基于微流控芯片的循環(huán)腫瘤細胞的分離、檢測技術(shù)

劉侃　張俊哲

摘要： 循環(huán)腫瘤細胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）是自腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進入外周血液循環(huán)的腫瘤細胞，是腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的標志。CTCs有助于癌癥的早期診斷、判斷療效、個體化治療方案制訂及診斷預后。隨著檢測技術(shù)的不斷改進，CTCs檢測成為臨床研究的熱點，其中，微流控芯片以其高通量高效率以及低成本的特點迅速發(fā)展并被廣泛研究應(yīng)用。該課題對CTCs最新檢測方法的研究以及未來的發(fā)展趨勢進行綜述，特別剖析結(jié)合微流體技術(shù)和納米技術(shù)的微流控芯片是如何被應(yīng)用于循環(huán)腫瘤細胞的分離、富集以及檢測的，評估各種方法的優(yōu)缺點，并探討未來循環(huán)中流細胞檢測技術(shù)的難點和方式。

關(guān)鍵詞：循環(huán)腫瘤細胞；微流控芯片；細胞檢測

中圖分類號：TP18 文獻標識碼：A 文章編號：1009-3044（2014）09-2093-02

近年來，惡性腫瘤導致的死亡率在所有疾病的死亡率中位居前列，而腫瘤細胞具有的侵襲和轉(zhuǎn)移能力正是惡性腫瘤的高致死率的誘因 [1]。循環(huán)腫瘤細胞（Circulating tumor cells，CTCs）是自腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進入外周血液循環(huán)的腫瘤細胞，是腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的一種標志。因此，基于循環(huán)腫瘤細胞的腫瘤轉(zhuǎn)移的檢測就顯得至關(guān)重要。

微流控芯片以其低成本、易操作、便攜式、低損傷、高準確性成為當前各類CTCs檢測方式中最熱門的一種方式?；谖⒘骺匦酒南鄳?yīng)方法的成功實現(xiàn)及運用，不僅將對腫瘤早期檢測和預后的判斷有重大意義，而且對臨床治療的指導也有很大價值。

1 CTCs概念

根據(jù)目前的研究，CTCs被定義為因診療操作或自發(fā)由實體腫瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放而進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞。進入循環(huán)而未被清除的腫瘤細胞通過微遷移、黏附以及相互聚集形成一定體積的微小癌栓，并在相應(yīng)條件下發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶[2]。

CTCs在外周血中的數(shù)量極少，通常在每106～107個白細胞中才能尋找出僅有的數(shù)個腫瘤細胞，因而要進行CTCs檢測通常必須先進行細胞富集，以提高檢測靈敏度。細胞富集可通過腫瘤細胞的特異性標志物或者細胞形態(tài)特征如細胞密度和體積等來實現(xiàn)。其中免疫磁性分選法是目前最常用的CTCs富集方法。當前較為常用的CTCs分離檢測手段則有CTCs微流控芯片技術(shù)、流式熒光檢測儀、CellSearch檢測、膜過濾法、密度梯度離心法。

2 微流控芯片的制備工藝和研究

目前，微流控芯片主要以PDMS為芯片材料，以玻璃為基底材料。其中PDMS具有非常理想的材料特性，尤其表現(xiàn)在作為構(gòu)建微流控芯片的主要材料時。

近年來，由于PDMS易于加工成型，圖形效果好，光學透性好且兼容熒光檢測等，低毒性、加工容易，且容易和自身以及其他多種材料封接，對溫度等環(huán)境的要求也不多等諸多優(yōu)點，因此受到了各方廣泛關(guān)注。首先，PDMS因為彈性好，在脫模過程中，加工出來的PDMS微通道在保持模具完整無損的情況下，能夠輕松剝離出來，從而實現(xiàn)模具的重復利用[3]。另外，PDMS柔性好，易于吸附在其他材質(zhì)的襯底之上，而且PDMS與相對粗糙的表面接觸非常緊密，經(jīng)過處理后，與基底封接效果好，鍵合工藝簡單，澆鑄法制備PDMS結(jié)構(gòu)具有較高的成型質(zhì)量。PDMS的電絕緣性也很好，因而被運用于各種主流毛細管電泳芯片的制作；PDMS對溫度等也很不敏感且具有化學惰性，與大部分待檢測液體都不會發(fā)生反應(yīng)，因而具有很高的生物兼容性，滿足大量不同生物實驗的要求。迄今為止，以PDMS為主要加工制備材料的微流控芯片已被廣泛應(yīng)用到醫(yī)學和生命科學等領(lǐng)域。

3 不同微流控芯片技術(shù)的原理及方式

3.1 基于循環(huán)腫瘤細胞大小的微流控芯片技術(shù)

利用腫瘤細胞與其它血細胞的大小以及剛度不同的物理性質(zhì)可以對循環(huán)腫瘤細胞進行分離。根據(jù)腫瘤細胞與血細胞直徑的不同，設(shè)計一定直徑的濾孔，可以實現(xiàn)循環(huán)腫瘤細胞的分離。ISET聯(lián)合激光掃描細胞計量儀（lasereanningeytometry，LSC）的原理即是利用腫瘤細胞通常比外周血液中其它細胞大的特性，采用孔徑為8μm的濾膜，將腫瘤細胞從血液中分離出來，通過不同熒光標記細胞來進行進一步鑒定，應(yīng)用LSC對已經(jīng)過熒光抗體標記的細胞進行掃描并識別，進而可以準確計算出血液中含有的微量腫瘤細胞。常用的熒光抗體有抗CK抗體。經(jīng)過研究表明，此方法已成功被運用于從乳腺癌、前列腺癌以及肺癌患者的血液中檢測出CTCs。此方法較之CellSearch系統(tǒng)而言，其細胞富集過程相對容易，它不依賴抗原抗體反應(yīng)而是直接過濾外周血進行腫瘤細胞富集，不但不破壞腫瘤細胞的形態(tài)學特征而且減小了腫瘤細胞的丟失，同時它能將丟失了上皮細胞特征的腫瘤細胞分離出來，并且應(yīng)用激光掃描細胞計量儀對所檢測到的陽性細胞進行進一步目測確認，確保了CTCs檢測的準確性。然而，采用CellSearch技術(shù)與采用此方法檢測的CTCs數(shù)目之間存在一定的不一致性，可能原因是有假陽性結(jié)果出現(xiàn)所致。而且此種方法選擇的膜孔徑為8μm意味著此方法只能分離直徑大于8μm的腫瘤細胞，但目前沒有研究能證實所有的腫瘤細胞都大于8μm，這導致該方法分離的準確性會受到質(zhì)疑。

3.2 基于循環(huán)腫瘤細胞介電性的微流控芯片技術(shù)

由于腫瘤細胞是正常細胞變異了的細胞，因而它的電學性質(zhì)方面較之正常細胞也會有所差異。DEPArray技術(shù)即是一種基于腫瘤細胞獨特的介電性質(zhì)的新型分離方法。相關(guān)針對淋巴腫瘤細胞的阻抗進行測量的研究，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)來評估細胞的介電性，發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的一個顯著特點即是具有較低的特異性膜電容，鑒于這種特性，以上兩種細胞的分離在控制介電泳的頻率在1MHz以上時即可實現(xiàn)，并可保持這兩種細胞的活性。DEPArray方法將嵌入了控制電路的硅襯底應(yīng)用于已富集的樣本中，通過改變電場來激發(fā)微電極，細胞從而被吸引或排斥，而不同大小和形態(tài)的細胞在分離過程中會受到介電力作用，而電場的變化相應(yīng)改變細胞整體受力情況。在整個分離過程中，在一定的流速下，由于細胞在入口處低頻電信號的作用下受到排斥的介電泳作用力，細胞的流動導致電極激發(fā)頻率增加從而浮力減小，因而細胞在對應(yīng)其介電特性的位置下沉停止。有研究表明已成功從血液中分離出乳腺癌細胞。介電泳方法簡單易操作，他對單個細胞的分子鑒定以及評估腫瘤特異性和實現(xiàn)個性化療法的監(jiān)測具有廣泛前景。但是該方法具有一定的局限性，因為不同種類的腫瘤細胞的介電性質(zhì)存在差異，對應(yīng)的電信號頻率也不同。而且此種方法不能進行腫瘤細胞的計數(shù)，只能進行腫瘤細胞的分離，因此要確保細胞為腫瘤細胞則需要與其他細胞計數(shù)方法聯(lián)合使用。比如曾有研究人員利用單克隆抗體將循環(huán)腫瘤細胞富集在微流控芯片上，通過改變電導率的方法對捕獲到的循環(huán)腫瘤細胞進行計數(shù)等。

3.3 基于親和配體功能化的微流控芯片技術(shù)

2007年，美國強生公司與麻省醫(yī)院癌癥中心合作研發(fā)了一種可以檢測出外周血中微量腫瘤細胞的微流體硅芯片，稱為CTC-Chip。該微流體硅芯片的表面布滿了上萬個被抗體包被的位點，當血液流過該芯片時，上面的抗體與腫瘤細胞進行特異性結(jié)合，腫瘤細胞就會因抗原抗體反應(yīng)而被粘附在芯片上。此種方法能從血液中近10億血細胞中檢測出單個腫瘤細胞[4]。其原理主要是將腫瘤細胞與連接上皮細胞粘附因子EpCAM抗體的磁珠進行特異性結(jié)合，結(jié)合后再應(yīng)用強力磁體將這些循環(huán)腫瘤細胞從血液中提取出來并進行生化染色，進而可以準確辨別循環(huán)腫瘤細胞。2010年，該機構(gòu)成功研發(fā)第二代CTC-Chip，稱為HB-Chip。雖然利用微流控芯片雖然可以成功地將活的循環(huán)腫瘤細胞成功分離出來，但因為細胞在操作中被固定在裝置上，所以難以再次利用。總之，CTCs芯片技術(shù)為對腫瘤轉(zhuǎn)移進行更為精細的分析提供了一個平臺。

3.4基于納米顆粒的微流控芯片技術(shù)

納米技術(shù)在近年來得到飛速發(fā)展，并已大量運用到包括醫(yī)學、藥學及機械制造業(yè)等領(lǐng)域。其中由于納米顆粒具有獨特的光學、電學及機械等性質(zhì)，在解決檢測方面的問題發(fā)揮了重要作用。結(jié)合納米技術(shù)的循環(huán)腫瘤檢測分離方法利用某些納米顆粒獨特的生物以及光學特性，在檢測過程中，與循環(huán)腫瘤細胞相連，作為具有特異性的光學標記物，用以實現(xiàn)信號的放大，因此避免了腫瘤細胞的檢測信號不強的問題。另外，利用納米孔內(nèi)部連接相應(yīng)腫瘤標記物的抗體，當納米孔內(nèi)有腫瘤標記物通過時，抗體與抗原特異性結(jié)合，引起阻抗相應(yīng)的改變，腫瘤標記物的濃度則可通過檢測阻抗的變化確定。借助納米材料的上述優(yōu)點，未來針對檢測中應(yīng)用納米技術(shù)的研究里，會有很多方面可以提高。

4 基于微流控芯片的循環(huán)腫瘤細胞檢測面臨的問題以及未來發(fā)展

綜合上述各種方法，相關(guān)循環(huán)腫瘤細胞的新檢測方式不斷出現(xiàn)，雖然它們各自具有檢測優(yōu)勢，但仍存在一系列問題，影響循環(huán)CTCs的敏感性、特異性以及檢測準確度等。例如依賴抗原抗體的免疫學檢測法有高度的特異性而缺乏足夠的敏感性，非免疫學檢測法則有敏感性高而特異性不足的問題。目前，還有沒有一種100%特異性的腫瘤生物標記。這些都增加了對CTCs的檢測難度，需要在未來的研究中得到進一步的解決。

雖然CTCs檢測存在很多問題，但是大量臨床試驗表明，CTCs檢測在實體腫瘤早期診斷檢測、轉(zhuǎn)移判斷、療效判定和預后評估等方面具有重要臨床意義。裝置微型化是目前CTCs檢測裝置的研發(fā)趨勢，而這其中微流控芯片就是典型成果。綜上所述，在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，充分結(jié)合不同領(lǐng)域領(lǐng)域的優(yōu)勢，實現(xiàn)多方面的綜合檢測，提高檢測技術(shù)的復雜度并確保檢測結(jié)果的準確性，完成高效率、高精準度以及低成本的檢測過程是未來基于微流控芯片的CTCs檢測領(lǐng)域的研究重點。

5 結(jié)論

微流控芯片檢測循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）作為一種具有高度可重復性和可行性的新型診斷工具，在腫瘤轉(zhuǎn)移的早期診斷、檢測以及預后鑒定等方面的作用是顯著的。該文深入探討了該領(lǐng)域的最新進展，分析了當前各種檢測方式的優(yōu)劣勢。可以看出，大部分的檢測過程都不是采用單一方式。單一方式有缺陷，需要結(jié)合多種方式才能準確分離CTCs。為了使循環(huán)腫瘤細胞分離的方法更便捷，在研究過程中可以結(jié)合多種檢測方式，實現(xiàn)多功能多模式的檢測。各種檢測方式的組合，必定可以起到事半功倍的效果。隨著各種研究方式和檢測技術(shù)的改進，包括敏感性和特異性的不斷提高，微流控芯片檢測分離循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）必定會在臨床腫瘤診治中得到廣泛推廣及應(yīng)用。

參考文獻：

[1] Cristofanilli M， Medndelsohn J. Circulating tumor cells in breast cancer：Advanced tools for “tailored”therapy [J]. Proc Natl Acad Sci，2006（46）：17073-17074.

[2] Paterlini-Brechot P， Benali NL. Circulating tumor cells（CTC）detection：clinical impact and future directions[J]. Cancer Lett， 2007：180-204.

[3] Review：Xiaoshen Dong， Katherine R.Alpaugh， Massimo Cristofanilli. Circulating tumor cells（CTCs） in breast cancer： a diagnostic tool for prognosis and molecular analysis[J].Chin J Cancer Res， 2012：402-407.

[4] Mostert B， Sleijfer S， Foekens JA， Gratama JW. Circulating tumor cells（CTCs）：detection methods and their clinical relevance in breast cancer[J]. Cancer Treat Rev ，2009：463-474.