沈頌東

(蘇州大學(xué) 醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院 細(xì)胞生物學(xué)系,江蘇 蘇州 215123)

條斑紫菜(Porphyra yezoensis Ueda)隸屬于紅藻門(Rhodophyphyta),原紅藻綱(Protoflorideophyceae),紅毛菜目(Bangiales),紅毛菜科(Bangiaceae),紫菜屬(Porphyra)。紫菜屬的種類分布廣泛,目前已報(bào)道的種類約有 130多種[1]。我國(guó)記錄定名的紫菜物種或變種有22種[2]。條斑紫菜為北太平洋西部特有的種類,主要分布于我國(guó)黃、渤海和東海北部沿岸,以及日本列島和朝鮮半島沿岸,是中、日、韓三國(guó)共同栽培的種類。紫菜是重要的經(jīng)濟(jì)海藻,目前全世界其栽培年產(chǎn)值為 20億美元,約占整個(gè)海藻產(chǎn)業(yè)的2/3。我國(guó)是紫菜栽培生產(chǎn)的重要國(guó)家,2010年度的栽培量按國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算達(dá)200億枚(每枚為3g),其中江蘇省生產(chǎn)出來(lái)的條斑紫菜就達(dá)到 32億枚。世界各國(guó)的學(xué)者對(duì)紫菜的生物學(xué)進(jìn)行了較多的研究,現(xiàn)綜述如下。

1 條斑紫菜生活史

條斑紫菜(P.yezoensis)具有異形的世代交替,即宏觀可見(jiàn)的葉狀孢子體世代和微觀的絲狀孢子體世代交替出現(xiàn)完成其復(fù)雜的生活史轉(zhuǎn)變過(guò)程。從僅有幾百個(gè)細(xì)胞所組成的幼小葉狀體開(kāi)始,由頂端細(xì)胞不斷轉(zhuǎn)化為單孢子囊,形成、放散單孢子。單孢子為單倍體,所萌發(fā)生成的葉狀體仍為單倍體。條斑紫菜雌雄同株,精子囊器淡黃色,呈條紋狀混夾在深紅色的果孢子囊中,整個(gè)生殖器官在葉的末梢端形成明顯的深紫和淡黃色相間的條斑狀。其中精子囊器有 128個(gè)或 64個(gè)精子囊,為♂A4B4C8,也有♂A2B4C8,果孢子囊為 16個(gè)果孢子,分裂式為♀A2B2C4。絲狀體為二倍體階段,成熟發(fā)生的殼孢子仍為二倍體,殼孢子萌發(fā)時(shí)經(jīng)減數(shù)分裂形成葉狀體,染色體數(shù)目n=3(圖1)[2]。

圖1 條斑紫菜的生活史

2 紫菜的分子生物學(xué)研究

對(duì)紫菜屬物種開(kāi)展分子生物學(xué)研究早在1993年就已經(jīng)開(kāi)始了[3]。主要包括對(duì)DNA多態(tài)性進(jìn)行的分子標(biāo)記研究;對(duì)特定的功能進(jìn)行的基因組學(xué)研究和功能基因組學(xué)研究。主要目的是測(cè)定基因序列以鑒定物種,確定物種之間的親緣關(guān)系,關(guān)注這些研究的主要是遺傳學(xué)和分類學(xué)研究者。Stiller等[3]對(duì)太平洋東北部一個(gè)新種P.rediviva的核糖體小亞基rRNA基因序列(small subunit rDNA,SSU rDNA)以及位于核糖體大小亞基 B/E-基因序列之間的間隔序列(internal transcribed spacer,ITS)進(jìn)行 RFLP研究,并與其他幾種紫菜進(jìn)行比較分析后認(rèn)為該新種與北大西洋的另一種紫菜P.purpurea有很近的親緣關(guān)系。

通過(guò)國(guó)內(nèi)外對(duì)紫菜屬海藻分子標(biāo)記技術(shù)研究獲得的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)在紫菜屬中具有豐富的遺傳多樣性,可以在今后的物種選育中作為很好的良種來(lái)源開(kāi)展遺傳育種工作。這些遺傳多樣性不一定表現(xiàn)于形態(tài)的多樣性,不同種紫菜間具有很接近的外部形態(tài)往往是由于平行演化造成的非同源性相似,這對(duì)紫菜的系統(tǒng)分類乃至種系發(fā)生研究都頗具迷惑性。Niwa等[4]同時(shí)運(yùn)用形態(tài)分類方法和 RFLP技術(shù)對(duì) 1種可能屬于甘紫菜但尚未確定的野生個(gè)體進(jìn)行鑒定分類,兩種結(jié)果表明該野生個(gè)體屬于甘紫菜,基于SSU rDNA和ITS序列的PCR-RFLP分析結(jié)果還表明與條斑紫菜相比具有較遠(yuǎn)的遺傳距離。Niwa的研究表明紫菜系統(tǒng)分類僅依靠外部形態(tài)特征是不夠的,而將形態(tài)與DNA分析兩種手段相結(jié)合則可以較好的解決以上問(wèn)題。He等[5]運(yùn)用AFLP(amplified fragment length polymorphism)技術(shù)對(duì)來(lái)自同一個(gè)絲狀體的兩種葉片,由殼孢子萌發(fā)出來(lái)的40株和單孢子形成的88株,進(jìn)行了電泳條帶的比較,發(fā)現(xiàn)同一個(gè)來(lái)源的后代遺傳相似度不高,說(shuō)明它們之間發(fā)生了雜交,單孢子苗的多態(tài)性位點(diǎn)的比例高達(dá) 98.6%,超過(guò)殼孢子苗的 80.7%;而平均遺傳相似度單孢子苗為 0.61,低于殼孢子苗的0.71。

通過(guò)測(cè)定核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)中核苷酸序列組成來(lái)比較同源分子之間相關(guān)性的方法稱為核酸序列分析方法。分子系統(tǒng)學(xué)研究中常使用的基因組有三種: 葉綠體基因組、線粒體基因組、核基因組。Shivji[6]在20世紀(jì) 90 年代初構(gòu)建了條斑紫菜葉綠體基因組圖譜并對(duì)其結(jié)構(gòu)作了報(bào)道,Reith[7]構(gòu)建了P.purpurea的葉綠體基因組圖譜,發(fā)現(xiàn)有 46%的基因?yàn)殛懮参锼痪邆?。但由于技術(shù)要求以及耗費(fèi)較大,目前測(cè)序主要集中在rbcL、ITS等一些小片段。近年來(lái),隨著DNA 測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展和日益普及,DNA 測(cè)序在遺傳多樣性的研究中正在起著越來(lái)越大的作用。Yang 等[8]運(yùn)用最新的 Solexa測(cè)序技術(shù)對(duì)條斑紫菜的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了大規(guī)模的測(cè)序,獲得了大量的新基因;牛建峰等[9]對(duì)條斑紫菜(P.yezoensis)進(jìn)行Solexa高通量測(cè)序,獲得低覆蓋度全基因組草圖。該基因組草圖大小約 220 Mbp,GC質(zhì)量分?jǐn)?shù) 53.08%;包含26 629 個(gè)預(yù)測(cè)基因,其中16 409個(gè)基因具有內(nèi)含子,平均每個(gè)基因含 2.22 個(gè)內(nèi)含子;基因結(jié)構(gòu)分析表明具有內(nèi)含子的基因平均長(zhǎng)度為 2 214 bp,內(nèi)含子平均大小 319 bp;代謝通路分析表明嘌呤代謝是含有蛋白數(shù)量最多的代謝途徑。這些工作為以后開(kāi)展功能基因的研究提供了豐富的研究素材。

2011年Shen等[10]利用基因抑制消減雜交(SSH)技術(shù)對(duì)條斑紫菜配子體和孢子體基因表達(dá)譜差異進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,選擇果孢子替代絲狀殼孢子作為配子體的材料,并從相同的葉狀體上培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞(配子體)和果孢子(孢子體)細(xì)胞,這樣能將樣品間的差異減少到最低。測(cè)序后得到相應(yīng)克隆的EST(Expressed sequence tag)序列,共有 360個(gè)序列已全部提交 NCBI。果孢子的 181個(gè) EST序列號(hào)為HS572581- HS572762,營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的179個(gè)EST序列號(hào)為HS572763- HS572942。將EST進(jìn)行BLAST分析顯示,共有196條基因,其中果孢子細(xì)胞有92條,營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞有104條。GO注釋顯示孢子體基因主要定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核(58%);而配子體基因主要定位在質(zhì)體、高爾基體、核糖體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞主要的生物學(xué)功能與 DNA復(fù)制/修復(fù)、碳水化合物代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)錄,特別是對(duì)熱激和對(duì)氧化性的應(yīng)激方面;孢子體世代同樣表達(dá)這些代謝過(guò)程,尤其在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA和蛋白質(zhì)修飾和蛋白質(zhì)和核苷酸代謝方面。根據(jù) GO注釋的結(jié)果發(fā)現(xiàn)孢子體世代傾向于生長(zhǎng)和自我保護(hù);而孢子體世代在發(fā)育上更積極。

He等[11]對(duì)條斑紫菜孢子體和配子體的 MicroRNAs進(jìn)行了比較分析,測(cè)序得到的14個(gè)miRNAs中只有一個(gè)在兩個(gè)世代中同時(shí)出現(xiàn),幾個(gè)新的miRNAs和其他生物沒(méi)有同源性,說(shuō)明紫菜中可能存在復(fù)雜的小RNA形成系統(tǒng)。

對(duì)于紫菜屬的功能基因研究目前正處在蓬勃發(fā)展的階段,由于在紫菜中轉(zhuǎn)入外源基因來(lái)進(jìn)行表達(dá)存在一定的困難,王金鋒等[12]嘗試將外源基因用玻璃珠法轉(zhuǎn)入壇紫菜果孢子中,但是要將外源基因穩(wěn)定表達(dá)出來(lái)還有很長(zhǎng)的路要走。目前主要從紫菜中獲得已知功能的基因在原核生物或者酵母、衣藻等真核生物中表達(dá),以確定其功能。Wang等[13]就是從條斑紫菜中獲得海藻糖 6磷酸合成酶基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中表達(dá)。Wu等[14]測(cè)定了條斑紫菜不同生活周期中的 7個(gè)管家基因的表達(dá)水平,通過(guò)檢測(cè)這些基因的絕對(duì)表達(dá)量,發(fā)現(xiàn) GAPDH的表達(dá)量最為穩(wěn)定適合作為檢測(cè)基因表達(dá)量的內(nèi)參基因。張寶玉等[15]克隆了條斑紫菜alternative oxidase (AOX)的全長(zhǎng)基因,共1650 bp,ORF為1332 bp,編碼443個(gè)氨基酸。通過(guò) qPCR檢測(cè)了該基因在生活史個(gè)階段的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)絲狀體階段的AOX表達(dá)量顯著高于葉狀體階段。

功能基因的研究急待加強(qiáng)

核糖體 RNA基因(rDNA)存在于所有的生物中,由一些高度重復(fù)序列組成、并有轉(zhuǎn)錄活性的多基因家族,它在真核細(xì)胞中有幾十甚至數(shù)千個(gè)拷貝,在植物總DNA中約占10%。rRNA基因在真核生物中是高度保守的,它以18S rDNA(small subunit,SSU)、5.8S rDNA和28S rDNA(large subunit,LSU)順序串聯(lián),組成一個(gè)基因簇,彼此被內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)序列分開(kāi),而轉(zhuǎn)錄單元之間被基因間間隔區(qū)(intergenic spacer,IGS)序列間隔區(qū)分開(kāi)。真核生物rDNA基因簇結(jié)構(gòu)如模式圖所示(圖2)。在每個(gè)重復(fù)片段中,兩個(gè)內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) ITS1和ITS2將18S、5.8S和28S分隔開(kāi)。18S rDNA上游含有一個(gè)外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ETS),在ITS和ETS中含有 rDNA前體加工信息,相鄰的重復(fù)片段之間為非編碼區(qū) IGS隔開(kāi), IGS中有促轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子,在轉(zhuǎn)錄時(shí)有啟動(dòng)和識(shí)別的作用[16]。

圖2 植物18S～28SrDNA的基本結(jié)構(gòu)示意圖

rRNA的生物學(xué)功能在不同的物種中保持一致,成為分子進(jìn)化的忠實(shí)尺度,消除了趨同進(jìn)化和趨異進(jìn)化所引起的系統(tǒng)誤差。在進(jìn)化速率上,編碼區(qū)比較保守,可在種、屬、科、目、水平上用于不同生物種的比較。18S rDNA和28S rDNA基因的3′端是高度保守的,即使在原核與真核生物之間也能建立位點(diǎn)同源性。其中,18S比28S基因更保守,5.8S基因僅有160個(gè)左右的堿基,最為保守。18S rDNA和28S rDNA基因是系統(tǒng)發(fā)育中種及種以上階元的良好標(biāo)記。rDNA序列由于在不同生物之間既有高度的保守性,又存在一定的序列變異性,已經(jīng)成為生物分子鑒定和定量檢測(cè)中最常用的分子指標(biāo)[17-18]。

18S rDNA是唯一具有信息分子和功能分子兩種作用的編碼核糖體的基因,為高度重復(fù)序列,約800～10000拷貝,在細(xì)胞內(nèi)連續(xù)排列。同時(shí)18S rDNA基因序列結(jié)構(gòu)、功能十分保守,若它們的序列存在變異就能成為一種穩(wěn)定的DNA標(biāo)記,用于鑒別物種。由于18S rDNA區(qū)高度保守,主要適合科及以上階元,而18S rDNA的全序列相對(duì)較小,更適合PCR擴(kuò)增和測(cè)序,因此已被廣泛的應(yīng)用于藻類的分子系統(tǒng)學(xué)研究[19-20],解決了許多疑難海洋藻類的分類鑒定問(wèn)題。

由于核糖體大亞基基因 28S rDNA具有高度可變區(qū)序列,能為設(shè)計(jì) PCR引物或探針提供特異性強(qiáng)的序列,因此被用于區(qū)別分類物種之間的親緣關(guān)系如屬、種或地理株系等問(wèn)題。在藻類中28S rDNA編碼區(qū)的序列比較分析已多用于分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)生等方面的研究[21-22]。但目前國(guó)內(nèi)利用核糖體大亞基來(lái)探討紫菜屬的系統(tǒng)發(fā)育的研究則未見(jiàn)報(bào)道。

Broom等[23]對(duì)分布于新西蘭沿岸的49個(gè)紫菜核糖體的18S rRNA基因序列進(jìn)行測(cè)序分析,結(jié)果表明,該區(qū)域的紫菜屬植物存在較大的遺傳變異和較遠(yuǎn)的種間遺傳距離,這與它們的外部形態(tài)特征并不吻合,這很有可能是長(zhǎng)期的生殖隔離所致。Kunimoto等[24]對(duì) 9種紫菜的 18S rDNA全序列進(jìn)行了測(cè)序分析,SSU rDNA外顯子序列在同種紫菜種內(nèi)保持一致,體現(xiàn)出很高的保守性,而內(nèi)含子序列在種內(nèi)存在差異,并根據(jù)內(nèi)含子的插入與缺失,將它們的rRNA基因結(jié)構(gòu)分為 4種類型,結(jié)果表明不同地理居群的同種紫菜其18S 基因結(jié)構(gòu)存在差異。

核糖體 DNA(rDNA)的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)和基因內(nèi)間隔區(qū)(IGS)進(jìn)化速度快,序列變異豐富,能夠提供比較豐富的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)。IGS是rDNA中進(jìn)化速度最快的區(qū)域,在已經(jīng)研究的IGS 序列中,發(fā)現(xiàn) IGS 序列比 ITS序列存在著更多層次的差異,不僅在種間、種內(nèi)居群間存在著差異性,甚至不同個(gè)體之間也存在著差異性[25]。在分子系統(tǒng)學(xué)研究中常以ITS或IGS序列作為構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的基礎(chǔ)。

Mizukami等[26]對(duì)野生種和栽培種條斑紫菜的ITS序列分析結(jié)果表明,野生種和栽培種ITS序列之間存在差異,并且野生種的不同個(gè)體間其 ITS序列也存在一定的差異。Niwa[27]對(duì)7種栽培品系條斑紫菜的 ITS1 rDNA序列進(jìn)行了測(cè)序分析,結(jié)果表明,這7個(gè)品系的ITS1序列不存在差異性,因而不適合作為這7個(gè)品系的分類鑒定標(biāo)記。

Kunimoto等[28]對(duì)甘紫菜的SSU rDNA和ITS測(cè)序結(jié)果表明,SSU rDNA外顯子序列在甘紫菜種內(nèi)保持一致,體現(xiàn)出很高的保守性,而內(nèi)含子序列在種內(nèi)存在差異,所以內(nèi)含子以及ITS1序列可作為遺傳標(biāo)記進(jìn)行種內(nèi)遺傳差異的鑒定,從而建立不同的甘紫菜品系。

在親緣關(guān)系較近的物種分類鑒定研究中,當(dāng)ITS序列存在爭(zhēng)議時(shí),IGS序列可以提供更有力的支持。對(duì)栽培稻種內(nèi)ITS序列研究表明,利用ITS序列能將典型秈粳亞種分開(kāi),但親緣關(guān)系較近的品種其 ITS序列完全相同。戴小軍等[18]對(duì)栽培稻種內(nèi)IGS序列研究表明,親緣關(guān)系較近的品種其 ITS序列完全相同,由于 IGS序列比 ITS序列的信息位點(diǎn)多,基于IGS序列能將亞種內(nèi),特別是親緣關(guān)系較近的品種區(qū)分開(kāi)。因此 IGS序列更適于亞種內(nèi)不同品種間遺傳關(guān)系的分析。

本實(shí)驗(yàn)室2009年最早在藻類中克隆出了IGS的部分堿基序列,長(zhǎng)度達(dá)到 1100 bp,在浙江寧波、福建莆田和廣東汕頭栽培的壇紫菜中發(fā)現(xiàn)25個(gè)堿基的變異,能夠區(qū)分這些同一個(gè)物種不同地理群之間的品種差異。相關(guān)結(jié)果發(fā)表在 Journal of Applied Phycology上[29]。目前本實(shí)驗(yàn)室又對(duì)條斑紫菜的28S rRNA全序列進(jìn)行了克隆,并獲得了部分IGS堿基序列。2011年年底,Sutherland等[30]15位國(guó)際著名的藻類學(xué)家在美國(guó)的《Journal of Phycology》上發(fā)表了一篇文章,以18S rDNA序列和rbcL序列構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù),按照單系起源的原則,將廣義的紫菜屬分成了15個(gè)屬,其中葉狀體的 8個(gè)屬包括 Porphyra,Pyropia,Wildemania和5個(gè)新屬。產(chǎn)自中國(guó)沿海的22個(gè)物種都屬于 Pyropia屬,但是由于缺乏中國(guó)的研究者參與,采集的物種沒(méi)有本地區(qū)的樣品,需要更多的中國(guó)當(dāng)?shù)氐难芯抗ぷ鱽?lái)提供證據(jù),特別需要 28S rDNA和IGS這樣更易變化的分子序列來(lái)確定紫菜物種的親緣關(guān)系。

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