徐素慧，高 洋，趙玄多，邵良平，陳玉村，陳德坤＊

（1.海峽（福州）大熊貓研究交流中心，福建福州350001；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100；3.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建福州350002）

γ干擾素（IFN-γ）由NK 細(xì)胞、活化的Th1和細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（cytotoxic T cells，CTL）等細(xì)胞產(chǎn)生。IFN-γ的免疫學(xué)活性主要表現(xiàn)在如下幾個(gè)方面：①促進(jìn)NK細(xì)胞活性；增強(qiáng)巨噬細(xì)胞遞呈抗原及其殺菌功能；②誘導(dǎo)活化的B細(xì)胞產(chǎn)生IgG2a和IgG3；③通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子T-bet表達(dá)促進(jìn)Th1的分化；④通過抑制Th2分化，促進(jìn)CTL活化，激活巨噬細(xì)胞等途徑極化機(jī)體的細(xì)胞免疫功能；⑤提高M(jìn)HCⅡ類分子在抗原遞呈細(xì)胞表面的表達(dá)量；⑥直接抑制病毒復(fù)制效應(yīng)［1-5］。因此，IFN-γ是天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答過程中很重要的細(xì)胞因子之一，在機(jī)體抗細(xì)胞內(nèi)寄生菌、抗病毒以及抗腫瘤中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。基于此，人工制備重組IFN-γ并將其應(yīng)用于動(dòng)物傳染病和腫瘤治療，已經(jīng)在獸醫(yī)臨床取得了較好的效果。

人工舍飼養(yǎng)殖小熊貓過程中，因細(xì)菌、病毒和寄生蟲等感染引起的小熊貓死亡問題一直令人感到棘手，至今未有較為合理有效的應(yīng)對(duì)措施［6-10］。本研究以純化的小熊貓重組IFN-γ為材料，對(duì)其免疫活性進(jìn)行鑒定，為小熊貓傳染病及腫瘤的預(yù)防和治療提供新的手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 成年健康小熊貓6只（2只雌性，4只雄性），飼養(yǎng)于海峽（福州）大熊貓研究交流中心。

1.1.2 主要試劑 淋巴細(xì)胞分離液為上海華精生物高科技有限公司產(chǎn)品；Con A、Hepes、L-Gln、MTT 和丙酮酸鈉為Sigma公司產(chǎn)品；RPMI-1640 培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品；犢牛血清為Gibco公司產(chǎn)品；β-巰基乙醇，DMSO 為Amresco公司產(chǎn)品；青、鏈霉素，肝素鋰抗凝管，小熊貓IFN-γ原核表達(dá)蛋白（純化后凍干），NaHCO3，NaCl，KCl，Na2HPO4· 12H2O，KH2PO4均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純；辣根過氧化物酶標(biāo)二抗（羊抗兔IgG-HRP），碳酸鹽緩沖液，洗滌緩沖液（PBST），封閉液（含50g／L脫脂奶粉的PBST），終止液（2mol／L的H2SO4），96孔酶標(biāo)板。

1.1.3 主要儀器 水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)，角轉(zhuǎn)子離心機(jī)（eppendorf），超凈工作臺(tái)，酶標(biāo)儀（BIO-RAD），CO2培養(yǎng)箱（Thermo），恒溫培養(yǎng)箱，普通光學(xué)顯微鏡，普通冰箱，-70℃超低溫冰箱。

1.2 方 法

1.2.1 小熊貓外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液的制備 前肢靜脈無菌采小熊貓外周血3mL，肝素抗凝。將抗凝血沿離心管壁緩慢疊加到3mL 淋巴細(xì)胞分離液上，注意盡量不要讓血液與淋巴細(xì)胞分離液的分界面晃動(dòng)。2 000r／min離心20 min。吸取云霧層細(xì)胞到另一干凈離心管中，加入兩倍體積的PBS（含20mL／L犢牛血清），溫和顛倒混勻，1 000r／min×10min洗滌細(xì)胞，棄上清。重復(fù)洗滌細(xì)胞2次。最后一次洗滌結(jié)束后，棄掉上清，利用臺(tái)盼藍(lán)染色法染色，3min內(nèi)計(jì)數(shù)，活細(xì)胞數(shù)目要求在95%以上。用完全1640 培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為1×107個(gè)／mL。

1.2.2 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 吸取100μL 細(xì)胞懸液加入到96孔培養(yǎng)板中，試驗(yàn)組加入100μL 不同濃度（100×1.56、10-1×1.56、10-2×1.56、10-3×1.56、10-4×1.56、10-5×1.56 mg／mL）的小熊貓IFN-γ原核表達(dá)蛋白或經(jīng)熱變性處理（煮沸10min）的小熊貓IFN-γ 原核表達(dá)蛋白（10-1×1.56 mg／mL）。對(duì)照組加入100μL 的完全1640培養(yǎng)液。37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。細(xì)胞培養(yǎng)至68h時(shí)，每孔無菌吸取50μL 上清棄掉，加入15μL MTT。37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h。細(xì)胞培養(yǎng)72h時(shí)，每孔吸取100 μL上清棄掉，加入100μL DMSO 徹底裂解細(xì)胞，用酶標(biāo)儀在490nm 波長(zhǎng)處測(cè)OD值，計(jì)算SI值，確定出最佳刺激效果的稀釋梯度。

1.2.3 PBMC培養(yǎng)上清的制備 分離小熊貓外周血單個(gè)核細(xì)胞（periphal blood mononuclear cells，PBMC），步驟同1.2.1，用完全1640培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為1×107／mL。吸取500μL 細(xì)胞懸液加入到24孔培養(yǎng)板中，再加入500μL 濃度為10-1×1.56mg／mL的小熊貓IFN-γ原核表達(dá)蛋白溶液，另設(shè)PBMC陰性對(duì)照。37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)。分別在刺激后12、24、36、48、60、72h收取細(xì)胞上清，置-80 ℃保存，供IFN-γ測(cè)定使用。

1.2.4 IFN-γ的間接ELISA 測(cè)定

1.2.4.1 抗原包被 不同時(shí)間收集的PBMCs培養(yǎng)上清凍干粉，用等量的碳酸鹽緩沖液（pH9.6）溶解，然后以100μL／孔包被，另設(shè)相應(yīng)的對(duì)照孔。4℃過夜，棄去包被液，用PBST 洗5次。

圖1 小熊貓IFN-γ原核表達(dá)產(chǎn)物刺激淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定結(jié)果Fig.1 Results of lymphocyte proliferation promoted by prokaryotic expression IFN-γin red panda

1.2.4.2 封閉 每孔加入100μL 含50g／L 脫脂奶粉的PBST，37 ℃，孵育1h。棄去封閉液，PBST洗滌5次。

1.2.4.3 加一抗 用PBST 將兔抗IFN-γ血清稀釋1 000倍，每孔加入100μL，37 ℃，孵育1h。棄去孔中液體，PBST 洗滌5次。

1.2.4.4 加二抗 羊抗兔IgG-HRP 用PBST 稀釋成1∶5 000，每孔加入100μL，37 ℃孵育50 min。棄去孔中液體，PBST 洗滌5次。

1.2.4.5 每孔加入100μL 的底物顯色液，37 ℃孵育15min。

1.2.4.6 終止 加入2 mol／L 的H2SO4終止反應(yīng)，測(cè)OD 450nm 值。

2 結(jié) 果

2.1 重組IFN-γ對(duì)小熊貓PBMC增殖的影響

本研究結(jié)果顯示，濃度組為10-1×1.56 mg／mL、10-2×1.56mg／mL 的小熊貓IFN-γ原核表達(dá)產(chǎn)物與小熊貓外周血T 淋巴細(xì)胞共孵育后，具有顯著刺激T 淋巴細(xì)胞增殖的效應(yīng)（P＜0.05）。為進(jìn)一步明確這種細(xì)胞增殖效應(yīng)是IFN-γ本身的免疫活性引起的，而非IFN-γ作為一種抗原性質(zhì)的作用。我們對(duì)IFN-γ 原核表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了蛋白熱變性處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)濃度為10-1×1.56 mg／mL 的IFN-γ經(jīng)熱變性處理后，與空白對(duì)照組相比，其淋巴細(xì)胞增殖效果無顯著差異（P＞0.05），但與未經(jīng)熱變性處理組相比，淋巴細(xì)胞增殖效果顯著降低（P＜0.05）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，我們制備的小熊貓IFN-γ原核產(chǎn)物具有刺激T 淋巴細(xì)胞增殖的免疫活性，經(jīng)熱變性處理的小熊貓IFN-γ刺激T 淋巴細(xì)胞增殖的活性幾乎完全喪失（圖1和圖2）。

圖2 熱變性處理對(duì)小熊貓IFN-γ刺激淋巴細(xì)胞增殖活性的影響Fig.2 Results of lymphocyte proliferation stimulated with heat denatured IFN-γin red panda

2.2 重組IFN-γ對(duì)小熊貓PBMC分泌IFN-γ的影響

圖3 小熊貓?jiān)吮磉_(dá)產(chǎn)物IFN-γ刺激淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的測(cè)定結(jié)果Fig.3 The results of IFN-γlevel in superntants of PBMC culture stimulated with prokaryotic expression IFN-γin red panda

本試驗(yàn)測(cè)定了PBMC在重組IFN-γ作用下，不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)上清中IFN-γ的水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組IFN-γ含量在60h之前均顯著升高（P＜0.01，或P＜0.05）。與對(duì)照組相比，IFN-γ含量在培養(yǎng)72h時(shí)的水平并沒有顯著變化（P＞0.05）。結(jié)果表明，IFN-γ原核表達(dá)產(chǎn)物具有刺激小熊貓外周血淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ 活性。PBMC 培養(yǎng)系統(tǒng)加入的重組IFN-γ在短期內(nèi)（24h）迅速激活Th1和CTL細(xì)胞并分泌IFN-γ，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，效應(yīng)T 細(xì)胞活力下降，其分泌能力隨之下降并停止。加之IFN-γ則在酸性環(huán)境不穩(wěn)定，故而累積在上清中的IFN-γ則隨時(shí)間延長(zhǎng)而不斷衰減，導(dǎo)致培養(yǎng)后期培養(yǎng)上清中IFN-γ水平下降（圖3）。

3 討 論

外周血單個(gè)核細(xì)胞包括T 細(xì)胞、B細(xì)胞、NK 細(xì)胞以及單核細(xì)胞，經(jīng)過淋巴細(xì)胞分離液分離后獲得的PBMC主要包括T、B 淋巴細(xì)胞和極少量的NK細(xì)胞。T 細(xì)胞由Th1、Th2、CTL、Th17 等組成，其中Th1、CTL 等T 細(xì)胞的活化分化均需要IFN-γ。換言之，IFN-γ在細(xì)胞培養(yǎng)水平具有刺激T 細(xì)胞增殖的效應(yīng)，并且這種作用在一定范圍內(nèi)呈量效正相關(guān)的關(guān)系。活化以及效應(yīng)Th1和CTL 又具有分泌IFN-γ活性，在其培養(yǎng)上清中又可以檢測(cè)到IFN-γ，并且上清中IFN-γ 水平的高低與活化以及效應(yīng)Th1和CTL數(shù)量緊密相關(guān)［11-13］?；谏鲜雒庖邔W(xué)原理，本研究采用PBMC 增殖試驗(yàn)和間接ELISA，分別測(cè)定了重組IFN-γ刺激小熊貓PBMC 增殖及其培養(yǎng)上清中IFN-γ含量，以此判定小熊貓?jiān)酥亟MIFN-γ的免疫活性。本研究在IFN-γ 活性時(shí)之所以不選擇動(dòng)物個(gè)體水平試驗(yàn)，基于兩個(gè)原因：①小熊貓屬于國(guó)家珍稀保護(hù)動(dòng)物，數(shù)量有限；②正常小熊貓個(gè)體使用重組IFN-γ效果未必明顯，病毒感染或荷瘤小熊貓樣本短時(shí)間內(nèi)難以獲得。此外，也有研究采用IFN-γ直接抗病毒增殖的特點(diǎn)，通過測(cè)定其在細(xì)胞培養(yǎng)水平抑制病毒增殖效果來評(píng)估的活性。作為免疫活性細(xì)胞因子，其更重要更明顯的活性是體現(xiàn)在其免疫學(xué)方面，這也是本研究不測(cè)定重組IFN-γ抗病毒增殖活性的原因。

本研究結(jié)果表明，純化的小熊貓重組IFN-γ具有較好的免疫活性，能夠刺激小熊貓T 淋巴細(xì)胞增殖及促進(jìn)其分泌IFN-γ。從培養(yǎng)上清中IFN-γ含量分析，在12h時(shí)含量就已經(jīng)明顯升高，提示在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生細(xì)胞已經(jīng)充分活化。換言之，我們?cè)谂囵B(yǎng)系統(tǒng)中加入的重組在12h之前就已經(jīng)發(fā)揮了其刺激T 細(xì)胞增殖的作用，這和我們前期預(yù)試驗(yàn)在12 h就可以觀察到PBMC 有細(xì)胞大量增殖形成的克隆團(tuán)現(xiàn)象剛好吻合。由于一般的蛋白質(zhì)抗原在PBMC細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中刺激淋巴細(xì)胞增殖形成克隆團(tuán)現(xiàn)象通常需要24h，因此，本研究結(jié)果充分表明，我們制備的小熊貓重組IFN-γ具有很好的免疫活性。為進(jìn)一步證實(shí)這一結(jié)論，我們對(duì)小熊貓重組IFN-γ按照蛋白質(zhì)熱熱變性條件進(jìn)行處理，再將熱變性的重組IFN-γ加入到PBMC培養(yǎng)系統(tǒng)中，結(jié)果顯示其刺激細(xì)胞增殖的活性消失。表明重組IFN-γ 活性的發(fā)揮需要特定空間構(gòu)象的維持，這與天然IFN-γ活性需要特定構(gòu)象的特性相一致。本研究結(jié)果證明，一旦該重組細(xì)胞因子的空間構(gòu)象被破壞，其免疫活性也就隨之喪失。這一結(jié)論為下一步制備供小熊貓臨床應(yīng)用的重組IFN-γ提供了極有參考價(jià)值的依據(jù)。

人類IFN-γ已獲得FDA 批準(zhǔn)可用于醫(yī)學(xué)臨床抗病毒抗腫瘤應(yīng)用，重組IFN-γ 已在雞抗球蟲感染、治療奶牛乳房炎、豬病毒病預(yù)防等臨床取得了較好的進(jìn)展。本研究取得的結(jié)果，為小熊貓臨床抗病毒抗腫瘤等疾病的預(yù)防和治療提供了更有效的途徑和手段。與現(xiàn)有的小熊貓臨床抗病毒和抗腫瘤藥物相比，在組成上和小熊貓?bào)w內(nèi)天然產(chǎn)生的分子完全一致，無任何異源性，因而使用后不會(huì)產(chǎn)生排斥免疫反應(yīng)，更為安全高效。我們下一步將開展小熊貓重組IFN-γ臨床應(yīng)用的研究。

［1］Carnaud C，Lee D，Donnars O，et al.Cutting edge：cross-talk between cells of the innate immune system：NKT cells rapidly activate NK cells［J］.J Immunol，1999；163：4647-4650.

［2］Finkelman F，Katona I M，Mosmann T R，et al.IFN-gamma regulates the isotypes of Ig secreted duringin vivohumoral immune responses［J］.J Immunol，1988，140：1022-1027.

［3］Perussia B，Dayton E T，F(xiàn)anning V，et al.Immune interferon and leukocyte-conditioned medium induce normal and leukemic myeloid cells to differentiate along the monocytic pathway［J］.J Exp Med，1983，158：2058-2080.

［4］Young H A，Hardy K.Role of interferon-gamma in immune cell regulation［J］.J Leukocyte Biol，1995；58：373-381.

［5］Boehm U，Klamp T，Groot M，et al.Cellular responses to interferon-γ［J］.Annu Rev Immunol，1997，15：749-795.

［6］熊 焰，徐志文，印 王，等.小熊貓犬瘟熱病及病原研究［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2001，22（3）：74-76.

［7］修云芳，徐素慧.小熊貓犬瘟熱疫苗接種引起大部分死亡的報(bào)告［J］.福建畜牧獸醫(yī)，2000，22（1）：40-41.

［8］李呈軍，侯紹華，康孟佼，等.小熊貓巴氏桿菌病的診治［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2001，23（1）：23.

［9］王 印，王德銘.小熊貓敗血性肺炎病原的分離鑒定［J］.四川畜牧獸醫(yī)，2001，28（5）：23-24.

［10］楊光友，王成東.小熊貓寄生蟲與寄生蟲病研究進(jìn)展［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2000，26（3）：36-38.

［11］Gattoni A，Parlato A，Vangieri B，et al.Interferon-gamma：biologic functions and HCV therapy（type I／II）（1of 2parts）［J］.La Clinica Terapeutica，2005，157：377-386.

［12］Belardelli F.Role of interferons and other cytokines in the regulation of the immune response［J］.Apmis，1995，103：161-179.

［13］Dorries R.The role of T-cell-mediated mechanisms in virus infections of the nervous system［M］.The Mechanisms of Neuronal Damage in Virus Infections of the Nervous System：Springer，2001：219-245.