蔣永亮,尹小虎,沈亞芳,何曉芬,方劍喬

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低頻電針改善SNL模型大鼠早期神經(jīng)痛背根神經(jīng)節(jié)辣椒素受體的機(jī)制

蔣永亮,尹小虎,沈亞芳,何曉芬,方劍喬

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院,杭州 310053)

探討低頻電針干預(yù)早期神經(jīng)痛背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)辣椒素受體(Transient receptor potential vanilloid type 1,TRPV1)的機(jī)制。將32只大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組與電針組,每組8只。采用脊神經(jīng)結(jié)扎的方法制作大鼠神經(jīng)痛模型。取患側(cè)足三里、昆侖穴進(jìn)行2 Hz電針治療,連續(xù)3 d。檢測(cè)大鼠術(shù)側(cè)后足縮腿閾(Paw withdrawal threshold,PWT),L5DRG TRPV1表達(dá)與磷酸化水平。進(jìn)一步開(kāi)展PKC激動(dòng)劑PMA與PKA激動(dòng)劑db-cAMP拮抗2 Hz電針鎮(zhèn)痛作用的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。SNL模型大鼠早期即出現(xiàn)自發(fā)性疼痛,PWT顯著下降(＜0.001),L5DRG TRPV1表達(dá)水平降低(＜0.01),磷酸化水平升高(＜0.001)。SNL假手術(shù)組大鼠PWT沒(méi)有顯著變化。2 Hz電針能提高SNL模型大鼠的PWT(＜0.001),降低L5DRG TRPV1磷酸化水平(＜0.05)。PMA與db-cAMP足部局部注射能拮抗2 Hz電針的抗神經(jīng)痛作用(＜0.001,＜0.001)。早期神經(jīng)痛與損傷DRG TRPV1磷酸化水平升高有關(guān)。低頻電針能改善早期神經(jīng)痛,可能與下調(diào)損傷DRG的TRPV1磷酸化水平有關(guān)。

針刺療法;電針;神經(jīng)痛;脊神經(jīng)結(jié)扎;TRPV1;DRG;大鼠

神經(jīng)病理痛主要表現(xiàn)為痛覺(jué)敏化,如自發(fā)性疼痛、痛覺(jué)過(guò)敏與痛覺(jué)超敏[1],與初級(jí)痛覺(jué)神經(jīng)元的超興奮性有關(guān)[2]。多種離子通道在背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)神經(jīng)元中表達(dá)與功能的上調(diào)能引起初級(jí)痛覺(jué)神經(jīng)元的超興奮性,對(duì)神經(jīng)病理痛的發(fā)生起著重要作用。辣椒素受體(Transient receptor potential vanilloid type 1,TRPV1)是TRPs超家族(一類(lèi)配體門(mén)控陽(yáng)離子通道)中的一員,對(duì)疼痛信號(hào)的產(chǎn)生、傳遞與調(diào)節(jié)起著重要作用[3]。研究表明初級(jí)痛覺(jué)神經(jīng)元TRPV1活化能引起痛覺(jué)敏化[4-7],而其脫敏療法對(duì)多種神經(jīng)痛有效[8],說(shuō)明初級(jí)痛覺(jué)神經(jīng)元TRPV1在神經(jīng)病理痛中起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)探討DRG神經(jīng)元TRPV1參與早期神經(jīng)痛的活化形式,以及低頻電針對(duì)其的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用32只清潔級(jí)健康雄性SD大鼠,體重為(200±10)g,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(滬) 2008-0016],由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間給予嚙齒類(lèi)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼養(yǎng)與自由飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

0.25 mm×13 mm無(wú)菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);HANS-200A穴位神經(jīng)刺激儀(聯(lián)創(chuàng)科技南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司);動(dòng)態(tài)足底測(cè)量?jī)x(意大利UGO Basile公司);凝膠成像儀(日本Fujifilm公司);蛋白酶抑制劑Cocktail(生工上海股份有限公司); RIPA裂解液(江蘇碧云天公司);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天公司);綿羊抗大鼠TRPV1多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司);兔抗大鼠磷酸化TRPV1多克隆抗體(臺(tái)灣Abnova公司);小鼠單克隆抗體b-actin抗體(上?？党缮锕こ逃邢薰?;超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(江蘇碧云天公司);PKA激動(dòng)劑db-cAMP(美國(guó)Sigma公司);PKC激動(dòng)劑PMA(美國(guó)Sigma公司)。

1.3 分組與造模

采用完全隨機(jī)法將大鼠隨機(jī)分為4組,分別為正常組、假手術(shù)組、模型組與低頻電針組,每組8只。按照前期右側(cè)L5脊神經(jīng)結(jié)扎(spinal nerve ligation, SNL)的方法建立神經(jīng)病理痛模型[9]。大鼠稱(chēng)重后,用10% 水合氯醛3.5 mL/kg腹腔麻醉,大鼠呈俯臥位放置于手術(shù)臺(tái)上,腰部去毛,在脊柱右側(cè)旁開(kāi)0.5 cm處沿L3-S2垂直切開(kāi)皮膚,鈍性分離右側(cè)椎旁肌肉,小心咬除L5橫突,暴露、分離L5脊神經(jīng),用5/0絲線結(jié)扎,縫合切口,肌注青霉素預(yù)防感染。假手術(shù)組操作同模型組,但不結(jié)扎神經(jīng)。

1.4 電針治療

造模后1 d開(kāi)始電針治療,選取術(shù)側(cè)足三里、昆侖穴(取穴參照華興邦大鼠穴位圖譜),連接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀,刺激參數(shù)為2 Hz,1 mA、2 mA先后各15 min,連續(xù)治療3 d。正常組、模型組、假手術(shù)組大鼠不做治療,給予低頻電針組相同固定。

1.5 痛覺(jué)超敏反應(yīng)檢測(cè)

采用動(dòng)態(tài)足底測(cè)量?jī)x檢測(cè)大鼠術(shù)側(cè)后足縮腿閾(Paw withdrawal threshold,PWT),評(píng)價(jià)大鼠機(jī)械痛覺(jué)超敏反應(yīng)。測(cè)量前,將大鼠適應(yīng)環(huán)境30 min。待大鼠安靜后,將連于機(jī)械泵上的類(lèi)Von Frey絲的金屬絲(0.5 mm)置于大鼠右后足中央,避開(kāi)足墊;啟動(dòng)機(jī)械泵,金屬絲即以恒定速度自動(dòng)上臺(tái),對(duì)大鼠足底施加機(jī)械刺激。刺激力量從0 g開(kāi)始以2.5 g/s遞增,直至大鼠產(chǎn)生縮腿反應(yīng);最大刺激力量為50 g,以免大鼠足爪受損;連續(xù)測(cè)量3次,取其平均值,每次間隔5 min。分別于造模前及造模后第1、2、3天測(cè)量PWT。

1.6 Western blotting檢測(cè)DRG TRPV1表達(dá)與p-TRPV1水平

造模后第3天將大鼠用10%水合氯醛腹腔注射(3.5 mL/kg)麻醉,剪開(kāi)胸腔,暴露心臟。將灌注針頭從心尖直接刺入主動(dòng)脈,剪開(kāi)右心耳,進(jìn)行生理鹽水灌注,迅速取出術(shù)側(cè)L4-6DRG,﹣80℃冰箱保存。采用RIPA裂解液結(jié)合超聲粉碎法抽提蛋白?？偟鞍咨蠘恿繛?0mg,電泳濃縮膠電壓為80 v,30 min,分離膠電壓為120 v,90 min;轉(zhuǎn)膜用0.45mm PVDF膜,90 min;在5%脫脂奶粉中封閉2 h;一抗孵育分別用綿羊抗大鼠TRPV1多克隆抗體(1:2000)、兔抗大鼠p-TRPV1單克隆抗體(1:1000)、小鼠抗大鼠b-actin單克隆抗體(1:10,000),在4℃孵育過(guò)夜。TBST緩沖液洗滌后,辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合二抗孵育2 h;用ECL試劑盒進(jìn)行顯色反應(yīng),用凝膠成像儀攝像,用Image Quant TL軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。

1.7 激動(dòng)劑驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將大鼠隨機(jī)分為生理鹽水注射對(duì)照組(EA＋Saline)、PKC激動(dòng)劑PMA注射組(EA＋PMA)與PKA激動(dòng)劑db-cAMP注射組(EA＋db－cAMP),每組8只。造模、電針治療同上。在造模后第3天于電針治療前10 min分別足背注射生理鹽水、100mg db-cAMP、1mg PMA。db-cAMP、PMA參照說(shuō)明書(shū)先分別用純水、二甲基亞砜微量溶解,再用saline補(bǔ)足到50mL進(jìn)行注射。分別于造模前及造模后第1、3天測(cè)量PWT。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

分析采用SPSS16.0,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表達(dá),多組間比較采用單因素方差分析(-),組間兩兩比較采用檢驗(yàn)。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 Hz電針對(duì)SNL模型大鼠早期術(shù)側(cè)PWT的影響

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)術(shù)側(cè)PWT比較 (±s,g)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

與正常組比較,SNL模型組大鼠早期出現(xiàn)舔足、抬足等自發(fā)性疼痛現(xiàn)象,術(shù)側(cè)PWT顯著降低(＜0.001), SNL假手術(shù)組沒(méi)有顯著變化;電針組大鼠造模后PWT與正常組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01);電針組大鼠治療后PWT與模型組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.001)。詳見(jiàn)表1。

2.2 2 Hz電針對(duì)SNL模型大鼠早期術(shù)側(cè)L5 DRG TRPV1表達(dá)的影響

與正常組比較,SNL模型組大鼠第3天術(shù)側(cè)L5DRG TRPV1表達(dá)顯著降低(＜0.01);2 Hz電針對(duì)SNL大鼠術(shù)側(cè)L5 DRG TRPV1表達(dá)沒(méi)有顯著影響(＞0.05)。詳見(jiàn)圖1。

注:與正常組比較1)P＜0.01

2.3 2 Hz電針對(duì)SNL模型大鼠早期術(shù)側(cè)L5 DRG TRPV1磷酸化水平的影響

與正常組比較,SNL模型組大鼠第3天術(shù)側(cè)L5DRG p-TRPV1水平顯著升高(＜0.001);2 Hz電針能顯著降低SNL大鼠術(shù)側(cè)L5 DRG升高的p-TRPV1水平(＜0.05)。詳見(jiàn)圖2。

注:與正常組比較***P＜0.01;與SNL組比較#P＜0.05

2.4 PKC、PKA激動(dòng)劑對(duì)2 Hz電針抗神經(jīng)痛作用的影響

PKC激動(dòng)劑PMA、PKA激動(dòng)劑db-cAMP能顯著拮抗2 Hz電針抗SNL神經(jīng)痛的作用(＜0.001,＜0.001)。詳見(jiàn)表2。

表2 PMA、db-cAMP對(duì)2 Hz電針抗神經(jīng)痛作用的影響 (±s,g)

注:與生理鹽水注射對(duì)照組比較1)＜0.01

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在神經(jīng)痛早期損傷DRG TRPV1通過(guò)磷酸化形式活化,而非通過(guò)表達(dá)增強(qiáng)。2 Hz低頻電針能有效干預(yù)TRPV1磷酸化水平發(fā)揮對(duì)早期神經(jīng)痛的治療作用。

TRPV1在外周主要分布在較細(xì)的DRG神經(jīng)元、C纖維和Ad纖維[8],參與疼痛信號(hào)的產(chǎn)生、傳遞與調(diào)節(jié)。研究表明DRG TRPV1激活能誘導(dǎo)大鼠三叉神經(jīng)痛[10],而對(duì)其的脫敏療法能有效減輕多種神經(jīng)痛[8],說(shuō)明DRG TRPV1活化對(duì)神經(jīng)痛的發(fā)生起著重要作用。有報(bào)道, TRPV1功能上調(diào)參與炎癥痛痛敏化的發(fā)生,而其表達(dá)上調(diào)參與炎癥痛痛敏化的維持[11]。對(duì)于早期神經(jīng)痛DRG TRPV1通過(guò)何種途徑活化(功能上調(diào)還是表達(dá)上調(diào))參與痛敏化過(guò)程尚未清楚。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SNL模型大鼠早期就出現(xiàn)舔足、抬足等自發(fā)性痛覺(jué)疼痛現(xiàn)象與機(jī)械性痛覺(jué)超敏反應(yīng),其損傷DRG的TRPV1磷酸化水平上升,而表達(dá)下降。神經(jīng)損傷或病變時(shí),蛋白激酶PKC、cAMP依賴(lài)的PKA被激活,磷酸化TRPV1,使TRPV1功能上調(diào),引起痛覺(jué)敏化[5-6]。損傷DRG TRPV1磷酸化水平升高引起的TRPV1功能上調(diào)可能在SNL神經(jīng)痛早期中起著重要作用。

低頻電針對(duì)神經(jīng)痛有顯著的鎮(zhèn)痛效應(yīng)[12-13],且不被納洛酮阻斷[14],表明電針對(duì)神經(jīng)痛的干預(yù)存在非阿片機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)2 Hz低頻電針能有效減輕SNL模型大鼠早期的機(jī)械性痛覺(jué)超敏。筆者之前的研究表明2 Hz低頻電針也能減輕SNL模型大鼠維持期(SNL造模后第15天)的機(jī)械性痛覺(jué)超敏[9]。其他研究也表明低頻電針對(duì)糖尿病外周神經(jīng)痛、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子注射誘導(dǎo)的神經(jīng)痛以及癌性痛均有鎮(zhèn)痛作用[15-17]。這些表明低頻電針對(duì)神經(jīng)痛有明確的治療作用。2 Hz低頻電針能降低SNL模型大鼠早期神經(jīng)痛損傷DRG的TRPV1磷酸化水平,考慮到神經(jīng)損傷或病變時(shí),蛋白激酶PKC、PKA被激活,能通過(guò)磷酸化TRPV1增強(qiáng)初級(jí)痛覺(jué)神經(jīng)元的興奮性,進(jìn)而導(dǎo)致痛覺(jué)敏化[5-6],筆者進(jìn)一步采用PKC激動(dòng)劑PMA與PKA激動(dòng)劑db-cAMP足部局部注射觀察對(duì)2 Hz低頻電針鎮(zhèn)痛作用的影響。筆者發(fā)現(xiàn)PMA、db-cAMP能拮抗2 Hz低頻電針抗SNL早期神經(jīng)痛的作用。這些說(shuō)明,在神經(jīng)痛早期,2 Hz低頻電針改善痛覺(jué)敏化可能與下調(diào)DRG TRPV1磷酸化水平有關(guān)。筆者之前的研究表明,在神經(jīng)痛的維持期,2 Hz低頻電針對(duì)TRPV1也有一定的調(diào)節(jié)作用,能下調(diào)鄰近未損傷DRG的TRPV1表達(dá)水平。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,SNL神經(jīng)痛早期痛覺(jué)敏化與DRG TRPV1磷酸化水平升高有關(guān)。低頻電針能改善早期神經(jīng)痛,可能與下調(diào)損傷DRG的TRPV1磷酸化水平有關(guān)。電針療法在神經(jīng)痛的治療上具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Dorsal Root Ganglion Capsaicin Receptor-involved Mechanism of Low-frequency Electroacupuncture in Alleviating Early Neuropathic Pain in a Rat Model of SNL

-,-,-,-,-.

,310053,

To investigate the dorsal root ganglion (DRG) capsaicin receptor (transient receptor potential vanilloid type 1, TRPV1)-involved mechanism of low-frequency electroacupuncture in alleviating early neuropathic pain.Thirty-two rats were randomly allocated to normal, sham operation, model and electroacupuncture groups, 8 rats each. A rat model of neuropathic pain was made by spinal nerve ligation. Points Zusanli and Kunlun on the affected side were selected for three consecutive days of treatment with 2 Hz electroacupuncture. Operated side hind paw withdrawal threshold (PWT), and L5DRG TRPV1 expression and phosphorylation levels were measured in the rats. The antagonistic effects of PKC agonist PMA and PKA agonist db-cAMP on 2 Hz electroacupuncture analgesia were further validated.Spontaneous pain occurred in the early stage, and PWT lowered markedly (＜0.001), L5DRG TRPV1 expression levels fell (＜0.01) and L5DRG TRPV1 phosphorylation levels rose (＜0.001) in a rat model of SNL. PWT did not change in the sham SNL group of rats. 2 Hz electroacupuncture raised PWT (＜0.001) and lowered L5DRG TRPV1 phosphorylation levels (＜0.05) in a rat model of SNL. Local injection of the foot with PMA and db-cAMP inhibited the alleviating effect of 2 Hz electroacupuncture on neuropathic pain (＜0.001,＜0.001).Early neuropathic pain is related to a rise in TRPV1 phosphorylation levels in the injured DRG. Low-frequency electroacupuncture can relieve early neuropathic pain, which may be related to the down-regulation of TRPV1 phosphorylation levels in the injured DRG.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Neuropathic pain; Spinal nerve ligation; TRPV1; DRG; Rats

1005-0957(2014)05-0476-04

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.05.0476

2014-01-07

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81072855,81303039);浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LY12H27015,Z2100979);國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)學(xué)科(針灸學(xué))

蔣永亮(1981 - ),男,助理研究員

方劍喬(1961 - ),男,教授,Email:fangjianqiao7532@163. com