù)被廣泛地用于基因功能分析的研究，如基因表達(dá)、蛋白亞細(xì)胞定位、啟動(dòng)子及蛋白活性檢測(cè)以及蛋白間互作等[16]。原生質(zhì)體作為常用的植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，是比較均一的單細(xì)胞體系；且不需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的組織培養(yǎng)，制備檢測(cè)過(guò)程僅需2 d時(shí)間[17]。胡蘿卜、煙草、玉米原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)[18]、土豆[19]、白云衫[20]、大麥[21]、標(biāo)準(zhǔn)的擬南芥瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)[22]、優(yōu)化的水稻瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)[23]等原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)相繼建立，為研究蛋白的亞細(xì)胞定位和基因的表達(dá)調(diào)控提供了方便而有效的試驗(yàn)系統(tǒng)。Izawa等利用水稻原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)研究了水稻bZIP類轉(zhuǎn)錄激活子RITA1對(duì)籽粒發(fā)育過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控[24]；Yanagisawa等利用玉米葉片原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)分析了玉米Dof鋅指蛋白參與組織特異性光調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[25]；Gu等利用擬南芥原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)研究了番茄轉(zhuǎn)錄因子Pti4、Pti5和Pti6在防御應(yīng)答中的激活作用[26]；李妮娜等建立棉花葉肉原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)研究了棉花轉(zhuǎn)錄因子GhZFP2的亞細(xì)胞定位[27]。

因此，建立ABP9轉(zhuǎn)錄因子的玉米原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系對(duì)此基因的進(jìn)一步功能和調(diào)控分析和轉(zhuǎn)基因植株構(gòu)建具有重要意義。筆者用PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法，成功建立了玉米葉肉原生質(zhì)體較高效的瞬時(shí)表達(dá)ABP9系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子ABP9進(jìn)行了初步分析，以期為進(jìn)一步闡明ABP9在玉米中的功能及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象。將玉米自交系Qi319飽滿的種子播種于土（蛭石∶泥炭土=1∶1）中，置于培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2周左右，選取第2片伸展的葉子作為提取玉米原生質(zhì)體的材料。

1.1.2主要儀器。PCR儀，購(gòu)自杭州柏恒科技有限公司；Centrifuge 5810R高速離心機(jī)和Centrifuge 5804，均購(gòu)自eppendorf公司；THZC1臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器，購(gòu)自太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；DYY6C型核酸電泳儀，購(gòu)自北京六一化學(xué)儀器廠；可控恒溫金屬浴儀，購(gòu)自金銀杏生物公司。

1.1.3主要試劑。4嗎啉乙磺酸（MES）、纖維素酶R10、離析酶R10、D甘露醇、KCl 、CaCl2、BSA、MgCl2、PEG4000等原生質(zhì)體提取所用試劑及聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X100）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、二硫蘇糖醇（DDT）、十二烷基硫酸鈉（SDS）等Western blot所用試劑，均購(gòu)自Amresco公司；金牌超量無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒，購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；各種限制性內(nèi)切酶和修飾酶，購(gòu)自NEB公司；TRIzol reagent購(gòu)自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；測(cè)序均由北京博艾永華生物科技有限公司完成。

1.2方法

1.2.1亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建。pCAMBIA130335SGFPTnos表達(dá)框由花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動(dòng)子、GFP報(bào)告基因、胭脂堿合成酶終止子（NOS）構(gòu)成。設(shè)計(jì)2端帶有XbaI和BglII酶切接頭的引物（ABP9XbaIFW：5′gagatctagaatggcgtcggagac3′；ABP9BglIIRV：5′cgtcagatctaccatccacatggcgctg3′，下劃線處為酶切位點(diǎn)）；PCR方法用TransStart FastPfu高保真酶從pCAMBIA3301PubiABP9Tnos載體上擴(kuò)增目的基因ABP9的cDNA序列，擴(kuò)增產(chǎn)物回收后雙酶切，經(jīng)T4 DNA連接酶連接到雙酶切的pCAMBIA130335SGFPTnos載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌落PCR、酶切鑒定以及測(cè)序后，獲得ABP9∷GFP融合載體pCAMBIA130335SABP9GFPTnos。按照說(shuō)明書用金牌超量無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒抽提質(zhì)粒，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2瞬時(shí)表達(dá)目的基因載體的構(gòu)建。瞬間表達(dá)載體pUC1935S3FlagTnos的表達(dá)框由花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動(dòng)子、3Flag標(biāo)簽、胭脂堿合成酶終止子（NOS）構(gòu)成；pCAMBIA3301Pabp9 GFPABP9genomicTnos用于制備目的基因片段，二者均由實(shí)驗(yàn)室保存。設(shè)計(jì)2端帶有XhoI和BstBI酶切接頭的引物（FW：5′ ccgctcgagatggcgtcggagaccacc3′；RV：5′gcttcgaaccacatggcgctgcccgag3′，下劃線處為酶切位點(diǎn)）；用與亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建相同的方法將ABP9基因組序列連接到pUC1935S3FlagTnos載體上，構(gòu)建載體pUC1935SABP9genomic3FlagTnos。

1.2.3玉米原生質(zhì)體制備。將玉米葉片去兩端切成約0.5 mm細(xì)絲，把切好的葉片放入含有酶解液（將1.5%纖維素酶R10，0.4%離析酶R10，0.4 mmol/L D甘露醇，20 mmol/L KCl，20 mmol/L MES（pH 5.7）混合液置于55 ℃水浴10 min，冷卻至室溫后，加入10 mmol/L CaCl2，0.1%BSA，并用0.45 μm濾膜過(guò)濾到培養(yǎng)皿中）的培養(yǎng)皿中，室溫黑暗中振蕩（轉(zhuǎn)速為30 r/min）酶解7 h。使用200目尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾酶解液，100×g離心2 min，沉淀原生質(zhì)體。移除上清液，加入預(yù)冷的緩沖液W5（2 mmol/L MES（pH 5.7），154 mmol/L NaCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl），洗滌沉淀1次，離心后棄上清液，再次加入W5，重懸沉淀，置于冰上30 min。再次100×g離心2 min，棄上清液，加入適量的MMg溶液（4 mmol/L MES，0.4 mmol/L D甘露醇，15 mmol/L MgCl2），備用。

1.2.4PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。吸取10 μg質(zhì)粒于2 ml圓底離心管中，加入制備好的200 μl原生質(zhì)體溶液混勻，加入等體積30%PEGCa2+溶液（30%PEG4000，200 mmol/L甘露醇，100 mmol/L CaCl2），輕輕彈勻后靜置20 min進(jìn)行誘導(dǎo)。將混合物用W5溶液清洗2次，最后加入1.0 ml W5溶液置于室溫、弱光下培養(yǎng)15 h后收集備用。

1.2.5激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)化ABP9∷GFP融合載體的原生質(zhì)體培養(yǎng)過(guò)夜后，用4′，6二脒基2苯基吲哚（DAPI）進(jìn)行細(xì)胞核染色（DAPI儲(chǔ)存液與工作液按1∶1 000稀釋，最終濃度100 ng/ml），染色1 h后用ZEISS激光共聚焦顯微鏡LSM700觀測(cè)熒光分布。

1.2.6玉米原生質(zhì)體總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄PCR。將收集好的原生質(zhì)體，按照Trizol Reagent說(shuō)明書提取總RNA，并用1.2%的瓊脂凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，將完整性較好的RNA放于-80 ℃低溫冰箱中備用。將上述提取的原生質(zhì)體總RNA參照TransScript OneStep gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用在線引物設(shè)計(jì)軟件（http：//www.yeastgenome.org/cgibin/webprimer）設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄PCR的引物，引物的上下游序列分別為ABP9genomicpureFW：5′ATGGCGTCGGAGACCACC3′和3FlagpureRV：5′ TCACTTATCGTCATCGTC3′。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物；同時(shí)以pUC1935SABP9genomic3FlagTnos為模板，用相同的引物進(jìn)行PCR作為檢測(cè)ABP9在玉米原生質(zhì)體中轉(zhuǎn)錄的對(duì)照。

1.2.7 Western blot檢測(cè)ABP9的表達(dá)。分別取100 g未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化pUC1935SABP9genomic3FlagTnos的原生質(zhì)體，加入蛋白提取液（50 mmol/L Tris·Cl（pH 8.0），150 mmol/L NaCl，1% TritonX100，100 μg/ml PMSF）后用移液器吸打，加入上樣緩沖液[50 mmol/L Tris·Cl（pH 6.8），100 mmol/L DTT，2%SDS，0.1%溴酚藍(lán)，10%甘油]，高溫變性5 min，經(jīng)12% SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）上，用磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）（137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4，0.1%Tween20）溶液洗膜，并用含有5%牛奶的PBST室溫下?lián)u動(dòng)封閉2 h。滴加抗鼠Flag一抗（1∶5 000）孵育，4 ℃過(guò)夜；再次用PBST洗，洗完后加HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1∶5 000）孵育30 min后，PBST洗滌。結(jié)果用ECL化學(xué)發(fā)光顯色分析，并用x-膠片進(jìn)行顯影。

2結(jié)果與分析

2.1亞細(xì)胞定位載體及瞬時(shí)表達(dá)目的基因載體的構(gòu)建用于亞細(xì)胞定位的載體ABP9∷GFP融合表達(dá)載體及瞬時(shí)表達(dá)ABP9基因載體pUC1935SABP9genomic3FlagTnos通過(guò)菌落PCR初步檢測(cè)后，酶切篩選陽(yáng)性克隆，并將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列比對(duì)軟件分析，結(jié)果表明插入片段與預(yù)期序列完全一致，如圖1所示，表明載體構(gòu)建成功。

注：a為pCAMBIA130335SABP9GFPTnos載體；b為pUC1935SABP9 genomic3FlagTnos載體。

圖1亞細(xì)胞定位載體及瞬時(shí)表達(dá)目的基因載體構(gòu)建安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2014年2.2 PEG介導(dǎo)的玉米原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化該研究借鑒擬南芥葉肉瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法[22]并進(jìn)行改進(jìn)，將誘導(dǎo)劑PEGCa2+的濃度由40%降低到30%，選用暗培養(yǎng)的玉米Qi319兩葉期幼苗為材料，在轉(zhuǎn)速為30 r/min的水平搖床上酶解7 h，可獲得活力達(dá)90%左右的玉米葉肉原生質(zhì)體。為了提高玉米葉肉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化ABP9的效率，對(duì)質(zhì)粒濃度和培養(yǎng)時(shí)間等條件進(jìn)行摸索，綜合原生質(zhì)體活力及轉(zhuǎn)化效率考慮，最終得到每管反應(yīng)體系轉(zhuǎn)化10 μg質(zhì)粒，培養(yǎng)15 h，可以使轉(zhuǎn)ABP9原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率達(dá)50%。

2.3ABP9亞細(xì)胞定位分析將構(gòu)建的亞細(xì)胞定位載體pCAMBIA130335SABP9GFPTnos轉(zhuǎn)化玉米葉肉原生質(zhì)體，經(jīng)過(guò)DAPI細(xì)胞核染色后，用激光共聚焦顯微鏡觀察瞬時(shí)表達(dá)ABP9∷GFP融合載體的原生質(zhì)體內(nèi)熒光分布。如圖2所示，ABP9∷GFP蛋白只出現(xiàn)在細(xì)胞核中，由此證明ABP9蛋白定位于細(xì)胞核。玉米中，過(guò)氧化氫酶基因（CAT）編碼3種同工異構(gòu)酶CAT1、CAT2和CAT3，共同催化H2O2分解，由此在ROS清除酶系統(tǒng)中占主要部分。ABA應(yīng)答元件ABRE2位于Cat1的啟動(dòng)子上，主要參與ABA誘導(dǎo)的Cat1的表達(dá)[9-10]。玉米抗逆轉(zhuǎn)錄因子ABP9是與ABRE2互作從而激活下游報(bào)告基因的表達(dá)的反式作用因子。該亞細(xì)胞定位的結(jié)果符合反式作用因子作用特點(diǎn)，證實(shí)了ABP9蛋白的核定位調(diào)控。

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