簡賀君　謝俊剛

摘 要：分別用三抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)兩種方法，檢測20尾采集自廣東省肇慶市的典型白肉病癥狀羅氏沼蝦肌肉中的諾達(dá)病毒。檢測結(jié)果是兩種方法陽性檢出率均為95%。結(jié)果表明，兩種方法均能有效的應(yīng)用在實(shí)驗(yàn)室檢測羅氏沼蝦諾達(dá)病毒。

關(guān)鍵詞：羅氏沼蝦；諾達(dá)病毒；三抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

中圖分類號 S966.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）08-151-03

Abstract：Three antibodies sandwich ELISA，reverse transcriptase polymerase chain reaction were used respectively to detect the Nodavirus from the muscle of 20 Macrobrachium Rosenbergii collected from Zhaoqing City，Guangdong Province，which have typical symptoms of white meat disease. The positive rate tested from these two methods was the same： 95%. The results of the comparison showed that both methods are effective on laboratory detection of Macrobrachium Rosenbergii Nodavirus.

Key words：Macrobrachium Rosenbergii；Nodavirus；Three antibody sandwich ELISA；Reverse transcriptase polymerase chain reaction

羅氏沼蝦（Macrobrachium Rosenbergii）又名馬來西亞大蝦，屬節(jié)肢動物門，甲殼綱，十足目，長臂蝦科，蝦科屬，原產(chǎn)東南亞[1]。羅氏沼蝦白濁病主要危害育苗期間的蝦苗，蝦苗淡化后放養(yǎng)到池塘3～5周內(nèi)較易發(fā)生，其發(fā)病率一般為30%～70%，蝦苗感染后死亡率高達(dá)90%，給我國羅蝦養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

對于白濁病病原的研究，國外有學(xué)者從發(fā)病羅氏沼蝦體內(nèi)分離出病毒粒子[3]，錢冬等也發(fā)現(xiàn)羅氏沼蝦白濁病病原是羅氏沼蝦諾達(dá)病毒（Macrobrachium rosenbergii Nodavirus，MrNV）[4，5]。MrNV病毒粒子呈廿面體，無囊膜，大小為23～25nm，病毒核酸為單鏈RNA，由2個片段組成，分別為3.0kb和1.3kb[6]。這種病毒傳染性極強(qiáng)，蝦苗感染病毒后可在7d左右出現(xiàn)癥狀，目前該病仍缺乏行之有效的控制方法。

患白濁病的蝦苗呈現(xiàn)典型的肌肉白濁狀，所以在生產(chǎn)中一般通過肉眼觀察來判斷蝦苗是否攜帶病毒。但此法容易造成誤判，一是因?yàn)閹Ф疚r苗可能不表現(xiàn)出典型的肌肉白濁狀，二是因?yàn)槠渌蛞部梢鹞r苗肌肉白濁，例如細(xì)菌感染、水質(zhì)影響或化學(xué)藥物作用。目前實(shí)驗(yàn)室有以下方法可檢測此病毒：（1）電鏡觀察：取待檢蝦苗勻漿離心后，將上清液滴片做電鏡觀察，如發(fā)現(xiàn)23～25nm的病毒顆粒可確定為病毒感染。（2）病毒核酸鑒定：取待檢蝦苗，提取病毒核酸后電泳，看是否存在諾達(dá)病毒典型核酸。（3）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定法（TAS-ELISA）[7]：利用抗原抗體的相互作用，檢測蝦苗是否攜帶病毒。（4）RT-PCR法：提取待檢蝦苗中的病毒核酸，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增病毒核酸進(jìn)行檢測，靈敏度較高。

本文采用了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定法和RT-PCR法檢測羅氏沼蝦諾達(dá)病毒，通過檢測結(jié)果對兩種檢測方法進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 羅氏沼蝦樣品 羅氏沼蝦蝦苗于2008年4月～8月采集自廣東省肇慶市，挑取典型白濁癥狀蝦苗40尾，規(guī)格2～4cm，-20℃保存。

1.2 試劑 兔抗病毒血清、鼠抗諾達(dá)單克隆抗體、引物、標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品、標(biāo)準(zhǔn)陰性樣品均由浙江省淡水水產(chǎn)研究所魚病研究室錢冬教授惠贈。辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗鼠抗體、RT-PCR試劑盒、Trizol RNA抽提試劑購自寶生物工程（大連）有限公司。

包被液：碳酸緩沖液，0.01mol/L，pH9.6；封閉液：體積分?jǐn)?shù)5%的小牛血清溶液（小牛血清50mL，1×PBS 950mL）；洗滌液：含0.05%Tween-20的pH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBST，pH7.4）；酶標(biāo)二抗：羊抗兔IgG的羊IgG-HRP；底物液：磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液，pH5.0，OPD 4mg/mL，H2O2 1.5μL/mL；終止液：2mol/L H2SO4。

1.3 TAS-ELISA操作步驟[8] （1）用包被液適當(dāng)稀釋兔抗血清，每孔100μL包被96孔ELISA板，烘箱內(nèi)（37℃）放置1h后4℃下過夜備用。（2）包被好的ELISA板，用含0.05%Tween-20的pH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBST）洗滌3次，5min/次，甩干，將酶標(biāo)板倒扣于濾紙上，吸去多余水分。（3）5%小牛血清/PBS溶液（小牛血清50mL，1×PBS 950mL），加入樣品孔，37℃下封閉1h。（4）每孔加入100μL適當(dāng)稀釋的病毒樣品、抗病毒單抗、辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗小鼠抗體等樣品，加樣后于37℃下孵育1h后用PBST洗滌3次，5min/次，甩干，將酶標(biāo)板倒扣于濾紙上，吸去多余水分。（5）每孔加入OPD底物應(yīng)用液，反應(yīng)15min后，每孔加入50μL的終止液。使用酶標(biāo)儀測定490nm處OD值。

1.4 RT-PCR操作步驟

1.4.1 RNA提取 取適量待檢羅氏沼蝦肌肉，加入適量的trizol試劑后勻漿，室溫靜置5min，加入1/5trizol體積量的氯仿，振蕩混勻，室溫靜置5min，12 000g4℃離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管，加入與上清液等體積的異丙醇，室溫靜置10min，12 000g4℃離心10min，向沉淀中加入1mL的75%乙醇清洗沉淀，12 000g4℃離心5min，棄上清保留沉淀，干燥。然后加入20μLDEPC處理過的水溶解沉淀，待用。endprint

1.4.2 RT-PCR反應(yīng)體系 采用50μL反應(yīng)體系。其中：10×One Step RNA PCR Buffer 5μL，MgCl2（25mM） 10μL，dNTP Mixture（各10mM）5μL，RNase Inhibitor（40U/μL）1μL，AMV RTase XL（5U/μL）1μL，AMV-Optimized Taq（5U/μL）1μL，Control F-1 Primer（20μM）1μL，Control R-1 Primer（20μM）1μL，Positive Control RNA 1μL，RNase Free dH2O 24μL。

按以下條件進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)：50℃15min；94℃2min；然后94℃30s，60℃30s，72℃1.5min循環(huán)30次。

1.4.3 電泳 取10μLPCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（EB）染色20min，觀察結(jié)果。

1.5 檢測結(jié)果比對 分別利用TAS-ELISA法和RT-PCR法對羅氏沼蝦樣品進(jìn)行檢測，計算陽性檢出率。

2 結(jié)果

分別利用TAS-ELISA法和RT-PCR法對2008年4月～8月采集的羅氏沼蝦樣品進(jìn)行檢測（結(jié)果見表1、表2）。由表1可見，發(fā)病癥狀均為白濁的羅氏沼蝦樣品檢測結(jié)果并非全為病毒陽性，可能與其它原因引起的白濁有關(guān)。TAS-ELISA和RT-PCR兩種方法均可有效的檢測病毒陽性，且陽性檢出率均為95%。

3 討論

筆者實(shí)驗(yàn)室對2008年期間廣東省肇慶市的羅氏沼蝦蝦苗白濁病進(jìn)行了大規(guī)模的抽樣檢測，采集樣品上百份，利用文中所述兩種檢測方法對所采集蝦苗進(jìn)行檢測，對廣東省肇慶市羅氏沼蝦白濁病的流行情況有了一定的了解。由于羅氏沼蝦白濁病危害較大，因此有效的利用檢測方法，對該病進(jìn)行提前防控是非常有必要的。

目前，TAS-ELISA和RT-PCR兩種檢測羅氏沼蝦諾達(dá)病毒的方法都較為成熟，國內(nèi)都有相關(guān)報道[7，9]。本文采用這兩種較為成熟的方法進(jìn)行檢測應(yīng)用的比對，檢測結(jié)果表明，兩種方法在實(shí)際應(yīng)用中均能有效的檢測羅氏沼蝦諾達(dá)病毒，而且檢出率較高，可靠性強(qiáng)。本次對比試驗(yàn)中出現(xiàn)了樣品具有典型白濁癥狀但檢測結(jié)果為陰性的情況，筆者認(rèn)為這可能是其它原因引起蝦苗肌肉白濁，并非諾達(dá)病毒感染引起。

TAS-ELISA利用包被的兔抗血清對病毒進(jìn)行捕捉，同時通過單克隆抗體的級聯(lián)放大以及對抗原高度特異性，大大提高了檢測的靈敏度和特異性，檢測靈敏度可達(dá)到1ng病毒蛋白。采用此方法檢測，可先將兔抗血清預(yù)包被，待檢測時可隨時使用，檢測過程大耗時約4h。由于結(jié)果測定可以通過酶標(biāo)儀測定，也可肉眼觀察判定，同時實(shí)驗(yàn)操作過程較為簡便，省時省錢，適合批量檢測，所以此法比較適合于基層單位開展病毒檢測工作時使用。

RT-PCR法是通過提取待檢樣品中的病毒RNA，然后通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增病毒的核酸，電泳后觀察是否存在諾達(dá)病毒典型核酸。此法靈敏度極高，可檢出7pg的病毒核酸。檢測過程耗時約6h。但由于提取病毒核酸要求在無RNA酶的環(huán)境下進(jìn)行，所有操作用試劑及吸頭、離心管等都必須經(jīng)RNA酶滅活后使用，而且對于檢測者的實(shí)驗(yàn)技能也有較高要求。此法可作為羅氏沼蝦白濁病確診的檢測方法，適合于實(shí)驗(yàn)條件較為完善的實(shí)驗(yàn)室開展病毒檢測工作時使用。

參考文獻(xiàn)

[1]張?zhí)熹?，王玉鳳.羅氏沼蝦染色體研究[J].華中師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2003，10 （2）：126-130.

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[5]Qian D ，Shi Z L，Zhang S，et al .Extra small virus2like particles（XSV） and odavirus associated with whitish muscle disease in thegiant freshwater prawn，Macrobrachium rosenbergii[J].J FishDis，2003，26：521-527.

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[7]錢冬，劉問，潘曉藝，等.羅氏沼蝦諾達(dá)病毒TAS-ELISA檢測法的建立及應(yīng)用研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2006，32（4）：377-382

[8]林清華.免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].武漢： 武漢大學(xué)出版社，1999：254-260.

[9]曾地剛，雷愛瑩.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT- PCR）檢測羅氏沼蝦諾達(dá)病毒[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，37（6）：735-737.

（責(zé)編：張長青）endprint

1.4.2 RT-PCR反應(yīng)體系 采用50μL反應(yīng)體系。其中：10×One Step RNA PCR Buffer 5μL，MgCl2（25mM） 10μL，dNTP Mixture（各10mM）5μL，RNase Inhibitor（40U/μL）1μL，AMV RTase XL（5U/μL）1μL，AMV-Optimized Taq（5U/μL）1μL，Control F-1 Primer（20μM）1μL，Control R-1 Primer（20μM）1μL，Positive Control RNA 1μL，RNase Free dH2O 24μL。

按以下條件進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)：50℃15min；94℃2min；然后94℃30s，60℃30s，72℃1.5min循環(huán)30次。

1.4.3 電泳 取10μLPCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（EB）染色20min，觀察結(jié)果。

1.5 檢測結(jié)果比對 分別利用TAS-ELISA法和RT-PCR法對羅氏沼蝦樣品進(jìn)行檢測，計算陽性檢出率。

2 結(jié)果

分別利用TAS-ELISA法和RT-PCR法對2008年4月～8月采集的羅氏沼蝦樣品進(jìn)行檢測（結(jié)果見表1、表2）。由表1可見，發(fā)病癥狀均為白濁的羅氏沼蝦樣品檢測結(jié)果并非全為病毒陽性，可能與其它原因引起的白濁有關(guān)。TAS-ELISA和RT-PCR兩種方法均可有效的檢測病毒陽性，且陽性檢出率均為95%。

3 討論

筆者實(shí)驗(yàn)室對2008年期間廣東省肇慶市的羅氏沼蝦蝦苗白濁病進(jìn)行了大規(guī)模的抽樣檢測，采集樣品上百份，利用文中所述兩種檢測方法對所采集蝦苗進(jìn)行檢測，對廣東省肇慶市羅氏沼蝦白濁病的流行情況有了一定的了解。由于羅氏沼蝦白濁病危害較大，因此有效的利用檢測方法，對該病進(jìn)行提前防控是非常有必要的。

目前，TAS-ELISA和RT-PCR兩種檢測羅氏沼蝦諾達(dá)病毒的方法都較為成熟，國內(nèi)都有相關(guān)報道[7，9]。本文采用這兩種較為成熟的方法進(jìn)行檢測應(yīng)用的比對，檢測結(jié)果表明，兩種方法在實(shí)際應(yīng)用中均能有效的檢測羅氏沼蝦諾達(dá)病毒，而且檢出率較高，可靠性強(qiáng)。本次對比試驗(yàn)中出現(xiàn)了樣品具有典型白濁癥狀但檢測結(jié)果為陰性的情況，筆者認(rèn)為這可能是其它原因引起蝦苗肌肉白濁，并非諾達(dá)病毒感染引起。

TAS-ELISA利用包被的兔抗血清對病毒進(jìn)行捕捉，同時通過單克隆抗體的級聯(lián)放大以及對抗原高度特異性，大大提高了檢測的靈敏度和特異性，檢測靈敏度可達(dá)到1ng病毒蛋白。采用此方法檢測，可先將兔抗血清預(yù)包被，待檢測時可隨時使用，檢測過程大耗時約4h。由于結(jié)果測定可以通過酶標(biāo)儀測定，也可肉眼觀察判定，同時實(shí)驗(yàn)操作過程較為簡便，省時省錢，適合批量檢測，所以此法比較適合于基層單位開展病毒檢測工作時使用。

RT-PCR法是通過提取待檢樣品中的病毒RNA，然后通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增病毒的核酸，電泳后觀察是否存在諾達(dá)病毒典型核酸。此法靈敏度極高，可檢出7pg的病毒核酸。檢測過程耗時約6h。但由于提取病毒核酸要求在無RNA酶的環(huán)境下進(jìn)行，所有操作用試劑及吸頭、離心管等都必須經(jīng)RNA酶滅活后使用，而且對于檢測者的實(shí)驗(yàn)技能也有較高要求。此法可作為羅氏沼蝦白濁病確診的檢測方法，適合于實(shí)驗(yàn)條件較為完善的實(shí)驗(yàn)室開展病毒檢測工作時使用。

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（責(zé)編：張長青）endprint

1.4.2 RT-PCR反應(yīng)體系 采用50μL反應(yīng)體系。其中：10×One Step RNA PCR Buffer 5μL，MgCl2（25mM） 10μL，dNTP Mixture（各10mM）5μL，RNase Inhibitor（40U/μL）1μL，AMV RTase XL（5U/μL）1μL，AMV-Optimized Taq（5U/μL）1μL，Control F-1 Primer（20μM）1μL，Control R-1 Primer（20μM）1μL，Positive Control RNA 1μL，RNase Free dH2O 24μL。

按以下條件進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)：50℃15min；94℃2min；然后94℃30s，60℃30s，72℃1.5min循環(huán)30次。

1.4.3 電泳 取10μLPCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（EB）染色20min，觀察結(jié)果。

1.5 檢測結(jié)果比對 分別利用TAS-ELISA法和RT-PCR法對羅氏沼蝦樣品進(jìn)行檢測，計算陽性檢出率。

2 結(jié)果

分別利用TAS-ELISA法和RT-PCR法對2008年4月～8月采集的羅氏沼蝦樣品進(jìn)行檢測（結(jié)果見表1、表2）。由表1可見，發(fā)病癥狀均為白濁的羅氏沼蝦樣品檢測結(jié)果并非全為病毒陽性，可能與其它原因引起的白濁有關(guān)。TAS-ELISA和RT-PCR兩種方法均可有效的檢測病毒陽性，且陽性檢出率均為95%。

3 討論

筆者實(shí)驗(yàn)室對2008年期間廣東省肇慶市的羅氏沼蝦蝦苗白濁病進(jìn)行了大規(guī)模的抽樣檢測，采集樣品上百份，利用文中所述兩種檢測方法對所采集蝦苗進(jìn)行檢測，對廣東省肇慶市羅氏沼蝦白濁病的流行情況有了一定的了解。由于羅氏沼蝦白濁病危害較大，因此有效的利用檢測方法，對該病進(jìn)行提前防控是非常有必要的。

目前，TAS-ELISA和RT-PCR兩種檢測羅氏沼蝦諾達(dá)病毒的方法都較為成熟，國內(nèi)都有相關(guān)報道[7，9]。本文采用這兩種較為成熟的方法進(jìn)行檢測應(yīng)用的比對，檢測結(jié)果表明，兩種方法在實(shí)際應(yīng)用中均能有效的檢測羅氏沼蝦諾達(dá)病毒，而且檢出率較高，可靠性強(qiáng)。本次對比試驗(yàn)中出現(xiàn)了樣品具有典型白濁癥狀但檢測結(jié)果為陰性的情況，筆者認(rèn)為這可能是其它原因引起蝦苗肌肉白濁，并非諾達(dá)病毒感染引起。

TAS-ELISA利用包被的兔抗血清對病毒進(jìn)行捕捉，同時通過單克隆抗體的級聯(lián)放大以及對抗原高度特異性，大大提高了檢測的靈敏度和特異性，檢測靈敏度可達(dá)到1ng病毒蛋白。采用此方法檢測，可先將兔抗血清預(yù)包被，待檢測時可隨時使用，檢測過程大耗時約4h。由于結(jié)果測定可以通過酶標(biāo)儀測定，也可肉眼觀察判定，同時實(shí)驗(yàn)操作過程較為簡便，省時省錢，適合批量檢測，所以此法比較適合于基層單位開展病毒檢測工作時使用。

RT-PCR法是通過提取待檢樣品中的病毒RNA，然后通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增病毒的核酸，電泳后觀察是否存在諾達(dá)病毒典型核酸。此法靈敏度極高，可檢出7pg的病毒核酸。檢測過程耗時約6h。但由于提取病毒核酸要求在無RNA酶的環(huán)境下進(jìn)行，所有操作用試劑及吸頭、離心管等都必須經(jīng)RNA酶滅活后使用，而且對于檢測者的實(shí)驗(yàn)技能也有較高要求。此法可作為羅氏沼蝦白濁病確診的檢測方法，適合于實(shí)驗(yàn)條件較為完善的實(shí)驗(yàn)室開展病毒檢測工作時使用。

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[8]林清華.免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].武漢： 武漢大學(xué)出版社，1999：254-260.

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