張樂宜，蔡汝健，宋長(zhǎng)緒

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所 廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640）

化膿隱秘桿菌（Acranobacterium pyogenes）又稱化膿放線菌（Actinomyces pyogenes）、化膿棒狀桿菌（Corynebacterium pyogenes），屬于隱秘桿菌屬（Arcanobacterium）細(xì)菌。該菌最早于1893年從牛的膿汁中分離到，常引起人、牛、羊、豬、林麝發(fā)生化膿性感染或敗血癥等。該菌的致病性主要與它所產(chǎn)生的幾種毒力因子有關(guān)，目前已發(fā)現(xiàn)的化膿隱秘桿菌毒力因子有4 類，分別為化膿隱秘桿菌溶血素（PLO）、膠原結(jié)合蛋白（CbpA）、神經(jīng)氨酸酶（Nan）及菌毛合成蛋白（Fim）［1］。近期研究表明，菌株攜帶有不同毒力因子對(duì)小鼠的致病性不同，其中同時(shí)攜帶PLO 基因和NanP 基因的菌株的致病性要明顯強(qiáng)于同時(shí)攜帶其他幾種毒力因子的菌株［2］。本研究對(duì)2013年7月從廣東惠州某豬場(chǎng)發(fā)病豬的內(nèi)臟器官分離到的1株病原菌進(jìn)行了細(xì)菌常規(guī)鑒定、16S rRNA 測(cè)序分析及毒力因子進(jìn)行PCR檢測(cè)。通過對(duì)該病原菌的生物學(xué)特性、遺傳進(jìn)化關(guān)系，毒力因子的攜帶情況，耐藥基因的分布情況，為豬化膿隱秘桿菌的流行病學(xué)調(diào)查及相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2013年7月廣東惠州某豬場(chǎng)保育仔豬出現(xiàn)大規(guī)模發(fā)病，病豬體溫達(dá)到41℃，食欲差，消瘦，個(gè)別豬只出現(xiàn)不食、咳嗽、喘氣等癥狀。無菌條件下采集心包液、心臟、肺臟、肝臟等病料進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 綿羊鮮血瓊脂平板、巧克力平板、營(yíng)養(yǎng)肉湯、腦-心浸液培養(yǎng)基（BHI）購(gòu)自廣東環(huán)凱生物科技有限公司；進(jìn)口胎牛血清購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物科技有限公司；常見藥物的藥敏紙片購(gòu)自北京天壇生物制品股份有限公司；細(xì)菌生化微量鑒定管購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、2×EXTaq酶等購(gòu)自上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司；DNA Marker DL 2 000、10×Loading buffer、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3周齡SPF 級(jí)Babl／c小鼠10只，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank中已發(fā)表的細(xì)菌16SrRNA 基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用于細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定。依據(jù)參考文獻(xiàn)［3］合成7對(duì)化膿隱秘桿菌毒力基因plo、nanH、nanP、cbpA、fimA、fimC、fimG 的引物。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR 擴(kuò)增相關(guān)基因的引物序列Table 1 Primer sequences for amplification of relation related genes

1.2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及純化 在無菌條件下，用滅菌好的手術(shù)用剪刀剪開心臟、肺臟、肝臟，使其暴露新鮮創(chuàng)面，用高壓滅菌的棉簽或接種環(huán)在創(chuàng)面上進(jìn)行輕輕涂抹，并接種于巧克力平板和綿羊鮮血平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48h，挑取優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行革蘭染色、鏡檢。并挑取溶血的可疑小菌落于血平板上進(jìn)行純化。

1.2.3 生化試驗(yàn) 將10μL 培養(yǎng)好的含有50 mL／L胎牛血清菌液分別接種到不同的微量生化管，37℃培養(yǎng)48h，觀察記錄結(jié)果。同時(shí)參照微生物鑒定系統(tǒng)說明書進(jìn)行鑒定。

1.2.4 藥物敏感性試驗(yàn) 取100μL培養(yǎng)的新鮮菌液用涂布棒輕輕在綿羊鮮血平板培養(yǎng)基上涂布均勻，然后采用瓊脂擴(kuò)散法（KB 法）進(jìn)行常用抗菌類藥物的敏感性試驗(yàn)，37℃恒溫培養(yǎng)48h后取出，以抑菌圈直徑作為判定指標(biāo)，判斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)美國(guó)臨床標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NC-CLS）手冊(cè)2005版。

1.2.5 分離菌株16SrRNA 及毒力基因的PCR擴(kuò)增與序列測(cè)定 在血平板上挑取單個(gè)菌落，接種于含有50 mL／L 胎牛血清的BHI培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)48h。12 000r／min離心5min，棄上清，收集菌體。然后按照DNA 抽提試劑盒說明書進(jìn)行提取。以提取的基因組DNA 為模版，進(jìn)行16 S rRNA 及毒力基因的PCR 擴(kuò)增與測(cè)序。

反應(yīng)體系均為50μL：2×EXTaq酶25μL，ddH2O 17μL，上、下游引物各2μL，DNA 模版4μL。16SrRNA 反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃30 s，60℃1 min，72℃2 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。毒力基因的反應(yīng)條件為：94℃3 min；94℃1min，57℃／60℃1min，72℃2 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。取10μL PCR 產(chǎn)物用12g／L 的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行跑膠檢測(cè)，并設(shè)DNA Marker做參照。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物根據(jù)基因組DNA 凝膠回收試劑盒的操作說明進(jìn)行，回收產(chǎn)物用12g／L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)?；厥盏哪康腄NA 片段與PCR 2.1TA 克隆載體連接4℃過夜，次日轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化子經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)，并將篩選到的陽(yáng)性克隆送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast分析比對(duì)，用BioEdit及MEGA 4.0軟件對(duì)相近序列進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

病料接種于巧克力平板培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)48h后長(zhǎng)出數(shù)量較多的相似菌落，將單個(gè)菌落在血平板上劃線培養(yǎng)后，菌落呈光滑、濕潤(rùn)、半透明的乳白色小菌落，周圍呈現(xiàn)明顯的界限分明，完全透明的無色β溶血環(huán)。涂片染色鏡檢，可見革蘭陽(yáng)性多形態(tài)的桿菌（表2）。

2.2 生化特性

觀察并記錄不同標(biāo)簽的微量生化培養(yǎng)管內(nèi)顏色的變化，依照試劑盒內(nèi)說明書的判定標(biāo)準(zhǔn)，其特性與化膿隱秘桿菌相似，結(jié)果初步判定為化膿隱秘桿菌（表3）。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離株對(duì)頭孢唑啉、頭孢拉定、頭孢噻肟、新生霉素、阿莫西林、氨芐西林、萬古霉素敏感性最高，對(duì)強(qiáng)力霉素、恩諾沙星、阿米卡星、氧氟沙星等呈中度敏感，對(duì)鏈霉素、磺胺異噁唑、四環(huán)素、慶大霉素、林可霉素、新諾明、諾氟沙星均耐藥。

表2 不同來源的分離菌株Table 2 The isolate strains from different sources

表3 分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of isolate strain by biochemical reaction

2.4 16SrRNA 的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

分離株的16SrRNA 基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12g／L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，在1 358bp處擴(kuò)增出一條特異性的條帶，與預(yù)期大小相符。測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast分析顯示，分離株與國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的分離自牛、野豬、羊等動(dòng)物的化膿隱秘桿菌16SrRNA 基因同源性均在90%以上（圖1）。從建立的進(jìn)化樹中可以看出，本試驗(yàn)的分離株GDHZ 為一個(gè)獨(dú)立分支，但與JQ975947、JQ975944、HM246725 三個(gè)獨(dú)立分支關(guān)系較近，而與其他分離株的關(guān)系相對(duì)稍遠(yuǎn)。從核苷酸序列同源分析顯示，GDHZ株分別與JQ975947（中國(guó)新疆）、JQ975944（中國(guó)新疆）、HM246725（中國(guó)四川）分離自牛和林麝的菌株同源性最高為94.0%～95.0%，其次與NR-027195（美國(guó)馬里蘭州）、HE575404（德國(guó)波恩）分離自人和野豬的菌株同源性為91.6%～92.6%。這些結(jié)果顯示，本次分離株與中國(guó)西南地區(qū)的分離株關(guān)系最近，而與其他地域的分離株的關(guān)系相對(duì)稍遠(yuǎn)，說明本次分離的菌株與國(guó)外其他分離株之間存在時(shí)間和地域上的差異。

圖1 16SrRNA 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The PCR results of 16SrRNA gene

2.5 毒力基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

4種毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示，plo、nanH、fimA 3種毒力基因擴(kuò)增出了預(yù)期的目的片段，測(cè)序結(jié)果在Blast中比對(duì)分析顯示，plo（溶血素）基因與日本分離自豬的菌株（登錄號(hào)AB027461.1）、中國(guó)黑龍江分離自牛的菌株（登錄號(hào)HQ637573.1）、美國(guó)分離自牛的菌株（U84782.2）核苷酸同源性為99%，共有2個(gè)堿基發(fā)生突變。nanH（神經(jīng)氨酸酶）基因與美國(guó)分離自牛的菌株核苷酸同源性為90%，共有62處堿基發(fā)生突變，1處堿基發(fā)生缺失（圖2和圖3）。

2.6 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果

Babl／c小鼠接種分離菌株后，在12h出現(xiàn)2只小鼠出現(xiàn)死亡，其他3只小鼠出現(xiàn)精神委頓、活動(dòng)減少等臨床癥狀。48h剩余3只小鼠全部死亡，試驗(yàn)對(duì)照組精神、食欲均正常，未見死亡。采集病死小鼠的內(nèi)臟器官用巧克力和綿羊鮮血平板培養(yǎng)基分離細(xì)菌后，并進(jìn)行plo基因PCR 的擴(kuò)增和測(cè)序，證實(shí)致病菌為豬化膿隱秘桿菌。

圖2 基于16SrRNA 基因核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic tree based on the nucleotide sequence of 16SrRNA gene

圖3 不同分離菌株16SrRNA 基因核苷酸序列同源性分析Fig.3 Analysis on nucleotide sequence homology of 16SrRNA gene from the different isolates

3 討論

豬化膿隱秘桿菌通常被認(rèn)為是一種條件致病菌，可以引起牛、羊、豬、野豬、犬等動(dòng)物發(fā)生肺炎、乳房炎、子宮內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、外耳炎、膀胱炎及肝臟、腎臟膿腫等疾病。該病菌對(duì)牛羊的致病性最強(qiáng)，牛場(chǎng)容易大規(guī)模暴發(fā)該病。近年來關(guān)于牛羊感染化膿隱秘桿菌的報(bào)道較多，但對(duì)豬感染的報(bào)道較少。我國(guó)從1999年-2011年報(bào)道了發(fā)生在河南、河北、湖南、四川等省份由化膿隱秘桿菌引起豬發(fā)生以肝、肺化膿性結(jié)節(jié)，脾出血性腫大、敗血癥等臨床癥狀的病例［4-5］。曾有報(bào)道化膿隱秘桿菌感染人的事件［6］。因此，在目前動(dòng)物疫病復(fù)雜多變的情況下，要提高對(duì)該病的防范意識(shí)，避免重大突發(fā)傳染病的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)化膿隱秘桿菌除了可以在病變的膿性結(jié)節(jié)、肺臟等分離到該菌，也可以在發(fā)生心包炎的心臟中分離到該菌。豬化膿隱秘桿菌的培養(yǎng)過程中，該菌在巧克力平板、綿羊鮮血平板培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)48h長(zhǎng)出肉眼可見灰白色菌落，且生長(zhǎng)良好。據(jù)報(bào)道該菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類抗生素的耐藥性最為嚴(yán)重［7］。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示該菌對(duì)大多數(shù)的常用藥物具有多重耐藥性，PCR檢測(cè)出耐藥基因ermC、tetB等。動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)肌肉注射培養(yǎng)菌液后12h小鼠即出現(xiàn)死亡，48h小鼠全部死亡。從病死小鼠體內(nèi)分離到的細(xì)菌，利用PCR 方法擴(kuò)增plo基因并測(cè)序，結(jié)果表明為化膿隱秘桿菌，說明該菌株具有較強(qiáng)的致病性。16SrRNA 在細(xì)菌種內(nèi)相當(dāng)保守，而種間某些區(qū)域在一級(jí)結(jié)構(gòu)水平上有顯著差異?，F(xiàn)已將16SrRNA 作為一種細(xì)菌分類和鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”廣泛地應(yīng)用于科學(xué)研究［8］。目前大約2 500個(gè)種的16SrRNA 全基因序列已經(jīng)被報(bào)道。根據(jù)它們的序列同源性，已成功構(gòu)建了各種屬的系統(tǒng)發(fā)育樹。由于細(xì)菌鑒定的傳統(tǒng)方法是生化試驗(yàn)，但又存在一定程度的誤差，不能快速準(zhǔn)確地得出結(jié)論且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。遺傳進(jìn)化樹分析表明該菌株與分離自不同地區(qū)和國(guó)家的菌株之間存在一定的遺傳進(jìn)化關(guān)系。其中與JQ975947（中國(guó)新疆）、JQ975944（中國(guó)新疆）、HM246725（中國(guó)新疆）三個(gè)獨(dú)立分支關(guān)系較近，而與其他國(guó)外分離株的關(guān)系相對(duì)稍遠(yuǎn)，說明他們之間存在時(shí)間和地域上的差異。測(cè)序結(jié)果表明16SrRNA 基因核苷酸序列與GenBank中已發(fā)表的分離自牛、羊、林麝、野豬等動(dòng)物的豬化膿隱秘桿菌同源性均為90%以上，證實(shí)此次分離的菌株為豬化膿隱秘桿菌。

圖4 毒力基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 The PCR results of virulence genes

圖5 plo基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 The PCR results of plo gene

圖6 plo基因序列測(cè)定結(jié)果Fig.6 Sequencing of the plo gene

化膿隱秘桿菌主要包括四種毒力因子，即溶血素（PLO）、膠原結(jié)合蛋白（CbpA）、神經(jīng)氨酸酶（NanH／P）及菌毛合成蛋白（Fim）。是一種外毒素，能夠溶解多種動(dòng)物的紅細(xì)胞、免疫細(xì)胞，并引起試驗(yàn)動(dòng)物的皮膚壞死以及動(dòng)物的死亡。PLO 還呈現(xiàn)出對(duì)牛多形核粒細(xì)胞和袋鼠腎細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)［9-10］。該毒力因子免疫小鼠具有很好的免疫原性［11］。神經(jīng) 氨酸酶（neuraminidase，Nan）有2 種，即NanH 和NanP，分 別 由nanH 和nanP 編 碼。Nan具有多種毒力作用，能夠分解宿主細(xì)胞的唾液酸作為碳源，促進(jìn)其在低養(yǎng)分條件下的生長(zhǎng)。降低膜表面黏液的黏滯性，便于細(xì)菌潛入深層組織，并可分解蛋白質(zhì)如IgA，與宿主防御反應(yīng)有關(guān)，同時(shí)能夠增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)宿主的黏附力、聚集力和感染力。本試驗(yàn)利用PCR 技術(shù)擴(kuò)增出了plo（溶血素）、nanH 兩種毒力基因。其中plo基因的核苷酸序列與已發(fā)表基因序列同源性為100%；nanH 基因的核苷酸的同源性為89%，其中測(cè)定的核苷酸序列中發(fā)生3個(gè)連續(xù)堿基的缺失，并有62處堿基發(fā)生了突變，說明該基因的變異導(dǎo)致菌株的致病性發(fā)生了變化，其致病力變強(qiáng)。另外，據(jù)報(bào)道菌毛合成蛋白（Fim）也是化膿隱秘桿菌的一種毒力因子，而且試驗(yàn)中參考Ewa Zastempowska等設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行相關(guān)基因的擴(kuò)增，其中擴(kuò)增出了fimA、fimG 基因預(yù)期的片段大小，測(cè)序結(jié)果后Blast分析未在GenBank中找到相似的已發(fā)表基因序列，該基因是否與致病有關(guān)還有待于進(jìn)一步研究。

目前對(duì)化膿隱秘桿菌毒力因子的研究還不很全面，對(duì)某些已發(fā)現(xiàn)的毒力因子的作用機(jī)理的闡述也還不夠明確。特別是本次分離鑒定的菌株與我國(guó)新疆、四川分離株親緣關(guān)系最近，但毒力基因核苷酸序列分析顯示與黑龍江、日本分離株同源性較高，這兩者之間存在什么樣的關(guān)系目前還不清楚，有待于進(jìn)一步去證實(shí)。我國(guó)對(duì)化膿隱秘桿菌的致病性、致病機(jī)理、流行病學(xué)研究還處于起步階段，毒力因子在感染人和動(dòng)物機(jī)體過程中起到的作用及其免疫原性也有待于進(jìn)一步深入研究。本研究可為豬化膿隱秘桿菌病的流行病學(xué)調(diào)查及致病機(jī)理和防治研究提供理論依據(jù)。

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