潘 劍，李紹平，李建雄，連佛彥，黃 燕，秦 龍

(蘭州大學第二醫(yī)院：1.急救中心，2.神經(jīng)內(nèi)科，3.內(nèi)科ICU，4.藥學部，甘肅蘭州 730030)

◇中醫(yī)藥研究◇

羥基紅花黃色素A對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的保護作用

潘 劍1，李紹平1，李建雄2，連佛彥3，黃 燕4，秦 龍4

(蘭州大學第二醫(yī)院：1.急救中心，2.神經(jīng)內(nèi)科，3.內(nèi)科ICU，4.藥學部，甘肅蘭州 730030)

目的觀察羥基紅花黃色素A(HSYA)對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的保護作用，并探討其作用機制。方法采用MTT法檢測細胞存活率，流式細胞術檢測細胞凋亡率；二乙酸二氯熒光素鹽(DCFH-DA)法檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)含量；羅丹明123(Rhodamine123)染色法檢測細胞線粒體膜電位；Western blot法檢測Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9的表達。結果1 mmol/L MPP+處理SH-SY5Y細胞48 h后，細胞存活率顯著降低，并誘導細胞產(chǎn)生凋亡，凋亡率達(38.6±1.8)%。而HSYA(15、60、120μmol/L)預處理1 h，可明顯增加SH-SY5Y細胞存活率(P＜0.001)，并能有效抑制MPP+誘導的細胞調(diào)亡(P＜0.01)；可明顯抑制MPP+誘導的細胞內(nèi)ROS的增加(P＜0.001)；也能有效抑制MPP+誘導的細胞線粒體膜電位的降低(P＜0.01)。120μmol/L HSYA預處理能顯著性增加Bcl-2/Bax比值(P＜0.01)；能夠明顯抑制MPP+誘導的胞質(zhì)Cyt-C的釋放(P＜0.05)和Caspase-3、Caspase-9的高表達(P＜0.05，P＜0.05)。結論HSYA預處理能明顯提高MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷的細胞存活率，可有效抑制細胞調(diào)亡的發(fā)生，其機制可能與抑制細胞線粒體凋亡途徑有關。

羥基紅花黃色素A；SH-SY5Y細胞；細胞凋亡；線粒體

神經(jīng)元的凋亡廣泛參與腦血管病及一些神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病，如腦缺血再灌注損傷、阿爾茨海默病和帕金森病等。研究發(fā)現(xiàn)，活性氧的釋放及由此導致的線粒體損傷在神經(jīng)元的凋亡過程中發(fā)揮非常關鍵的作用［1-2］，因而常把減輕氧化應激和抑制線粒體凋亡作為神經(jīng)保護藥物篩選的重點。

紅花黃色素(carthamin yellow)是菊科植物紅花花瓣中的最主要的色素成分，而羥基紅花黃色素A (hydroxysafflor yellow A，HSYA)是紅花黃色素中主要的水溶性單體成分，也被認為是紅花藥理功效的最有效成分［3-4］。近年來研究顯示，紅花黃色素以及HSYA具有明顯的抗氧化作用，可清除羥自由基和脂質(zhì)過氧化物等［5-6］，同時能改善腦微小循環(huán)障礙，對腦缺血再灌注損傷也具有明顯的保護作用［7-8］，這提示紅花黃色素在拮抗神經(jīng)細胞損傷性疾病方面可能很有潛力。本研究以MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡為模型，研究HSYA對SH-SY5Y細胞凋亡的保護作用及其可能機制，為紅花的神經(jīng)保護作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞購自中科院上海細胞庫。

1.2 藥物及試劑羥基紅花黃色素A(BRS011748，純度＞98%，成都貝斯特試劑有限公司)；DMEM/ F12(1∶1)高糖培養(yǎng)基，胰蛋白酶(美國Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)，1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)(美國Sigma公司)；二乙酸二氯熒光素鹽(DCFH-DA)活性氧檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)；細胞凋亡羅丹明123(Rhodamine123)染色試劑盒和Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒均(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。Cyt-C、Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3、β-actin抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.3 儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(美國SIM公司)，Accuri C6流式細胞儀(美國BD公司)，全自動酶標儀(德國BIO-RAD，Model 1550)，高速冷凍離心機(德國HERMLE公司)，DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 用含有100 U/m L青霉素和100 μg/m L鏈霉素和100 m L/L胎牛血清的DMEM/ F12(1∶1)高糖培養(yǎng)基于37℃、50 m L/L CO2條件下培養(yǎng)SH-SY5Y細胞。2～3 d用1 g/L胰蛋白酶消化傳代1次，待細胞至80%融合時進行實驗。

1.4.2 MTT法檢測細胞存活率 實驗設空白對照組、模型組(MPP+)和HSYA組(15、60、120μmol/L)，每組設4個復孔，所用藥物均用培養(yǎng)基稀釋。將SHSY5Y細胞以1×104個/孔接種于培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后，模型組直接加入1 mmol/L MPP+，HSYA組經(jīng)藥物預處理SH-SY5Y細胞1 h后再加入1 mmol/L MPP+，空白對照組則只加等體積培養(yǎng)基。藥物孵育48 h后，每孔加入MTT(質(zhì)量濃度為5 g/L)20μL，繼續(xù)孵育。4 h后棄上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100μL，振蕩數(shù)次，采用全自動酶標儀于570 nm處測定各孔的A值并計算細胞存活率。所有實驗均重復5次。

1.4.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 將SH-SY5Y細胞以1×105個/孔接種于培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后分別加入藥物處理：模型組(1 mmol/L MPP+)，HSYA組(15、60、120μmol/L HSYA預處理1 h后再加入1 mmol/L MPP+)，空白對照組(加等體積培養(yǎng)基)。待藥物作用48 h后，收集細胞，用預冷的PBS洗滌2遍，按照Annexine V-FITC/PI試劑盒說明操作，采用流式細胞儀檢測并分析細胞凋亡率。

1.4.4 熒光探針DCFH-DA檢測細胞內(nèi)活性氧水平將SH-SY5Y細胞以1×105個/孔接種于培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后分別加入藥物處理：模型組(1 mmol/L MPP+)，HSYA組(15、60、120μmol/L HSYA預處理1 h后再加入1 mmol/L MPP+)，空白對照組(加等體積培養(yǎng)基)。待藥物作用48 h后，去除細胞培養(yǎng)液，加入10μmol/L DCFH-DA溶液1 m L后孵育20 min。重懸細胞，使用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞3遍，利用流式細胞儀檢測其熒光強度值。

1.4.5 Rhodamine123染色法檢測細胞線粒體膜電位將SH-SY5Y細胞以1×105個/孔接種于培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后分別加入藥物處理：模型組(1 mmol/L MPP+)，HSYA組(15、60、120μmol/L HSYA預處理1 h后再加入1 mmol/L MPP+)，空白對照組(加等體積培養(yǎng)基)。待藥物作用48 h后，加入10μmol/L Rhodamine123染液1 mL后孵育30 min。重懸細胞，使用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞3遍，利用流式細胞儀檢測其熒光強度值。

1.4.6 Western blot法檢測Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9的表達 分別收集1 mmol/L MPP+、120μmol/L HSYA+MPP+和培養(yǎng)基作用48 h后的細胞，加入含有PMSF的RIPA裂解液160μL，冰浴30 min，待充分裂解后，高速冷凍離心機離心10 min (12 000 r/min，4℃)，胞漿蛋白Cyt-C離心60 min(20 000×g，4℃)，提取上清，并用BCA法對所提蛋白進行定量，規(guī)定上樣量為40μg。Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9抗體稀釋濃度均為1∶400，β-actin抗體稀釋濃度為1∶4 000，其他處理均參照文獻方法［9］。

1.5 統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件分析，并進行單因素方差分析(One-way ANVOA)，組間均數(shù)的多重比較使用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 HSYA對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞存活率的影響1 mmol/L MPP+作用SH-SY5Y細胞48 h后，細胞相對存活率僅為49.8%，與空白對照組比較呈顯著性降低(P＜0.001)。而經(jīng)HSYA(15、60、120 μmol/L)預處理1 h后，細胞存活率明顯升高(P＜0.001)，并表現(xiàn)出一定的濃度依賴性?？梢?，HSYA預處理能有效抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞死亡(圖1)。

圖1 HSYA對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞存活率的影響Fig.1 Effect of HSYA on cell viability induced by MPP+in SH-SY5Y cells(，n=5)

2.2 HSYA對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的影響1 mmol/L MPP+作用SH-SY5Y細胞48 h后可明顯誘導細胞凋亡，凋亡率為(38.6±1.8)%，與空白對照組的(1.2±0.01)%比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。而經(jīng)HSYA(15、60、120μmol/L)預處理1 h后，凋亡率明顯降低(P＜0.01)，分別為(21.4± 2.1)%、(12.3±1.6)%和(6.3±1.1)%?？梢姡琀SYA預處理能有效抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞調(diào)亡。

2.3 HSYA對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞ROS含量的影響1 mmol/L MPP+作用SH-SY5Y細胞48 h后，與空白對照組相比，細胞內(nèi)ROS含量明顯增加，熒光強度顯著增強(P＜0.001)；而經(jīng)HSYA(15、60、120μmol/L)預處理1 h后，與模型組比較，HSYA處理組熒光強度呈濃度依賴的減弱(P＜0.001，表1)?？梢?，HSYA預處理能有效抑制MPP+誘導的SHSY5Y細胞內(nèi)ROS的增加。

表1 HSYA對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞ROS含量的影響Tab.1 Effect of HSYA on ROS induced by MPP+in SHSY5Y cells(，n=5)

表1 HSYA對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞ROS含量的影響Tab.1 Effect of HSYA on ROS induced by MPP+in SHSY5Y cells(，n=5)

Control：空白對照組；MPP+：模型對照組。與空白對照組比較，###P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

組別DCF熒光強度(%of control) Control 100.0±8.9 MPP+581.3±30.3###15μmol/L HSYA+MPP+445.6±44.5*60μmol/L HSYA+MPP+311.7±20.1**120μmol/L HSYA+MPP+180.2±19.6***

2.4 HSYA對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞線粒體膜電位的影響1 mmol/L MPP+作用SH-SY5Y細胞48 h后，細胞線粒體膜電位顯著性降低(P＜0.001)，熒光強度僅為空白對照組的(45.2±5.9)%；紅/綠熒光強度比值由空白對照組的4.21±0.15降低為0.95±0.07。而經(jīng)HSYA(15、60、120μmol/L)預處理1 h后，與模型組比較，HSYA處理組細胞線粒體膜電位呈濃度依賴的升高(P＜0.01)，紅/綠熒光強度比值由模型組的0.95±0.07升高為1.87± 0.23、3.02±0.36和3.96±0.19(表2)?？梢奌SYA預處理能有效抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞線粒體膜電位的降低。

表2 HSYA對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞線粒體膜電位的影響Tab.2 Effect of HSYA on mitochondrial transmembrane potential induced by MPP+in SH-SY5Y cells(，n=5)

表2 HSYA對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞線粒體膜電位的影響Tab.2 Effect of HSYA on mitochondrial transmembrane potential induced by MPP+in SH-SY5Y cells(，n=5)

Control：空白對照組；MPP+：模型對照組。與空白對照組比較，###P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

組別熒光強度(%of control)紅/綠熒光強度比值Control 100.0±6.7 4.21±0.15 MPP+45.2±5.9###0.95±0.07###15μmol/L HSYA+MPP+64.4±9.1*1.87±0.23*60μmol/L HSYA+MPP+78.7±7.2*3.02±0.36**120μmol/L HSYA+MPP+90.2±8.6**3.96±0.19***

2.5 HSYA對SH-SY5Y細胞Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9表達的影響如圖2A所示，與空白對照組比較，1 mmol/L MPP+作用SH-SY5Y細胞48 h后，胞質(zhì)Cyt-C釋放明顯增加(P＜0.01)，與模型組比較，120μmol/L HSYA預處理顯著抑制Cyt-C的釋放(P＜0.05)；MPP+誘導Bcl-2表達明顯減少，Bax表達稍有增加，Bcl-2/Bax比值顯著性減小(P＜0.01)；與模型組比較，120μmol/L HSYA預處理能顯著性增加Bcl-2/Bax比值(P＜0.01，圖2B)。MPP+能明顯誘導SH-SY5Y細胞Caspase-3和 Caspase-9的高表達(P＜0.01，P＜0.05)；而120 μmol/L HSYA預處理能夠有效抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞Caspase-3和Caspase-9表達的增加(P＜0.05，P＜0.05，圖2C、2D)。

圖2 HSYA對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9表達的影響Fig.2 Effects of HSYA on the expressions of Cyt-C，Bcl-2，Bax，Caspase-3 and Caspase-9 induced by MPP+in SH-SY5Y cells(，n=5)

3 討 論

ROS誘發(fā)的線粒體凋亡途徑被認為是細胞凋亡的主要途徑之一［10］。在此過程中，ROS的堆積導致線粒體膜發(fā)生氧化受損并引起線粒體通透性轉(zhuǎn)導孔開放，進而引起線粒體膜電位的降低，并引起核膜的破裂以及細胞色素及凋亡誘導因子等的釋放［11-13］；進入胞質(zhì)的細胞色素C可活化Caspase-9并進一步激活細胞凋亡過程中最關鍵酶Caspase-3從而觸發(fā)凋亡級聯(lián)反應［14-15］。Bcl-2主要存在于線粒體外層膜上，其抑制凋亡的機制是它可直接或者間接地阻止細胞色素C自線粒體的釋出，從而抑制Caspase-9活化。Bax能與Bcl-2形成異源二聚體，通過抑制后者的活性，促進凋亡發(fā)生。一般認為Bcl-2/Bax比值越低，細胞越易發(fā)生凋亡［16-17］。

研究表明，MPP+可特異性的與線粒體呼吸鏈復合物I(MC-I)結合并抑制其活性，從而抑制ATP的合成，并導致線粒體受損，從而產(chǎn)生大量自由基，最終誘導細胞凋亡的產(chǎn)生［18-19］。目前，以MPP+誘導的細胞線粒體凋亡模型是研究藥物對神經(jīng)元凋亡保護作用的常用模型之一。

本研究參照程月發(fā)等人［20］的報道，采用MPP+誘導SH-SY5Y，發(fā)現(xiàn)1 mmol/L MPP+作用SHSY5Y細胞48 h后，能顯著誘導細胞凋亡的發(fā)生，凋亡率達(38.6±1.8)%，而HSYA預處理能有效抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞調(diào)亡。文獻報道，紅花黃色素具有很強的抗自由基、抑制脂質(zhì)過氧化作用［5-6］。大量文獻顯示，紅花黃色素能顯著降低氧化損傷腦組織的丙二醛含量和提高超氧化物歧化酶活性［7-8］。本實驗結果顯示，HSYA預處理能有效抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞內(nèi)活性氧的增加，我們認為這正是其抗氧化作用的結果。線粒體與Caspase蛋白酶家族被認為是凋亡過程中的兩個重要的調(diào)控點。線粒體膜電位的崩解導致Cyt-C向胞質(zhì)釋放，并進一步激活Caspase蛋白酶是細胞凋亡中的核心事件［13］。本實驗結果顯示，HSYA能有效抑制MPP+誘導的細胞線粒體膜電位的降低、抑制Cyt-C向胞質(zhì)釋放和抑制Caspase-3和Caspase-9的高表達，可見，HSYA通過抑制線粒體膜電位的降低甚至崩解，減少了Cyt-C向胞質(zhì)的釋放從而抑制Caspase蛋白酶活化。同時，我們的結果顯示，120μmol/L HSYA預處理能顯著性增加Bcl-2/Bax比值，該結果和逯素梅等人的報道一致。而我們知道Bcl-2可通過作用于細胞色素C抑制Caspase蛋白酶活化［16］，因此我們不妨認為HSYA可能通過維持線粒體膜電位和增加Bcl-2的表達抑制Cyt-C向胞質(zhì)的釋放并最終抑制Caspase凋亡級聯(lián)反應的發(fā)生。

總之，HSYA預處理能明顯提高MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷的細胞存活率，可有效抑制細胞調(diào)亡的發(fā)生，其機制可能與抑制細胞線粒體凋亡途徑有關。

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(編輯 卓選鵬)

Protective effects of hydroxysafflor yellow A against MPP+-induced apoptosis in SH-SY5Y cells

PAN Jian1，LI Shao-ping1，LI Jian-xiong2，LIAN Fo-yan3，HUANG Yan4，QIN Long4
(1.Emergency Center，2.Department of Neurology，3.Intensive Care Unit of Internal Medicine，4.Department of Pharmacy，Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou 730030，China)

ObjectiveTo investigate the neuroprotective effect of hydroxysafflor yellow A(HSYA)on MPP+-induced apoptosis in SH-SY5Y cells and its related mechanisms.MethodsCell viability was analyzed using MTT assay.Cell apoptosis was measured by flow cytometry.The level of reactive oxygen species(ROS)within the cells was analyzed by fluorometric probe DCFH-DA assay and mitochondrial transmembrane potential was revealed by rhodamine123 staining.The expressions of cytosolic Cyt-C，Bcl-2，Bax，Caspase-3 and Caspase-9 were analyzed by Western blot.ResultsThe cell viability was significantly decreased by 1 mmol/L MPP+，and the percentage of apoptosis increased to(38.6±1.8)%，but was reversed by HSYA pretreatment of different concentrations(15，60 and 120μmol/L)(P＜0.001，P＜0.01，respectively).Pretreatment of HSYA reversed the increase of ROS，cytosolic Cyt-C，Caspase-3 and Caspase-9(P＜0.001，P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05，respectively)，decrease of mitochondrial transmembrane potential and Bcl-2/Bax ratio induced by MPP+in SH-SY5Y cells(P＜0.01，P＜0.01，respectively).ConclusionHSYA pretreatment can increase cell viability to prevent MPP+-induced cell apoptosis.The mechanism may be correlated to the inhibition of mitochondrial apoptotic pathway.

hydroxysafflor yellow A；SH-SY5Y；apoptosis；mitochondrion

R285

A

1671-8259(2014)05-0690-05

10.7652/jdyxb201405025

2013-11-08

2014-01-25

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金項目(No.LZUJBKY-2013-216) Supported by the Fundamental Research Funds for the Central Universities(No.LZUJBKY-2013-216)

秦龍，碩士.E-mail：lzviolin@163.com

潘劍(1958-)，男(漢族)，副主任醫(yī)師.研究方向：神經(jīng)損傷與藥物防治.E-mail：ldeypj@163.com

時間：2014-05-16 15∶47 網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140525.1243.001.html