腫瘤酸性pH分子顯像研究進展

胡 鴻, 唐剛?cè)A，胡孔珍

(1.人民醫(yī)院 放射科，湖南 東安 425900；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科PET-CT中心，廣州 510080)

人體體液保持著嚴格的酸堿平衡[1]。體液中含量最多的碳酸氫鹽/二氧化碳(HCO3-/CO2)緩沖體系在維持體液酸堿動態(tài)平衡中起著重要的作用。細胞外液主要緩沖物質(zhì)為HCO3-(NaHCO3)，在碳酸酐酶作用下，體內(nèi)HCO3-和CO2發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，能夠調(diào)節(jié)緩沖體液微弱酸堿變化，從而維持體內(nèi)酸堿動態(tài)平衡[2-3]。

許多疾病狀態(tài)諸如炎癥、缺血、癌癥和腎臟疾病等都涉及pH變化(酸堿失衡)。研究表明，幾乎所有腫瘤細胞內(nèi)液pHi(7.0～7.2)和腫瘤細胞外液pHe(6.2～6.9)都低于正常組織(pH 7.3～7.4)[1，4-6]，組織細胞pH變化是代謝過程、質(zhì)子轉(zhuǎn)運和緩沖作用的綜合結(jié)果[1]，測定體液pH可為酸堿失衡引起的疾病提供參考，腫瘤pH顯像是分子顯像重要研究領(lǐng)域。近年來，磁共振顯像(MRI)、磁共振波譜分析(MRS)、核醫(yī)學(xué)顯像和光學(xué)成像已用于臨床前pH顯像研究，在涉及酸堿失衡的診斷和療效監(jiān)測方面具有較好應(yīng)用前景，為進一步將無創(chuàng)傷性顯像技術(shù)轉(zhuǎn)化為臨床腫瘤pH分子顯像奠定了基礎(chǔ)。本文對腫瘤酸性pH分子顯像最新研究進展進行綜述。

1 pH分子探針

理想的pH分子探針應(yīng)符合以下條件[7]：(1)能夠部分電離，即以離子化形式和非電離形式存在，離子化形式濃度和非電離形式濃度比值([離子化形式]/[非電離形式])與pH成比例，滿足Henderson-Hasselbalch方程：pH=pKa+lg([離子化形式]/[非電離形式])，其中pKa為酸電離常數(shù)Ka的負對數(shù)；(2) 分子探針不會改變組織pH變化；(3) pH分子探針組織區(qū)室化分布已知；(4) 分子探針為無毒；(5)不依賴分子探針濃度；(6)快速檢測pH變化。pH分子探針主要包括磁共振分子顯像(MRMI)探針、核醫(yī)學(xué)分子顯像探針和光學(xué)分子顯像探針，其他方面的影像分子探針應(yīng)用較少。

1.1 pH磁共振分子顯像探針

用于檢測pH的磁共振分子顯像(MRMI) 探針較多，包括磁共振波譜(MRS)分子探針和磁共振顯像(MRI)造影劑。檢測pH的MRS分子探針一般是基于依賴和非依賴pH共振間化學(xué)位移變化的原理而設(shè)計，分為MRS探針和MRS顯像(MRSI)探針。近年來報道較多的MRS探針有：3-[N-(4-氟-2-三氟甲基-苯基)-磺?；鵠-丙酸(ZK-150471)，用于19F-MRS檢測細胞外pH (pHe)[8]；無機磷酸鹽(Pi)，用于31P-MRS檢測細胞內(nèi)pH(pHi)[8]；3-氨基磷酸丙酯(3-APP)，用于31P-MRS檢測pHe[7-8]。1H MRSI探針 (±)2-(咪唑-1-基)-丁二酸 (ISUCA)和(±)2-咪唑-1-基-3-乙氧羰基丙酸(IEPA)的應(yīng)用，可提高31P和19F檢測pHe的靈敏性，但其空間和時間分辨率仍有限[1,8]。

目前，MRMI探針主要發(fā)展為三大類：動態(tài)核極化(DNP) MRS/MRSI探針、馳豫MRI探針和化學(xué)交換飽和轉(zhuǎn)移(CEST) MRI探針，常用MRMI探針列于表1。 DNP能顯著提高MRS的靈敏度，該技術(shù)是基于微波轟擊樣品，將不成對電子極性轉(zhuǎn)化為鄰近核極性，以提高MRS信號強度[1]。目前，主要的DNP 探針有：89Y-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷基- N,N′,N″,N?-四(甲叉磷酸)(89Y-DOTP)，用于DNP89Y-MRS檢測pHe[7]；超極化13C-標記碳酸氫鹽，用于DNP13C-MRS/MRSI檢測pHe和pHi[2,7-8]；1-13C-丙酮酸鹽(Pyruvate)，用于DNP MRSI檢測心肌細胞內(nèi)pHi[7,9]。馳豫MRI是通過pH依賴性馳豫劑擾動水的弛豫，實現(xiàn)對pH顯像。馳豫MRI探針報道較少，如157Gd-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷基-1,4,7,10-四乙酰胺基-四磷酸酯(Gd-DOTA-4AmP5-)和163Dy-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷基-N,N′,N″,N?-四(甲叉磷酸，Dy-DOTP)聯(lián)合應(yīng)用，可檢測pHe[7-8]。CEST MRI與傳統(tǒng)造影劑不同，可通過轉(zhuǎn)移飽和質(zhì)子達到減低水分子信號(T1和T2*)而產(chǎn)生陰性對比，主要分為以下三類。 早期使用的小分子如糖類、氨基酸類、銨離子、雜環(huán)化合物等探針，屬于反磁性CEST (diaCEST) 探針，如碘帕醇(Iopamidol)[10]和碘普胺(Iopromide)[11]；而使用鑭系元素合成的173Yb-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷基-1,4,7,10-四乙酸, 10-鄰氨基苯胺(Yb-DO3A-oAA)[1]等，為順磁性CEST (paraCEST)探針；對體內(nèi)微量的蛋白質(zhì)、多肽CEST 成像，這些內(nèi)源性可變蛋白質(zhì)和多肽則成為酰胺質(zhì)子轉(zhuǎn)移(APT)[12]MRI探針。

表1 檢測pH的MRMI 探針

續(xù)表

1.2 pH核醫(yī)學(xué)分子探針

用于檢測pH的核醫(yī)學(xué)分子探針，包括正電子發(fā)射斷層(PET)顯像分子探針和單光子發(fā)射斷層(SPECT)顯像分子探針。吸入11CO2[13]或注射[2-11C]5,5-二甲基噁唑烷-2,4-二酮(DMO)[14]已初步用于臨床PET檢測pH。兩種pH分子探針檢測pH的原理是基于探針離子化形式濃度和非電離形式濃度比值([離子化形式]/[非電離形式])與pH成比例。但由于吸入11CO2操作較麻煩，DMO合成較困難，且其靈敏度有限，因而限制了臨床[7]。最近，國外研究者研制了一種可選擇性靶向體內(nèi)酸性組織的低pH插入肽(pHLIP)，并用64Cu標記pHLIP (64Cu-pHLIP，圖1)。在酸性的細胞外環(huán)境而不是正常生理pH下，pHLIP主要以單聚α-螺旋形式插入在脂質(zhì)雙分子層中，因而，64Cu-pHLIP PET可用于檢測腫瘤pH[1,7,15]。最近，99Tcm標記pHLIP和18F-D-WT-pHLIP(圖1)，也已分別用于SPECT 和PET檢測腫瘤pH[16]。

1.3 pH光學(xué)分子顯像探針

檢測pH的光學(xué)分子探針是光學(xué)分子顯像重要研究領(lǐng)域，許多光學(xué)分子探針已用于腫瘤pH檢測。pH光學(xué)分子探針的作用機理主要包括：(1)基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PeT)效應(yīng)[5]，如酸性和堿性媒介中小分子氨基苯基BODIPY探針 (Aminophenyl BODIPY，結(jié)構(gòu)示于圖2a)[17]與酸性和堿性媒介中環(huán)狀小分子精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽-染料探針(Dye-cRGD，結(jié)構(gòu)示于圖2b)[18]。質(zhì)子化的Aminophenyl BODIPY和Dye-cRGD熒光增強，去質(zhì)子化的Aminophenyl BODIPY和Dye-cRGD幾乎無熒光。(2)基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效應(yīng)[5]，如量子點(QD)裝配多巴胺和多肽探針(QD-Dopamine-Peptide,結(jié)構(gòu)示于圖2c)[19]。在低pH時，主要以氫醌形式存在的QD-Dopamine-Peptide作為差的電子接受體，導(dǎo)致低光致發(fā)光淬滅(QD PL)現(xiàn)象。隨著pH增加，緩沖液周邊氧氣氧化多巴胺，生成H2O2和苯醌。以苯醌形式存在的QD-Dopamine-Peptide作為好的電子接受體，引起較高效率的光致發(fā)光淬滅現(xiàn)象。(3) 基于自聚集相關(guān)能量轉(zhuǎn)移(SAET)效應(yīng)[5]，如右旋糖苷納米探針(Dextran-NP，結(jié)構(gòu)示于圖2d)[20]。在生理酸性環(huán)境中，腙鍵斷裂導(dǎo)致熒光恢復(fù)。(4) 基于選擇性靶向體內(nèi)酸性組織脂質(zhì)雙分子層[21]，如熒光基(Cy5.5和Alexa750)標記pHLIP，用于光學(xué)顯像pH[6,21-23]。近年來，熒光比率顯像探針和熒光壽命顯像探針已發(fā)展成為兩類重要的pH光學(xué)分子探針，前者基于檢測發(fā)射光譜，后者基于檢測探針壽命[1]。熒光壽命顯像探針又分為時域熒光探針和頻域熒光探針[1]。熒光比率顯像探針的發(fā)展是pH光學(xué)分子顯像的重要選擇，如基于無機材料QD的比率納米探針、基于合成聚合物的比率納米探針和基于噬菌體的比率納米探針[5]，但pH熒光壽命顯像探針報道相對較少，如QD和綠色熒光蛋白納米熒光壽命探針。

圖1 64Cu-pHLIP 、99Tcm-AH114567和18F-D-WT-pHLIP的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of 64Cu-pHLIP, 99Tcm-AH114567, and 18F-D-WT-pHLIP

圖2 典型pH光學(xué)分子探針的結(jié)構(gòu)。a— Aminophenyl BODIPY；b—Dye-cRGD；c—QD-Dopamine-Peptide；d—Dextran-NPFig.2 Typical structure of fluorescent pH probesa—Aminophenyl BODIPY；b—Dye-cRGD；c— QD-Dopamine-Peptide；d—Dextran-NP

2 pH分子顯像的應(yīng)用

2.1 pH磁共振分子顯像

檢測pH的 MRMI方法分為依賴pH化學(xué)位移技術(shù)、依賴磁化傳遞技術(shù)和依賴pH馳豫技術(shù)。早期使用的依賴pH化學(xué)位移技術(shù)主要包括1H、31P、19F和89Y MRS/MRSI。31P-MRS利用內(nèi)源性Pi化學(xué)位移可檢出pHi，同時利用外源性3-APP化學(xué)位移可檢出pHe[1]。利用維生素B6氟化衍生物，19F-MRS可檢出pHe和pHi[7]。由于這些探針具有低靈敏度，因而MRS很難獲得高分辨率的pH圖譜。為進一步提高其檢測靈敏度，利用IEPA的pH敏感H2磁共振波譜分析共振可改善1H-MRS檢測腫瘤(如乳腺癌和腦瘤)pH靈敏度[1,7,24]。盡管這些方法可檢出腫瘤pHe，但其時間和空間分辨率仍有限。

動態(tài)核極化(DNP)是依賴pH化學(xué)位移技術(shù)，可顯著提高MRI靈敏度[2,25]。利用超極化13C標記探針和89Y標記探針的化學(xué)位移變化，MRS/MRSI已用于腫瘤pH的檢測。超極化1-13C-丙酮酸鹽DNP技術(shù)已用于檢測健康和疾病心臟的pHi[26]，也可監(jiān)測腫瘤組織代謝變化[27]，但是否可用于腫瘤pH檢測，尚無文獻報道。Gallagher等[2]報道用超極化13C-標記碳酸氫鹽檢測腫瘤pH，顯示很好應(yīng)用前景，可望用于臨床。荷瘤模型動物體內(nèi)注射超極化13C-碳酸氫鹽后，測定超極化H13CO3-和13CO2信號強度比值，采用Henderson-Hasselbalch方程估算腫瘤組織pH/pHe。結(jié)果表明，13C-標記碳酸氫鹽DNP技術(shù)可望用于涉及腫瘤、缺血和炎癥等組織內(nèi)pH變化的臨床病理過程顯像。89Y-DOTP已用于DNP89Y-MRS檢測pH，可顯著提高靈敏度[28]，但尚無活體pH顯像研究報道。

化學(xué)交換飽和轉(zhuǎn)移(CEST)屬于依賴磁化傳遞技術(shù)，采用體相水和探針分子間的磁化傳遞MRI來評估檢測腫瘤組織pH，包括反磁性CEST (diaCEST)、順磁性CEST(paraCEST)和酰胺質(zhì)子轉(zhuǎn)移(APT) CEST[1,7]。用Yb-DO3A-oAA paraCEST檢測MDA-MB-231乳腺腫瘤組織中pH，可獲得乳腺腫瘤組織pH為6.82± 0.21，大腿肌肉pH為 7.26 ±0.14，并可獲得MCF乳腺腫瘤pHe圖譜[1,29]。Chen等[11]報道了用碘普胺(碘帕醇類似物) diaCEST檢測乳腺腫瘤組織pHe，其檢測pHe范圍為6.2～7.2，經(jīng)碳酸氫鹽治療后腫瘤pHe≥7.1，該方法為評估腫瘤酸性提供了無創(chuàng)傷性方法。酰胺質(zhì)子轉(zhuǎn)移(APT)是一種可用于檢測組織中內(nèi)源性可移動蛋白質(zhì)和多肽酰胺質(zhì)子的CEST-MRI技術(shù)，該法不需要注射造影劑，而是基于內(nèi)源性物質(zhì)(探針)。APT MRI在檢測模型腫瘤pH方面具有較大潛力，近來Zhou等[12]已將該技術(shù)用于人腦腫瘤APT MRI研究，顯示較好應(yīng)用前景。

MR馳豫技術(shù)是基于用pH依賴馳豫造影劑擾動水的馳豫進行腫瘤組織pH檢測，通常分為單注射法和雙注射法。最常用的MR馳豫造影劑為Gd或Dy絡(luò)合物造影劑，如Gd-DOTA-4AmP5-和Dy-DOTP。Garcia-Martin等[30]采用雙注射法，即先后注射pH 敏感的Gd-DOTA-4AmP5-和pH非敏感的Dy-DOTP，對荷腦膠質(zhì)瘤大鼠的腦瘤組織進行pH MRI顯像。Martinez等[31]采用單注射法，共同注射pH 敏感的Gd-DOTA-4AmP5-和pH非敏感的Dy-DOTP，對腦膠質(zhì)瘤模型進行pH MRI顯像。單注射法具有較高空間分辨率，是較實用的臨床檢測腫瘤pH方法。

2.2 pH核醫(yī)學(xué)分子顯像

pH核醫(yī)學(xué)分子顯像，包括PET顯像和SPECT顯像。持續(xù)吸入11CO2用于腦瘤病人PET顯像，檢測腦瘤組織pH，結(jié)果顯示腦瘤組織有一定程度放射性攝取[13]。但由于吸入11CO2操作較麻煩，且靈敏度不夠理想，因而11CO2應(yīng)用于臨床PET顯像有限[7]。注射DMO也已初步用于PET檢測腦瘤病人腦瘤組織pH[14]，但DMO合成較困難，且不能準確檢測pH，因而未被廣泛應(yīng)用于臨床PET顯像[7]。唐剛?cè)A等[32]利用回旋加速器生產(chǎn)的11C-CO2，通過NaOH在柱吸附，用稀鹽酸或NaH2PO4緩沖液中和后，即可得11C-碳酸氫鹽緩沖液(11C-HCO3-/11C-CO2) 酸堿失衡顯像劑，用于各種與酸堿失衡有關(guān)疾病(如腫瘤和炎癥)的PET顯像，可望迅速轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。近年來，pHLIP是研究比較熱門的多肽，可作為廣范腫瘤標志物[6,23]。Vavere等[15]研制了64Cu-pHLIP，用于PET檢測前列腺癌組織pHe，結(jié)果表明，低pHe前列腺癌組織可高度攝取64Cu-pHLIP，從而為酸性實體瘤的診斷提供了PET分子顯像新方法。Daumar等[33]研制了18F-D-WT-pHLIP，用于PET檢測前列腺癌組織pHe，獲得了與64Cu-pHLIP 相類似的pH PET顯像結(jié)果。Macholl 等[16]用99Tcm標記pHLIP制備了99Tcm-AH114567，用于SPECT 檢測多種腫瘤pH，展現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。但放射性核素標記pHLIP轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用仍需要進一步研究。

2.3 pH光學(xué)分子顯像

pH光學(xué)分子顯像主要集中基于PeT熒光探針、FRET熒光探針、SAET熒光探針和pHLIP熒光探針的應(yīng)用?；赑eT的小分子熒光探針Aminophenyl BODIPY，在細胞內(nèi)可通過溶酶體pH變化而被活化。體內(nèi)外實驗表明， BODIPY熒光探針與靶向腫瘤單克隆抗體的結(jié)合物，可特異性靶向結(jié)合活的癌細胞。這些結(jié)合物可用于腫瘤檢測及實時治療監(jiān)測，也可為評估細胞內(nèi)受體動力學(xué)、細胞活性和實時細胞死亡監(jiān)測提供體外工具[17]。另外，靶向整合素小分子近紅外pH活化熒光探針Dye-cRGD可用于活體顯像來探測原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性乳腺癌，并具有較高的特異性和靈敏度[18]?；贔RET的QD-Dopamine-Peptide熒光納米探針已用于檢測細胞質(zhì)中pH變化，但并未見活體腫瘤pH檢測的研究報道[19]?；赟AET的熒光納米探針Dextran-NP，體外光聲顯像表明，Dextran-NP探針能夠區(qū)分癌癥細胞和正常細胞。另外，活體雙波長光聲顯像表明，Dextran-NP探針能夠鑒別模型動物乳腺腫瘤組織和周圍正常組織。結(jié)果表明，Dextran-NP探針可無創(chuàng)檢測在正常生理和酸性環(huán)境中的早期腫瘤，并具有較高光學(xué)對比度[20]。標記pHLIP用于靶向腫瘤酸性光學(xué)顯像是近年來研究的熱點領(lǐng)域。Andreev等[21]用熒光基(Cy5.5或Alexa750)標記pHLIP，研究了靶向腫瘤酸性組織細胞膜肽的機理和用途，結(jié)果表明，熒光標記pHLIP可望用于腫瘤和炎癥pH顯像。Reshetnyak等[22]用熒光基(Cy5.5或Alexa750)標記pHLIP，對荷瘤模型酸性腫瘤pH行光學(xué)顯像，結(jié)果表明，標記pHLIP可特異地結(jié)合轉(zhuǎn)移性腫瘤和非轉(zhuǎn)移性腫瘤組織，為原發(fā)性腫瘤、轉(zhuǎn)移性腫瘤和壞死組織脂質(zhì)體診斷提供新方法。最近，Weerakkody等[23]用熒光標記pHLIP研究了pHLIP靶向腫瘤作用，為進一步研制新型靶向酸性腫瘤pH的pHLIP分子探針提供了實驗依據(jù)。

熒光比率顯像和熒光壽命顯像是兩類重要的pH光學(xué)分子顯像方法[1]。目前熒光比率顯像應(yīng)用于腫瘤pH檢測報道較多，但主要局限于體外pH檢測。由于熒光比率顯像是基于熒光強度的測量方法，容易受激發(fā)光強度、 樣品猝滅和熒光染料的濃度分布等因素的影響，難以做到準確定量測量。而熒光壽命顯像一般來說是絕對的, 不受激發(fā)光強度、 熒光團濃度和光漂白等因素的影響, 僅與熒光團所處的微環(huán)境密切相關(guān)。因此，pH熒光壽命顯像是pH光學(xué)分子顯像的重要發(fā)展方向，但目前其應(yīng)用有限。

3 小結(jié)

酸性pH是一種通用的腫瘤生物標志物，靶向酸性pH分子探針的研制是目前分子影像學(xué)熱門研究領(lǐng)域。靶向酸性pH分子探針，已用于腫瘤磁共振分子顯像、核醫(yī)學(xué)顯像和光學(xué)顯像。用于靶向酸性pH磁共振分子顯像探針研究較多，但用于臨床腫瘤顯像的研究報道很有限。近年來，pH核醫(yī)學(xué)顯像發(fā)展較快，但具有較好臨床應(yīng)用前景的pH探針很少。用于光學(xué)顯像的pH分子探針也有較多報道，但主要集中在臨床前研究階段。用于超聲顯像的pH分子探針尚未發(fā)現(xiàn)文獻報道。

參考文獻：

[1] Zhang X, Lin Y, Gillies RJ. Tumor pH and its measurement[J]. J Nucl Med, 2010, 51:1 167-1 170.

[2] Gallagher FA, Kettunen MI, Day SE, et al. Magnetic resonance imaging of pH in vivo using hyperpolarized13C-labelled bicarbonate[J]. Nature, 2008, 453: 940-943.

[3] Casey JR. Why bicarbonate[J]. Biochem Cell Biol, 2006, 84: 930-939.

[4] Wu Y, Zhang W, Li J, et al. Optical imaging of tumor microenvironment[J]. Am J Nucl Med Mol Imaging, 2013, 3(1):1-15.

[5] Wang L, Li C. pH responsive fluorescence nanoprobe imaging of tumors by sensing the acidic microenvironment[J]. J Mater Chem, 2011, 21: 15 862-15 871.

[6] Fendos J, Engelman D. pHLIP and acidity as a universal biomarker for cancer[J]. Yale J Biol Med, 2012, 85: 29-35.

[7] Gallaghera FA, Kettunena MI, Brindle KM. Imaging pH with hyperpolarized13C[J]. NMR Biomed, 2011, 24: 1 006-1 015.

[8] Hashim AI, Zhang X, Wojtkowiak JW, et al. Imaging pH and metastasis[J]. NMR Biomed, 2011, 24(6):582-591.

[9] Schroeder MA, Swietach P, Atherton HJ,et al. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate: a13C and31P magnetic resonance spectroscopy study[J]. Cardiovascular Res, 2010, 86, 82-91.

[10] Aime S, Calabi L, Biondi L, et al. Iopamidol: exploring the potential use of a well established X-ray contrast agent for MRI[J]. Magn Reson Med, 2005, 53:830-834.

[11] Chen LQ, Howison CM, Jeffery JJ, et al. Evaluations of extracellular pH within in vivo tumors using acidoCEST MRI[J]. Magn Reson Med, 2013： 26. doi: 10.1002/mrm.25053.

[12] Zhou J, Blakeley JO, Hua J, et al. Practical data acquisition method for human brain tumor amide proton transfer (APT) imaging[J]. Magn Reson Med, 2008, 60:842-849.

[13] Brooks DJ, Beaney RP, Thomas DGT, et al. Studies on regional cerebral pH in patients with cerebral tumours using continuous inhalation of11CO2and positron emission tomography[J]. J Cerebral Blood Flow Metabolism, 1986, 6:529-535.

[14] Rottenberg DA, Ginos JZ, Kearfott KJ, et al. In vivo measurement of brain tumor pH using [11C]DMO and positron emission tomography[J]. Ann Neurol, 1985, 17(1): 70-79.

[15] Vavere AL, Biddlecombe GB, Spees WM, et al. A novel technology for the imaging of acidic prostate tumors by positron emission tomography[J]. Cancer Res, 2009, 69(10):4 510-4 516.

[16] Macholl S, Morrison MS, Iveson P, et al. In vivo pH imaging with99Tcm-pHLIP[J]. Mol Imaging Biol, 2012, 14:725-734.

[17] Urano Y, Asanuma D, Hama Y, et al. Selective molecular imaging of viable cancer cells with pH-activatable fluorescence probes[J]. Nat Med, 2009, 15: 104-109.

[18] Lee H, Akers W, Bhushan K, et al. Near-infrared pH-activatable fluorescent probes for imaging primary and metastatic breast tumors[J]. Bioconjug Chem, 2011; 22: 777-784.

[19] Medintz IL, Stewart MH, Trammell SA, et al. Quantum-dot/dopamine bioconjugates function as redox coupled assemblies for in vitro and intracellular pH sensing[J]. Nat Mater, 2010， 9: 676-684.

[20] Huang G, Si Z, Yang S, et al. Dextran based pH-sensitive near-infrared nanoprobe for in vivo differential-absorption dual-wavelength photoacoustic imaging of tumors[J]. J Mater Chem， 2012， 22: 22 575-22 581.

[21] Andreev OA, Dupuy AD, Segala M, et al. Mechanism and uses of a membrane peptide that targets tumors and other acidic tissues in vivo[J]. PNAS, 2007, 104(19): 7 893-7 898.

[22] Reshetnyak YK, Yao L, Zheng S, et al. Measuring tumor aggressiveness and targeting metastatic lesions with fluorescent pHLIP[J]. Mol Imaging Biol, 2011, 13:1 146-1 156.

[23] Weerakkody D, Moshnikova A, Thakur MS, et al. Family of pH (low) insertion peptides for tumor targeting[J]. PNAS, 2013, 110(15): 5 834-5 839.

[24] Bhujwalla ZM, Artemov D, Ballesteros P, et al. Combined vascular and extracellular pH imaging of solid tumors[J]. NMR Biomed, 2002, 15(2): 114-119.

[25] Jindal AK, Merritt ME, Suh EH, et al. Hyperpolarized89Y complexes as pH sensitive NMR probes[J]. J Am Chem Soc, 2010, 132(6): 1 784-1 785.

[26] Schroeder MA, Swietach P, Atherton HJ,et al. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate: a13C and31P magnetic resonance spectroscopy study[J]. Cardiovascular Res, 2010, 86: 82-91.

[27] Golman K, Zandt RI, Lerche M,et al, Ardenkjaer-Larsen JH. Metabolic imaging by hyperpolarized13C magnetic resonance imaging for in vivo tumor diagnosis[J]. Cancer Res, 2006, 66: 10 855-10 860.

[28] Jindal AK, Merritt ME, Suh EH, et al. Hyperpolarized89Y complexes as pH sensitive NMR probes[J]. J Am Chem Soc, 2010, 132(6): 1 784-1 785.

[29] Sheth VR, Li Y, Chen LQ, et al. Measuring in vivo tumor pHe with CEST-FISP MRI[J]. Magn Reson Med, 2012, 67:760-768.

[30] Garcia-Martin ML, Martinez GV, Raghunand N, et al. High resolution pH(e) imaging of rat glioma using pH-dependent relaxivity[J]. Magn Reson Med, 2006, 55:309-315.

[31] Martinez G, Zhang X, Garcia-Martin M, et al. Imaging the extracellular pH of tumors by MRI after injection of a single cocktail of T1 and T2 contrast agents[J]. NMR Biomed, 2011, 24(10): 1 380-1 391.

[32] Tang G, Wang H, Huang T,et al. Positron emission tomography imaging of acid-base imbalance in vivo using11C-labelled bicarbonate buffer[J]. J Nucl Med, 2012, 53 (Supplement 1):1 173.

[33] Daumar P, Wanger-Baumann CA, Pillarsetty NV,et al. Efficient18F labeling of large 37-amino-Acid pHLIP peptide analogues and their biological evaluation[J]. Bioconjugate Chem, 2012, 23:1 557-1 566.