顧海娟，王星果，王慧娟，邵 芳，顧志良

（常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

動物的生長發(fā)育受體內(nèi)外各種因素的作用，并由機體的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的生長軸進行調(diào)控.生長軸是由“下丘腦—垂體—（生長激素）—靶器官”上有關(guān)激素及受體組成的神經(jīng)內(nèi)分泌軸.GH經(jīng)血液循環(huán)運至靶組織或器官，通過兩種方式發(fā)揮作用：一是直接作用，GH直接與細胞膜表面的生長激素受體（growth hor?mone receptor，GHR）結(jié)合，啟動細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，從而參與靶器官的代謝活動，調(diào)節(jié)生長發(fā)育；二是間接作用，GH先與靶細胞表面的GHR結(jié)合，作用于靶器官，產(chǎn)生類胰島素生長因子（insulin-like growth fac?tors，IGFs），后者再通過內(nèi)分泌、旁分泌或自分泌途徑作用于肌肉和骨骼等靶器官，調(diào)節(jié)細胞的代謝，促進動物的生長發(fā)育[1].雞的生長也不例外，同樣依靠生長軸的作用來調(diào)節(jié)自身的生長.

類胰島素生長因子，是生長激素產(chǎn)生生理作用過程中必須的一種活性蛋白多肽物質(zhì)[2].IGF-I是一種含有70個氨基酸的堿性單鏈多肽，廣泛存在于機體組織中，具有調(diào)節(jié)機體生長發(fā)育、生殖、免疫和機體代謝的功能[2].雞IGF-I的一級結(jié)構(gòu)首先由Rinderkneeht和Humkel（1978）闡明，與胰島素49%同源[3].1996年，Klein等通過原位雜交和遺傳連鎖分析，將雞的IGF-I基因定位在1號染色體的短臂近著絲粒處.Yoshitaka Kaji?moto等（1991）通過對雞的IGF-I基因進行克隆和序列分析，發(fā)現(xiàn)其組成是4個外顯子和3個內(nèi)含子，長度為50 kb，且成熟的IGF-I多肽由外顯子2、3編碼，而外顯子1、4分別編碼N末端和C末端及一些非編碼序列.因為選擇性剪接和選擇性加尾，雞的IGF-I基因會產(chǎn)生兩條不同的mRNA[4].

動物肌肉的生長發(fā)育與IGFs系統(tǒng)基因的時空特異性表達密切相關(guān)[5-7]，但目前關(guān)于其發(fā)育表達模式的資料較少，肉雞不同組織和肌肉、脂肪和肝臟IGFs基因表達的發(fā)育性變化模式還有待進一步探討.對于IGFs發(fā)育表達模式的研究，將有助于了解動物生長過程中激素調(diào)控的本質(zhì).本實驗選取不同發(fā)育時期的白羽AA肉雞（八個不同發(fā)育階段，各階段3個樣品，總共24個樣品），通過實時熒光定量PCR技術(shù)來研究肉雞IGF-I基因mRNA的時空表達特征.實驗結(jié)果將為研究IGF-I基因在肉雞發(fā)育過程中的調(diào)控機制提供資料，為揭示IGF-I基因在肉雞早期生長發(fā)育中的功能奠定一定的基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

本研究采集出生后1日齡及1周齡、2周齡、3周齡、4周齡、5周齡、6周齡、7周齡的AA白羽肉雞（每周齡分別選取三只樣品雞，總共24只樣品雞）胸肌、腿肌、脂肪、心臟、肝臟、脾、肺、腎、腸、腺胃、肌胃和腦12個組織樣品，迅速置于液氮中速凍，并于-80℃冰箱中保存.用TRIzol試劑提取不同組織和不同發(fā)育時期肌肉、脂肪、肝臟的總RNA.

1.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)已經(jīng)報導(dǎo)的雞IGF-I和β-actin基因序列設(shè)計引物chiIGF1F1：5′-TTAACCAGTTCTGCTGCTGC-3′chiIGR1：5′-TGGTGTAAGCGTCTACTGCT-3′；dubactinqF：5′-CACGGTATTGTCACCAACTG-3′，dubactinqR：5′-ACAGCCTGGATGGCTACATA-3′.引物由上海生工生物工程有限公司合成.

1.3 IGF-I基因表達的實時熒光定量PCR檢測

采用兩步PCR法進行熒光定量PCR.對RNA樣品首先進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后進行實時熒光定量PCR，反應(yīng)體系：Power SYBR Green PCR Master Mix 10μl，正反向引物（10 μmol/L）各 1 μl，去離子無菌水6.67 μl，RT產(chǎn)物1.33 μl.反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 sec，60 ℃ 1 min，PCR擴增后進行熔解曲線分析，溫度以0.5℃/30 S的速率從55℃緩慢遞增到95℃.

1.4 數(shù)據(jù)收集和分析

本實驗選擇相對定量熒光PCR法，通過在不同組織中內(nèi)標(biāo)β-actin和目標(biāo)基因IGF-1分別進行實時熒光PCR檢測，測定其Ct值，根據(jù)相對實時熒光定量PCR 2-ΔCt值法，算出每個樣品中IGF-1基因與β-actin基因表達的相對值.在Excel中作出IGF-1mRNA相對于β-actin表達量的柱狀圖.并用SPSS12.0進行顯著性檢驗.實時熒光定量PCR結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 肉雞IGF-I和β-actin基因的RT-PCR產(chǎn)物檢測

隨機選取總RNA樣品，首先進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以獲得肉雞的cDNA，然后進行實時熒光定量PCR的預(yù)實驗.即選用IGF-I、β-actin這兩對引物，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，進行RT-PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳來檢測產(chǎn)物是否進行了特異性的擴增.經(jīng)電泳發(fā)現(xiàn)擴增條帶均位于DNA Marker 100～250 bp之間，且擴增條帶大小與設(shè)計相符，說明目的基因得到了PCR擴增，而且產(chǎn)物特異性非常好，故可以用于熒光定量PCR檢測.

2.2 肉雞不同組織中IGF-I基因mRNA表達

IGF-I基因mRNA在4周齡肉雞的12個組織中的表達呈現(xiàn)組織差異性.在肝臟中IGF-I基因mRNA表達量最高，顯著高于其余11個組織的表達量；表達量次之的是肺，但其量相對于肝臟中的表達還是較少的；其次在胸肌、腿肌、心肌中的表達量均稍低于肺；在脂肪、脾、腺胃、肌胃、腸、腦中的表達量都很少，脂肪、腦中的表達量相對于脾、腺胃、肌胃、腸略高，在脾這些組織中表達極微量；而在腎臟中未檢測到有IGF-I基因mRNA的任何表達.肝臟中IGF-I mRNA的表達與其余各組織的表達量均存在顯著差異，說明其表達量顯著高于其他組織.可知4周齡肉雞的肝臟中大量表達IGF-I基因，這些高表達的IGF-I可以以內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌作用來調(diào)控肝臟的生長發(fā)育（見圖2）.

圖1 IGF-I和β-actin的PCR擴增片段(M：DL-2000 DNA marker)

圖2 雞IGF-I基因的mRNA在12種不同組織的表達

2.3 肉雞不同發(fā)育時期的IGF-I基因mRNA表達

各發(fā)育時期的腿肌中表達量最高的是6周齡；其次是4周齡，其表達量比6周齡時的表達略低；在1、3、5周齡時的表達量相近；在2周齡時的表達比在1、3、5周齡中的表達量少些；然后是7周齡時的表達，其又少于2周時期；出生后1日齡的個體表達量最少，呈微量.經(jīng)顯著性檢驗發(fā)現(xiàn)1日齡的表達量與3、4、6周齡時的表達量存在顯著差異，7周與4、6周齡的表達量呈顯著性差異.說明這些時期的表達量相差較大，IGF-I在不同時期腿肌的發(fā)育中均有著重要作用，見圖3.

脂肪中3周齡個體的IGF-I基因mRNA表達量最高，明顯高于其他各時期；4、5周齡的表達量相似，但5周時表達比4周時略高；其次是6周個體的表達，約是4周的1/2；而在7周時呈極微量表達.就整體趨勢而言是隨著年齡的增長其表達量而隨之減少.3周與7周間的表達呈顯著差異，3周的表達量顯著高于7周.提示IGF-I對肉雞脂肪組織的作用主要體現(xiàn)在發(fā)育早期，見圖4.

圖5顯示肝臟中表達量最高的是3周齡的個體；其次是2周個體，其表達量比3周的略少；5周齡個體的表達量比2周齡少，表達量較中；4、6、7周齡個體的表達量相似，但是7周時比其他兩個時期少；在1周齡時呈微量表達；而出生后1日齡時表達量呈極微量.在肝臟中IGF-I表達的整體趨勢相近于剛出生時IGF-I mRNA的表達量，隨年齡增大其表達量逐漸增加，但到一定時期其表達量又趨近平穩(wěn).與腿肌、脂肪的同一發(fā)育時期相比，其IGF-I基因mRNA的表達顯著高于二者.肝臟中IGF-I基因mRNA發(fā)育性表達不表現(xiàn)顯著差異.

圖3 腿肌不同發(fā)育時期IGF-I基因mRNA的表達量

圖4 脂肪不同發(fā)育時期IGF-I基因mRNA的表達量

3 討論

GH的重要調(diào)節(jié)作用，其除了與靶組織、器官的GHR結(jié)合而直接發(fā)揮其促生長作用外，還可以促進靶器官產(chǎn)生IGF-I.IGF-I以內(nèi)分泌、旁分泌、自分泌的形式促進各組織器官的生長發(fā)育.同樣，雞的GH也需要與受體有效結(jié)合，并最終依賴IGFs的表達來實現(xiàn)其促生長作用.

從實驗結(jié)果可知，4周齡肉雞的12個不同組織中，肝臟的IGF-I表達量最高，與其余11個組織中的表達量均存在顯著差異，說明肝臟是產(chǎn)生IGF-I的主要場所，是IGF-I發(fā)揮內(nèi)分泌、自分泌、旁分泌的主要靶器官.除肝臟外，在胸肌、腿肌、脂肪、心肌、肺、腦中均有少量表達，而在腺胃、肌胃、腸中僅有微量表達，但在腎臟中沒有表達.說明雞個體的許多組織器官均可產(chǎn)生IGF-I，從而發(fā)揮其自分泌、旁分泌作用.

圖5 肝臟不同發(fā)育時期IGF-I基因mRNA的表達量

IGF-I在肌肉中的過量表達可顯著促進肌肉的生長發(fā)育，這已在轉(zhuǎn)基因鼠和雞上得到證實[8].本實驗結(jié)果也顯示IGF-I基因mRNA在腿肌中出生后表達量呈不同程度的增加，在六周齡時達到最大值，七周齡時開始下降.從出生后1周到6周，其IGF-I基因mRNA的表達量均較高，3、4、6周時表達量與剛出生1天的個體表達量出現(xiàn)顯著差異，說明這些時期的肌肉生長需要大量的IGF-I作用.而該段時間也是雞腿肌逐漸發(fā)育的時期，由此表明，在雞腿肌發(fā)育較快時期，腿肌中IGF-I表達量也相應(yīng)較高，說明IGF-I對腿肌的生長發(fā)育具有重要作用.這一結(jié)果與王勇生等在北京鴨胸肌中IGF-I的發(fā)育性表達變化研究結(jié)論相似[8].說明IGF-I對禽類的肌肉生長具有重要作用.Duclos（2005）發(fā)現(xiàn)雞肌肉組織IGF-1的自分泌對其生長起主要作用.有研究發(fā)現(xiàn)，使用促進劑使IGF-I基因的表達僅限制在骨骼肌時，會出現(xiàn)顯著的肌肉營養(yǎng)過?，F(xiàn)象，但體重與血清IGF-I濃度并未增加，表明局部產(chǎn)生的IGF-I可在動物生長調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[8].因此，推測雞腿肌組織產(chǎn)生的IGF-1對雞腿肌的發(fā)育也具有局部效應(yīng)，其可以明顯促進雞腿肌的生長發(fā)育.

肝臟是IGF-I的主要分泌器官.IGF-I的表達量在出生早期較少，隨年齡增大其表達量也逐漸增加，但到一定時期其表達量又趨近平衡，各時期的表達無顯著差異，說明IGF-I在肝臟早期生長發(fā)育的各階段均具有一定的作用.劉國慶等[9]在羔羊肝臟中對IGF-I和IGF-IR基因表達的發(fā)育性變化研究中得出的結(jié)論也是IGF-I的表達量先是隨年齡的增大其量也增加，然后再逐漸下降，與本實驗的研究結(jié)果相似.

體內(nèi)和體外的實驗均表明，IGF-I可能是脂肪細胞增殖和分化所必需的關(guān)鍵因子之一，IGF-I可能通過內(nèi)分泌或（和）旁（自）分泌促進脂肪組織的發(fā)育[10].在雞脂肪的不同發(fā)育時期IGF-I基因mRNA的表達量是隨著周齡的上升而呈漸漸下降的趨勢，7周的表達量與3周的量存在顯著性差異，說明脂肪細胞的增值主要發(fā)生于生長早期.提示IGF-I主要在雞生長發(fā)育的早期促進脂肪細胞的增殖和分化.這與周杰等[11]在二花臉和大白豬的脂肪組織中GHR、IGF-I和IGF-IR基因表達的發(fā)育性變化研究中的結(jié)果相同.

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