李玲霞，王志巧，羅曉麗，宋麗娜＊，于珊珊，何成彥，趙麗純，李洪軍，趙海豐，武利濤

（1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；2.吉林大學藥學院，吉林 長春130021；3.佳木斯大學第一臨床學院，黑龍江 佳木斯154003；4.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院）

含 CUB 結構域蛋白1（CUB Domain－containing Protein 1，CDCP1）是一種細胞表面糖蛋白。研究證實CDCP1為一種新的干細胞標志物［1］表達失調與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展相關［2－7］。CDCP1為腫瘤輔助診斷及治療的潛在靶點。鑒于目前國內應用的CDCP1抗體制劑多為國外公司進口，因此研制CDCP1抗體制劑，可滿足國內在系統(tǒng)地探討CDCP1在腫瘤發(fā)生發(fā)展、免疫診斷和靶向治療中的需求。

1 材料與方法

1.1 腫瘤細胞株及菌種與質粒

人肺腺癌細胞株A549由吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院檢驗科保存、大腸桿菌 DH5α、BL21（DE3）、pGEX－KG由吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院檢驗科保存。

1.2 主要試劑

Trizol（Invitrogen）、Cloned AMV First－Strand cDNA Synthesis Kit、限制性內切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、rTaq聚合酶、dNTP、T4連接酶（TaKaRa）、膠回收試劑盒、小量質粒提取試劑盒（愛思進生物技術公司）、IPTG、丙烯酰胺、N，N－甲叉雙丙烯酰胺（Sigma）。

引物由上海生工合成，引物序列如下：上游引物：5’－CGC GGATCC ATG AGCTGCCCAGACGGAGTCAC－3’；下游引物：5’－CG GAATTC TCA AGACATCAGGGTTGCTGAGC－3’。

1.3 實驗方法

1.3.1總RNA的提取 按Trizol試劑說明提取肺癌細胞系A549總RNA，測定RNA含量及260 nm和280nm的吸收值的比值。

1.3.2cDNA第一條鏈的合成 按Takara的Cloned AMV First－Strand cDNA Synthesis Kit操作步驟完成。

1.3.3PCR反應 取cDNA 反應液1μl，加入0.5 ml PCR管中，分別加入2mmol／L dNTP 4μl，10×PCR緩沖液5μl，上、下游引物各1μl（10.0pmol／μl），Taq酶2.5U，加DEPC水至終體積50μl，反應條件為94℃變性1min，57℃退火45s，72℃延伸1 min，32個循環(huán)后72℃延伸5min。取9μl PCR擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，在圖像分析處理系統(tǒng)上觀察、記錄電泳結果。

1.3.4表達載體的構建 堿性裂解法小量制備質粒；酶切反應混合物經(jīng)震蕩混勻、孵育后得到的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，純化回收酶切產(chǎn)物并將產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳；將連接反應混合物震蕩混勻，連接過夜；制備轉化的感受態(tài)細胞，涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基表面，放于37℃培養(yǎng)。

1.3.5重組克隆的篩選和鑒定 通過雙酶切及PCR鑒定確認陽性的克隆，進行基因序列測定。測序結果在NCBI Human RefSeq數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，查看所克隆序列是否為目的序列，是否有缺失或者突變。

1.3.6GST－CDCP1 融合蛋白在大腸桿菌中誘導表達 將pGEX－KG／CDCP1轉化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)中，經(jīng)氨芐青霉素篩選轉化后菌落，挑取不同單克隆小量培養(yǎng)，提取質粒雙酶切鑒定。誘導表達前一天將pGEX－KG／CDCP1重組菌（BL21）培養(yǎng)過夜，留1ml菌液做為陰性對照，剩余培養(yǎng)液中加入IPTG誘導表達，離心后將沉淀懸于Tris緩沖液中；取上述制備的懸液與上樣緩沖液混勻，加熱離心后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，染色，洗脫，直至觀察到清晰的條帶。

2 結果

2.1 CDCP1基因的擴增

以肺腺癌細胞株A549的mRNA為模板，應用所設計的引物通過RT－PCR法擴增CDCP1胞外段基因目的片段。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示：在約270bp處擴增出單一條帶，大小與預計相符，見圖1。

2.2 重組質粒pGEX－KG／cdcp1的篩選及鑒定

將PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切后，定向插入同樣經(jīng)雙酶切的pGEX－KG載體中，獲得重組質粒pGEX－KG／CDCP1。經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切、PCR及DNA序列測定對重組質粒進行鑒定，篩選出與GST之間讀碼框架正確的重組質粒，酶切鑒定、PCR鑒定見圖2、圖3。

圖1 RT－PCR擴增CDCP1基因目的片段

圖2 重組質粒pGEX－KG／CDCP1的酶切鑒定

圖3 重組質粒pGEX－KG／CDCP1的PCR鑒定

2.3 融合蛋白GST－CDCP1在大腸桿菌中的誘導表達

含PGEX－KG／CDCP1重組子的BL21用IPTG誘導表達6h后，SDS－PAGE分析可見，與誘導前相比，在相對分子質量約35kD處出現(xiàn)明顯的誘導蛋白條帶，分子質量大小與預期一致，見圖4。

3 討論

CDCP1是一種細胞跨膜糖蛋白。CDCP1表達失調與多種腫瘤相關［8］。有研究比較了結腸腺癌和鄰近正常組織，發(fā)現(xiàn)結腸癌細胞的惡性度與CDCP1染色強度相關［9］。在一項腎細胞癌研究中也觀察到，正常腎臟細胞未檢測到CDCP1表達，而33.5%癌癥病例檢測到CDCP1的表達，而且CDCP1的表達與腫瘤分期、組織學分級和轉移等進展性疾病指標顯著相關。到目前為止有關CDCP1在腫瘤細胞中的功能了解較少，但可明確其為上皮來源腫瘤抗原，并為高轉移性表皮樣癌的腫瘤相關蛋白。CDCP1在細胞與細胞之間及細胞與細胞基質間黏附中起重要作用。CDCP1通過與細胞內多種蛋白質相互作用而發(fā)揮其生物學作用，但目前還了解較少。能力的生物學特征了解的很少。而在正常的肺［10］、結腸［11］、睪丸等組織中檢測到CDCP1低水平表達。CDCP1也是白血病細胞［12］、骨髓和間充質干／祖細胞和神經(jīng)祖細胞［10］。

圖4 SDS－PAGE分析融合蛋白GST－CDCP1的表達

鑒于CDCP1為一種腫瘤相關抗原，且為跨膜蛋白，CDCP1是腫瘤診斷與治療的較理想的靶點［13］。最近應用基因工程抗CDCP1發(fā)現(xiàn)，靶向CDCP1阻斷腫瘤發(fā)展。在體外，該抗體阻斷前列腺癌PC－3細胞的遷移和侵襲［4］。

目前有關CDCP1在腫瘤發(fā)生發(fā)展作用及CDCP1信號傳導系統(tǒng)的研究較少。因此研制新型、價格適宜的CDCP1抗體有助于促進國內進行更廣泛深入的有關CDCP1生物學作用的研究。

本研究構建的重組質粒pGEX－K／CDCP1轉化大腸桿菌后經(jīng)IPTG誘導獲得高效表達。下一步將通過親和層析純化CDCP1－GST融合蛋白，經(jīng)免疫印記鑒定后免疫動物制備多克隆抗體，并通過B淋巴細胞雜交瘤技術制備單克隆抗體，抗體經(jīng)初步純化，選擇肺癌、結腸癌等組織標本和血液標本進行抗體特異性鑒定。

綜上所述，我們成功克隆了CDCP1胞外段基因序列并構建了pGEX－KG／CDCP1原核表達載體。本研究工作，為CDCP1抗體的制備奠定實驗基礎。

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