周 艷，牟寬厚，韓 丹，李 玥，侯衛(wèi)坤，馬亞梅，呂社民

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院：1.第一附屬醫(yī)院皮膚科，2.遺傳學(xué)與分子生物學(xué)系，陜西西安 710061；3.西安市紅會醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，陜西西安 710054)

苦參堿可抑制Th17所誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的表達(dá)

周 艷1，牟寬厚1，韓 丹1，李 玥2，侯衛(wèi)坤3，馬亞梅1，呂社民2

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院：1.第一附屬醫(yī)院皮膚科，2.遺傳學(xué)與分子生物學(xué)系，陜西西安 710061；3.西安市紅會醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，陜西西安 710054)

目的考察苦參堿(matrine，Mat)對Th17誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocytes，KC)系HaCa T細(xì)胞白細(xì)胞介素-17受體A(IL-17RA)、白細(xì)胞介素-21受體(IL-21R)及白細(xì)胞介素-22受體1(IL-22R1)表達(dá)的影響。方法培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞，用Th17分泌的主要效應(yīng)因子IL-17A(10 ng/m L)、IL-21(10 ng/m L)及IL-22(10 ng/m L)聯(lián)合刺激HaCaT細(xì)胞模擬類銀屑病樣細(xì)胞模型，再用10μg/mL及100μg/mL的Mat干預(yù)此細(xì)胞模型，采用RT-qPCR及Western blot方法檢測IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的表達(dá)變化。結(jié)果IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的mRNA及蛋白在HaCaT細(xì)胞上有表達(dá)。IL-17A、IL-21及IL-22聯(lián)合刺激可以顯著促進(jìn)HaCaT細(xì)胞IL-17RA、IL-21R m RNA及蛋白表達(dá)，IL-22R1蛋白的表達(dá)量升高(P＜0.05)。Mat單獨(dú)干預(yù)或與上述細(xì)胞因子聯(lián)合干預(yù)組與未處理的HaCaT細(xì)胞組相比，IL-17RA、IL-21R及IL-22R1表達(dá)無顯著下降(P＞0.05)，但可以顯著降低IL-17A、IL-21及IL-22聯(lián)合刺激后所升高的受體蛋白表達(dá)(P＜0.05)。結(jié)論IL-17A、IL-21及IL-22聯(lián)合刺激角質(zhì)形成細(xì)胞可以增強(qiáng)IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的表達(dá)，Mat可抑制這種增強(qiáng)作用，可能在多種Th17介導(dǎo)的免疫性皮膚病中發(fā)揮抗炎作用。

苦參堿；Th17細(xì)胞因子；白介素-17受體A；白介素-21受體；白介素-22受體1

角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocytes，KC)是許多皮膚病中參與炎癥反應(yīng)和皮膚免疫的重要免疫細(xì)胞［1］。HaCaT細(xì)胞株具有與正常KC相似的分化特征，在體外容易培養(yǎng)，可作為體外研究藥物及皮膚病的良好模型［2］。近年來，Th17作為Th細(xì)胞的新亞型，參與銀屑病、接觸性皮炎、特應(yīng)性皮炎等許多皮膚病的免疫發(fā)病機(jī)制［3］。Th17細(xì)胞主要產(chǎn)生IL-17A、IL-21和IL-22等，IL-17RA、IL-21R和IL-22R1分別為IL-17A、IL-21和IL-22的主要受體［4-6］。Th17作用于皮膚需要通過激活上述受體而發(fā)揮其作用?？鄥A(matrine，Mat)對多種自身免疫性疾病具有抗炎作用［7］，也可用于炎癥性皮膚疾病的治療，但其作用機(jī)制復(fù)雜，尤其是其抑炎機(jī)制是否與Th17相關(guān)尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)從Mat對Th17所產(chǎn)生因子的受體影響著手，選擇其作用于皮膚的角質(zhì)形成細(xì)胞作為研究靶點(diǎn)，以期為Mat治療銀屑病等多種皮膚病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCa T細(xì)胞)由第四軍醫(yī)大學(xué)皮膚科實(shí)驗(yàn)室饋贈，本實(shí)驗(yàn)室保存。RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基(Hyclone，美國)，胰蛋白酶及EDTA(杭州四季青公司)。Trizol法總RNA抽提試劑盒(Invitrogen，美國)；用于RT-qPCR的IL-17RA、IL-21R及IL-22R1引物(北京奧克公司)；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa，日本)；5-Target qPCR Kit(Bio-Rad，美國)；cDNA試劑盒(Fermentas，加拿大)。

Mat注射液(江蘇連云港正大天晴醫(yī)藥有限公司)，臨用時用生理鹽水稀釋成10、100μg/m L作為實(shí)驗(yàn)濃度。細(xì)胞因子IL-17A、IL-21及IL-22均購自Peprotech公司(美國)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將10 ng/mL作為實(shí)驗(yàn)濃度。鼠單克隆IL-17RA抗體購自R&D Systems公司(美國)，兔多克隆IL-21R抗體和兔多克隆IL-22R1抗體購自Abcam公司(英國)，GAPDH購自Santa Cruz公司(美國)。

1.2 角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)HaCa T細(xì)胞用含100 m L/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(含100 U/m L青霉素，100 U/m L鏈霉素)，于37℃、50 m L/L CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%融合時，用2.5 g/L胰蛋白酶+0.5 g/L EDTA 37℃進(jìn)行消化傳代。

1.3 細(xì)胞因子及藥物干預(yù)以細(xì)胞密度1×105個/mL接種于24孔培養(yǎng)板，置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞平穩(wěn)生長至70%～80%融合后，換成無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，分別加入Mat(10、100μg/m L)、IL-17、IL-21、IL-22、IL-17+IL-21、IL-17+IL-22、IL-21+ IL-22、IL-17+IL-21+IL-22以及IL-17+IL-21+IL-22+Mat(100μg/m L)進(jìn)行分組培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為24 h。每組平行設(shè)3個復(fù)孔，對照組為不加藥物的無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。24 h后將各組細(xì)胞分別離心，收取沉淀的細(xì)胞。

1.4 用RT-qPCR法檢測IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的mRNA表達(dá)將上述細(xì)胞加入1 m L Trizol抽打勻漿；按照標(biāo)準(zhǔn)抽提步驟進(jìn)行RNA抽提；將樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，建立RT-qPCR反應(yīng)體系；反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性5 s、退火30 s、72℃延伸15 s，共40個循環(huán)。IL-17RA、IL-21R及IL-22R1引物及內(nèi)參β-actin引物(北京奧克公司)見表1。應(yīng)用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ熒光染料技術(shù)進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)，計(jì)算機(jī)分析Ct值，用以評定各因子m RNA的表達(dá)水平。

表1 RT-qPCR引物信息Tab.1 Information of primers for RT-qPCR

1.5 Western blot法檢測IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的蛋白表達(dá)采用改良型RIPA細(xì)胞裂解液，即50 mmol/L Tris-HCl，p H 7.4，150 mmol/L NaCl，10 m L/L Triton X-100，0.2 mmol/L EDTA，10 g/L脫氧膽酸鈉，1 g/L十二烷基硫酸鈉(SDS)，加蛋白酶抑制劑(Beyotime，中國)，然后離心5 min。BCA方法測定細(xì)胞總蛋白濃度，按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜并封閉后，分別加入鼠單克隆IL-17RA抗體(稀釋成1∶1 000)，兔多克隆IL-21R抗體(1∶1 000)和兔多克隆IL-22R1抗體(1∶1 000)1 m L，4℃過夜。再加入HRP標(biāo)記的抗小鼠或抗兔的二抗(1∶1 000)1 m L，室溫孵育1 h，洗膜、顯影，置UVP成像系統(tǒng)中攝影，分析目的基因與內(nèi)參基因GAPDH的條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用方差分析及t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IL-17A、IL-21及IL-22單獨(dú)及聯(lián)合干預(yù)HaCaT細(xì)胞時其受體mRNA的表達(dá)變化IL-17RA、IL-21R及IL-22R1 mRNA在HaCaT細(xì)胞上有明顯表達(dá)。IL-17A、IL-21及IL-22單獨(dú)、2因子以及3因子聯(lián)合作用HaCaT細(xì)胞時，各處理組其靶向受體mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，IL-17A和IL-21單獨(dú)及3因子聯(lián)合作用均可誘導(dǎo)其靶向受體表達(dá)增高，與正常對照比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1)。

圖1 Th17細(xì)胞因子單獨(dú)及聯(lián)合干預(yù)HaCaT細(xì)胞時對其靶向受體mRNA表達(dá)的影響Fig.1 Effects of Th17 cytokines treatment alone or in combination on the m RNA expressions of IL-17RA，IL-21R and IL-22R1 in HaCa T cells

2.2 Mat對HaCaT細(xì)胞IL-17RA、IL-21R和IL-22R1 mRNA表達(dá)的影響10、100μg/m L的Mat刺激HaCa T細(xì)胞24 h后，IL-17RA、IL-21R和IL-22R1與正常對照組相比，m RNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖2)。

IL-17A(10 ng/m L)、IL-21(10 ng/m L)及IL-22 (10 ng/m L)聯(lián)合刺激可使IL-17RA mRNA的表達(dá)量上調(diào)95.25%，IL-21R mRNA的表達(dá)量上調(diào)171.2%，與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；可使IL-22R1 mRNA的表達(dá)量上調(diào)55.98%，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。Mat(10μg/mL)及Mat(100μg/mL)分別可以使經(jīng)上述細(xì)胞因子聯(lián)合刺激后所上調(diào)的IL-17RA mRNA顯著下降120.5%及144.6%(P＜0.01)；IL-21R mRNA顯著下降238.9%及242%(P＜0.01)；IL-22R1 mRNA顯著下降了108.6%及90.03%(P＜0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Mat(100μg/m L)與Th17分泌的3種細(xì)胞因子(10 ng/mL)聯(lián)合干預(yù)后，仍可使經(jīng)細(xì)胞因子刺激后所上調(diào)IL-17RA m RNA的表達(dá)下調(diào)77.27%(P＜0.05)，IL-21R m RNA的表達(dá)下調(diào)146.7%(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IL-22R1 mRNA的表達(dá)下調(diào)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖2)。

圖2 Mat對Th17細(xì)胞因子干預(yù)后HaCaT細(xì)胞表達(dá)IL-17RA、IL-21R及IL-22R1 mRNA的影響Fig.2 Effects of Mat on the mRNA expressions of IL-17RA，IL-21R and IL-22R1 in HaCa T cells treated with Th17 cytokines

2.3 Mat對HaCaT細(xì)胞IL-17RA、IL-21R和IL-22R1蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測結(jié)果表明，IL-17RA、IL-21R和IL-22R1蛋白在HaCaT細(xì)胞表面亦呈陽性表達(dá)(圖3A)。10、100μg/mL的Mat分別刺激HaCa T細(xì)胞24 h后，IL-17RA、IL-21R和IL-22R1的蛋白表達(dá)較正常對照組有不同程度的降低，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖3B)。

圖3 Western blot檢測Mat對Th17細(xì)胞因子干預(yù)后HaCaT細(xì)胞IL-17RA、IL-21R及IL-22R1蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Mat on the protein expressions of IL-17RA，IL-21R and IL-22R1 in HaCa T cells treated with Th17 cytokines analyzed by Western blot

IL-17A(10 ng/m L)、IL-21(10 ng/m L)及IL-22 (10 ng/m L)聯(lián)合刺激可使IL-17RA蛋白的表達(dá)上調(diào)178.7%(P＜0.001)，IL-21R蛋白上調(diào)183.1%(P＜0.01)，IL-22R1蛋白上調(diào)127.1%(P＜0.05)，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Mat(10μg/m L)及Mat(100μg/m L)分別可以使經(jīng)上述細(xì)胞因子刺激后所上調(diào)的IL-17RA蛋白顯著下降了191.5%(P＜ 0.01)及255%(P＜0.001)，且呈量效關(guān)系；IL-21R蛋白顯著下降242.9%(P＜0.01)及254.7%(P＜0.01)；IL-22R1蛋白顯著下降184.1%(P＜0.05)及193.1%(P＜0.05)；而Mat(100μg/m L)與Th17分泌的3種細(xì)胞因子聯(lián)合孵育后，仍可使經(jīng)Th17細(xì)胞因子刺激后所上調(diào)IL-17RA蛋白的表達(dá)下調(diào)185.8% (P＜0.01)；IL-21R蛋白的表達(dá)下調(diào)175.3%(P＜0.01)；IL-22R1蛋白的表達(dá)下調(diào)105.5%(P＜0.05，圖3)。

3 討 論

Mat是中藥苦參的主要生物堿，具有廣泛的藥理作用。臨床上Mat可用來治療銀屑病等慢性炎癥性皮膚疾?。?］，但其作用機(jī)制尚不清楚。近年來，多位學(xué)者已證實(shí)銀屑病為Th1和Th17所介導(dǎo)的免疫性疾?。?］。我們以前的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)IL-17A、IL-21及IL-22及其受體在銀屑病的表皮細(xì)胞高表達(dá)。銀屑病的組織病理顯示KC角化過度及角化不全。KC細(xì)胞為銀屑病最重要的病變細(xì)胞。因此，我們通過用Th17分泌的細(xì)胞因子IL-17A、IL-21及IL-22單獨(dú)及2因子和3因子聯(lián)合干預(yù)HaCat細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其靶受體的m RNA表達(dá)無顯著差異。因此，我們認(rèn)為Th17效應(yīng)因子對自身受體存在較強(qiáng)的激活作用，與其他Th17分泌因子聯(lián)合作用不能加強(qiáng)或減弱其對自身受體的激活效應(yīng)。因此，我們將Th17最主要的3個效應(yīng)因子聯(lián)合刺激HaCat作為類銀屑病樣細(xì)胞模型，并應(yīng)用Mat進(jìn)行藥物干預(yù)，觀察其作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)首先發(fā)現(xiàn)，IL-17A、IL-21及IL-22作為Th17最具代表性的因子，可以正向調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞IL-17RA、IL-21R的基因和蛋白表達(dá)增加，同時促進(jìn)IL-22R1蛋白升高。這可能與炎癥因子正反饋地調(diào)節(jié)其受體的表達(dá)有關(guān)。以往研究表明，IL-17A作為很強(qiáng)的中性粒及單核細(xì)胞趨化因子，可能在銀屑病中通過和其受體IL-17RA結(jié)合，起到很強(qiáng)的促炎作用［10］。IL-21可以促進(jìn)T細(xì)胞向Th17分化，Th17又可以分泌IL-21，從而起到正反饋?zhàn)饔茫?1］。在銀屑病小鼠模型，IL-21通過IL-21R作用可誘發(fā)IFN-γ-依賴性銀屑病樣反應(yīng)，從而證實(shí)IL-21維持皮膚炎癥損傷的一種機(jī)制［12］。而IL-22則與其受體IL-22R1結(jié)合，發(fā)揮其促炎及表皮增生作用［13］。這些均證實(shí)3種細(xì)胞因子聯(lián)合作用可以從不同機(jī)制相互促進(jìn)銀屑病發(fā)生。

在Mat單獨(dú)及聯(lián)合細(xì)胞因子干預(yù)時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mat單獨(dú)刺激可以抑制HaCat細(xì)胞上述細(xì)胞因子受體的表達(dá)，但與正常對照相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Mat對正常角質(zhì)形成細(xì)胞的抗Th17作用不明顯。但是與Th17細(xì)胞因子刺激組相比，IL-17RA及IL-21R明顯被抑制，而對IL-22R1抑制作用較弱。而Mat與Th17細(xì)胞因子聯(lián)合干預(yù)則會削弱這一作用。提示Mat在抑制Th17反應(yīng)中，對IL-17及IL-21所誘導(dǎo)的抗炎功能更強(qiáng)大，而抑制角質(zhì)形成細(xì)胞IL-22所介導(dǎo)的增殖及促炎功能較小。ZHAO等［14］研究發(fā)現(xiàn)Mat可抑制自身免疫性腦脊髓炎動物模型IL-23/ IL-17軸，從而改善其癥狀。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。因此，推測Mat治療銀屑病等皮膚病可通過抑制Th17而發(fā)揮功效。

Th17所介導(dǎo)的皮膚病發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，多種組織細(xì)胞及炎癥介質(zhì)參與其中。本實(shí)驗(yàn)從角質(zhì)形成細(xì)胞的角度，首次探討了Mat對Th17誘導(dǎo)的人KC株HaCaT細(xì)胞IL-17RA、IL-21R和IL-22R1的抑制作用。并推測Mat在Th17所誘導(dǎo)的銀屑病等皮膚病中可能直接作用于其抗炎靶點(diǎn)細(xì)胞角質(zhì)形成細(xì)胞，抑制其分泌的Th17細(xì)胞因子受體，從而發(fā)揮其治療作用。

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(編輯 國 榮)

Matrine inhibits Th17 cytokine-induced IL-17RA，IL-21R and IL-22R1 expressions of keratinocytes

ZHOU Yan1，MOU Kuan-hou1，HAN Dan1，LI Yue2，HOU Wei-kun3，Ma Ya-mei1，LüShe-min2
(1.Department of Dermatology，the First Affiliated Hospital，Medical School of Xi'an Jiaotong University，2.Department of Genetics and Molecular Biology，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061；3.Department of Bone and Joint Diseases，Xi'an Honghui Hospital，Xi'an 710054，China)

ObjectiveTo investigate the effects of matrine(Mat)on the expressions of IL-17RA，IL-21R and IL-22R1 induced by Th17 cytokines in HaCaT of keratinocytes.MethodsWe cultured HaCaT cells and stimulated HaCaT cells with Th17 effector cytokines IL-17A(10 ng/m L)，IL-21(10 ng/m L)and IL-22(10 ng/m L) together to simulate psoriasis-like cell model.The cell model was treated with 10μg/m L and 100μg/m L Mat.RT-qPCR and Western blot were applied to detect the expressions of IL-17RA，IL-21R and IL-22R1.MethodsIL-17RA，IL-21R and IL-22R1 were expressed in HaCaT cells at both m RNA and protein levels.HaCaT cells triggered by IL-17A，IL-21 and IL-22 together could significantly enhance the m RNA and protein expressions of IL-17RA and IL-21R as well as the protein expression of IL-22R1(P＜0.05).Mat treatment on the cells without Th17 cytokine stimulation did not affect IL-17RA，IL-2 1 R or IL-2 2 R 1 expression(P＞0.05)，but Mat treatment to the cellsseparately or with Th17 cytokine stimulation together can significantly inhibit IL-17RA，IL-21R and IL-22R1 protein expressions compared with Th17 cytokine stimulation group(P＜0.05).ConclusionStimulation of HaCaT cells with IL-17A，IL-21 and IL-22 can enhance the expressions of IL-17RA，IL-21R and IL-22R1.Mat seems to play an anti-inflammatory role through abrogating the stimulatory effects of Th17 cytokines on their receptor expressions in autoimmune skin disease.

matrine；Th17 cytokine；interleukin-17 receptor A；interleukin-21 receptor；interleukin-22 receptor 1

R751

A

1671-8259(2014)05-0695-05

10.7652/jdyxb201405026

2014-04-28

2014-06-12

陜西省社會發(fā)展攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(No.2010K16-04)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81201373) Supported by the Social Development Research Project of Shaanxi Province(No.2010K16-04)and the National Natural Science Foundation of China(No.81201373)

呂社民，教授，博士生導(dǎo)師.E-mail：lushemin@mail.xjtu.edu.cn

周艷(1977-)，女(漢族)，主治醫(yī)師，博士研究生，主要從事免疫相關(guān)皮膚病研究.E-mail：yanzhou7798@163.com

時間：2014-07-22 16∶28 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1628.009.html