唐漢慶，王金花，趙善民，黃俊杰，莫小強(qiáng)，王露瑤，廉春容

（右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西百色533000）

冠心?。–oronary heart disease，CHD）嚴(yán)重危害 人類的健康，在我國(guó)CHD 患病率呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)CHD 進(jìn)行有效的防治是個(gè)重大課題。冠心病屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”、“心痛”或“真心痛”范疇，臨床證型以痰濁、血瘀為主［1］，其中冠心病血瘀證的發(fā)病機(jī)理以往研究重點(diǎn)集中于脂質(zhì)浸潤(rùn)、血栓形成及平滑肌增殖，但已有研究表明腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）中血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）分泌水平升高引起的氧化應(yīng)激及其介導(dǎo)的氧化損傷反應(yīng)在冠心病的發(fā)生發(fā)展、病理轉(zhuǎn)歸與預(yù)后中發(fā)揮關(guān)鍵作用［2］。本研究建立冠心病血瘀家兔模型，以血府逐瘀湯進(jìn)行干預(yù)，觀察血管活性物質(zhì)AngⅡ、活性氧（ROS）、內(nèi)皮素（ET）、一氧化氮（NO）變化，從氧化應(yīng)激致內(nèi)皮損傷角度討論血府逐瘀湯治療CHD 血瘀證的相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康家兔32只，雌雄各半，體重2.5 kg±0.5kg，普通級(jí)，本院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（桂）2013-0002。

1.1.2 主要試劑和儀器 30g／L 戊巴比妥鈉，批號(hào)20100021，為北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品；AngⅡ試劑盒，批號(hào)201323，為上海聚力研究所產(chǎn)品；NO 試劑盒（批號(hào)061110），ROS試劑盒（批號(hào)031205），均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；ET 試劑盒，批號(hào)230612，為北京普爾偉業(yè)公司產(chǎn)品；電子天平，AE160型，為瑞士Mettler公司產(chǎn)品；小動(dòng)物呼吸機(jī)BIPAPSYNCHRONY 型，為飛利浦公司產(chǎn)品；彩色多普勒超聲診斷儀，Vivid 7 型，為美國(guó)GE 公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，AD340型，為美國(guó)Beckman Coulter公司產(chǎn)品；分光光度計(jì)，722型，為上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；γ 放射免疫計(jì)數(shù)器，F(xiàn)J-2021型，為廣州飛迪公司產(chǎn)品；臺(tái)式高速低溫離心機(jī)，Z360K型，為德國(guó)HERMLE公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和處理 適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后，隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組、假手術(shù)組、中藥組4組，每組8只。模型組造模方法參照文獻(xiàn)［3］加以改良，動(dòng)物麻醉，輔助呼吸，左冠狀動(dòng)脈遠(yuǎn)端放置縮窄環(huán)，制備冠心病血瘀模型，假手術(shù)組開胸但不放置縮窄環(huán)。中藥組在模型組基礎(chǔ)上，術(shù)后第7天起，每天早上8時(shí)開始按20g生藥／kg血府逐瘀湯灌胃（intragastric administration，ig）。每天1次，連續(xù)10d。對(duì)照組、模型組、假手術(shù)組則灌胃等體積生理鹽水。家兔給藥劑量的計(jì)算依據(jù)，參照文獻(xiàn)［4］中藥復(fù)方藥動(dòng)學(xué)研究中給藥劑量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行折算，按湯劑折成動(dòng)物平均等效劑量20g／kg。

1.2.2 血府逐瘀湯制備 血府逐瘀湯由桃仁70g，紅花、當(dāng)歸、柴胡各60g，生地黃50g，枳殼40g，川芎、赤芍、桔梗、甘草各30g，牛膝20g組成，本院藥理教研室提供并鑒定，先將藥物清水漂洗2次，加雙蒸水2 500mL浸泡30min后，煎煮30min，收集煎煮液，藥渣再加水1 000mL煎煮20min，合并2次濾液，水浴加熱濃縮至含生藥2g／mL，滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 檢測(cè)方法 取靜脈血2mL，于4℃以1 000 r／min離心5min，分離血清，置-70℃凍存。采用硝酸還原酶法測(cè)定血清NO，采用比色法測(cè)定血清ROS；取靜脈血2mL，加入30μL 100g／L EDTANa2和40μL抑肽酶，在4℃以4 000r／min離心10min，分離血漿，置-70℃凍存。采用放免法測(cè)定血漿ET；取靜脈血2mL，加入冰浴的酶抑制劑30μL和0.3 mmol EDTANa2，于4℃以1 000r／min離心5min，分離血漿，置-70℃凍存，采用放免法在冰浴中測(cè)定AngⅡ。均嚴(yán)格按說明書操作進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 13.0軟件。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示。組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用q 檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

家兔（總例數(shù)32例）全部存活并被納入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與對(duì)照組比較，模型組血漿AngⅡ、ET 及血清ROS水平均升高，差異極顯著或顯著（P＜0.01或P＜0.05），而血清NO 水平顯著降低，差異極顯著（P＜0.01）。與模型組比較，中藥組血漿AngⅡ、ET 及血清ROS水平均降低，差異極顯著或顯著（P＜0.01或P＜0.05），而血清NO 水平顯著升高，差異極顯著（P＜0.01）。與對(duì)照組比較，假手術(shù)組AngⅡ、ET 水平稍升高，但差異不顯著（P＞0.05），ROS、NO 水平稍降低，但差異不顯著（P＞0.05）；與對(duì)照組比較，中藥組AngⅡ、ROS、NO、ET 水平有趨近趨勢(shì)，差異不顯著（P＞0.05）（表1）。

3 討論

冠心病血瘀證的發(fā)病機(jī)理有脂質(zhì)浸潤(rùn)、血栓形成及平滑肌增殖等學(xué)說，但氧化應(yīng)激損傷在冠心病發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制也不容忽視，其介導(dǎo)的內(nèi)皮功能損傷在血瘀證的形成和發(fā)展中是關(guān)鍵，不僅是臨床預(yù)防與治療冠心病的重要節(jié)點(diǎn)，也是中醫(yī)活血化瘀藥物治療作用靶向節(jié)點(diǎn)之一［5-7］。氧化應(yīng)激反應(yīng)伴隨RASS的激活，AngⅡ分泌水平升高通過Ras-Raf-ERK 途徑介導(dǎo)強(qiáng)縮血管物質(zhì)ET 的產(chǎn)生，啟動(dòng)氧化損傷反應(yīng)，AngⅡ水平升高是心血管疾病的危險(xiǎn)因素［8］，誘導(dǎo)活性氧ROS等的產(chǎn)生［9］，大量的ROS使NO 失活，通過抑制心肌K＋的去極化作用于L型慢Ca2＋通路［10］，產(chǎn)生負(fù)性肌力作用，促進(jìn)血瘀證的發(fā)展［11］。氧化應(yīng)激反應(yīng)以及氧化損傷所涉及的血管活性物質(zhì)變化在冠心病的研究中受到重視，這些血管活性物質(zhì)既可作為判斷血瘀證進(jìn)展的標(biāo)志分子，也可作為中藥干預(yù)的藥物療效及預(yù)后觀察的參考指標(biāo)［12］。

表1 各組AngⅡ、ROS、NO、ET 水平比較Table 1 Comparison of the levels of AngⅡ，ROS，NO and ET in each group

ET 是由血管內(nèi)皮細(xì)胞所分泌的一種強(qiáng)力縮血管活性肽，是由21 個(gè)氨基酸組成的酸性多肽，具有促血管平滑肌細(xì)胞增殖、收縮血管和升高血壓的作用。NO 是血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的血管活性物質(zhì)，具有強(qiáng)大的舒張血管、抑制血小板聚集與激活、抑制中性粒細(xì)胞與單核細(xì)胞對(duì)血管壁的浸潤(rùn)與吸附、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和抗血栓形成的作用。ET 與NO 相互制約、相互拮抗、相互協(xié)調(diào)，在正常情況下保持平衡維持內(nèi)皮正常功能［13-14］。AngⅡ、ET 與其相關(guān)基因高度表達(dá)成為判定冠心病血瘀證模型的重要指標(biāo)［15］，ROS反映了血瘀證血管損傷程度［16］。在本試驗(yàn)工作中，觀察到和對(duì)照組比較，模型組AngⅡ水平顯著升高（P＜0.01），模型組ET 水平升高而NO 水平降低（P＜0.01或P＜0.05），提示高水平AngⅡ促進(jìn)ET 分泌，ET／NO 平衡向ET 傾斜，啟動(dòng)氧化損傷，同時(shí)，在試驗(yàn)中觀察到，和對(duì)照組比較，模型組ROS水平升高（P＜0.05），說明模型動(dòng)物的血管已受到損害。

血府逐瘀湯為清代名醫(yī)王清任所創(chuàng)，方中當(dāng)歸、生地、川芎、赤芍、桃仁、紅花有活血養(yǎng)血功效，柴胡、枳殼、牛膝等有活血祛瘀功效［17］，在本試驗(yàn)中觀察到，以血府逐瘀湯干預(yù)后，和模型組比較，中藥組AngⅡ、ET 及ROS水平均降低（P＜0.01或P＜0.05），而血清NO 水平顯著升高（P＜0.01），趨近于對(duì)照組水平（P＞0.05），說明血府逐瘀湯能恢復(fù)冠心病血瘀證血管活性物質(zhì)分泌水平，推測(cè)其活血化瘀功效可能部分通過減少氧化應(yīng)激反應(yīng)、改善內(nèi)皮功能而實(shí)現(xiàn)的，同時(shí)，也提示我們?nèi)绻茉谘趸瘧?yīng)激開始時(shí)有針對(duì)性地對(duì)始動(dòng)血管活性分子如AngⅡ等進(jìn)行干預(yù)，有可能比較有效地預(yù)防冠心病血瘀證的發(fā)生和發(fā)展。

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