張玉穎，張 晾

(山東省動(dòng)物抗性生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南 250014)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是引起心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，高脂血癥是引起AS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。血脂代謝異常導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成，平滑肌細(xì)胞及膠原纖維增生，血管壁增厚并失去彈性，進(jìn)而引起血管壁不同程度的慢性炎癥反應(yīng)[1-2]。通過天然食物來調(diào)節(jié)血脂以預(yù)防高脂血癥已成為當(dāng)前醫(yī)療保健研究的熱點(diǎn)。

山楂在我國(guó)具有悠久的保健和藥用歷史。近年來的臨床研究證實(shí)，山楂具有降壓作用[3]，并能通過增強(qiáng)心肌收縮力、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管、增加冠狀動(dòng)脈的血流量和降低心肌耗氧量等起到強(qiáng)心和預(yù)防心絞痛的作用[4]。然而，對(duì)于山楂能夠有效防治AS的機(jī)制目前尚不清楚。

研究已證實(shí)，AS與血脂水平尤其是與膽固醇和甘油三酯(triglycerides, TG)密切相關(guān)。高脂血癥人群和高脂飲食大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，山楂能夠降低血清總膽固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)和TG的含量[5-6]。采用兔或豚鼠高脂飲食建立AS動(dòng)物模型也證實(shí)了山楂能夠降低血清中的膽固醇[7-8]。但利用自發(fā)性高血脂癥的基因敲除小鼠來評(píng)價(jià)山楂對(duì)脂代謝影響尚未見報(bào)道。本研究使用低密度脂蛋白受體缺失(low density lipoprotein receptor-deficient, LDLR-/-)小鼠作為高血脂動(dòng)物模型，探討山楂對(duì)脂代謝的影響，為臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物L(fēng)DLR-/-小鼠(C57BL/6J遺傳背景)購(gòu)于美國(guó)JACKSON 實(shí)驗(yàn)室，于山東師范大學(xué)生命科學(xué)院SPF級(jí)鼠房飼養(yǎng)、繁殖。飼養(yǎng)條件為(22±1)℃，40%～60%相對(duì)濕度，12 h明暗循環(huán)照明。小鼠出生后第22天停止哺乳，喂以普通飼料(含4%脂肪和0.07%膽固醇等)，自由攝取水、食。選取20只4周齡雄性LDLR-/-小鼠，隨機(jī)分為兩組(10只/組)，即正常飲食對(duì)照組和山楂干預(yù)實(shí)驗(yàn)組(普通飼料中添加1%的山楂凍干粉)。干預(yù)20周后，眼眶取血，解剖分離肝臟組織，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑Trizol試劑、Superscript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶和Olig (dT)18引物購(gòu)自美國(guó)的Invitrogen公司，DEPC購(gòu)自美國(guó)的Amresco公司，RNase Inhibitor購(gòu)自日本的TOYOBO公司，DNaseⅠ購(gòu)自日本的Takara公司，Sybergreen購(gòu)自美國(guó)的Molecular Probes公司，TC和TG檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，山楂凍干粉為本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3血脂測(cè)定和液相色譜分離脂蛋白按照試劑盒的操作步驟分別檢測(cè)血清TG和TC含量，以毫摩爾/升(mmol/L)表示。使用Superose 6柱(Amersham Pharmacia)進(jìn)行快速蛋白液相色譜分析(FPLC)，磷酸緩沖液(pH7.2)為流動(dòng)相。每組血清樣品合并后，各取100 μL上樣，0.5 mL/min流速，1 min/管收集。試劑盒檢測(cè)每管中TG、TC含量，500 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光值，根據(jù)吸光值繪制曲線圖。

1.4肝臟總脂質(zhì)的提取及TG、TC含量的檢測(cè)采用氯仿/甲醇混合液提取肝臟總脂質(zhì)，利用酶法測(cè)定肝臟TG、TC含量。取100 mg肝臟組織于離心管中，加入氯仿︰甲醇(2︰1，V/V)混合液，冰浴充分勻漿，5 000 r/min離心10 min，取上清后加入0.2倍體積NaCl (145 mmol/L)，充分混勻后8 000 r/min離心5 min。取下層氯仿相，真空揮干氯仿后稱重，計(jì)算肝臟中總脂質(zhì)含量(mg/g)。加入10 μL氯仿和990 μL異丙醇︰Triton X 100(9︰1，V/V)溶解總脂質(zhì)，充分混勻后按照試劑盒操作步驟檢測(cè)TG、TC含量。

1.5Real-timePCR分析Trizol法抽提肝臟總RNA，DNaseⅠ處理后紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度，凝膠電泳確定RNA的質(zhì)量。取1 μg總RNA，以O(shè)ligo(dT)18為引物，Superscript Ⅱ?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。參照GenBank中基因mRNA的序列設(shè)計(jì)引物(表1)。使用Rotor-Gene 3 000(Corbett Research, Australia)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，Sybergreen法檢測(cè)目的基因的擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)β-actin為內(nèi)參。所有反應(yīng)均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

表1Real-timePCR分析所用引物

Tab.1 Primers used for real-time PCR analysis

基 因正向引物反向引物FAS5'-GCGGGTCTATGCCACGATT-3'5'-TGTTACACCTTGCTCCTTGCTG-3'HMG-CoAR5'-CGAGCCACGACCTAATGAAGA-3'5'-GCTCCCATCACCAAGGAATAAT-3'PPARα5'-CTTTACATCAGTGTTTCCGTCAG-3'5'-TCAAATTGCCACCGTTCTT-3'SREBP-1c5'-TGGCTTGGTGATGCTATGTT-3'5'-TAAGGGGTTGGGAGTAGAGG-3'β-actin5'-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3'5'-GTACTCCTGCTTGCTGATCC-3'

2 結(jié) 果

2.1飲食干預(yù)后小鼠體質(zhì)量的變化飲食干預(yù)20周，每周稱體質(zhì)量1次，結(jié)果顯示山楂干預(yù)組和正常對(duì)照組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1)。

圖1不同飲食干預(yù)小鼠體質(zhì)量的增長(zhǎng)曲線

Fig.1 Changes of body weight in each group(n=10)

2.2飲食干預(yù)后小鼠血清TC、TG含量的變化酶法檢測(cè)山楂干預(yù)組和正常對(duì)照組小鼠血清中TC、TG含量，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，山楂干預(yù)組小鼠血清中的TC、TG含量顯著性降低(P<0.05，表2)。

表2山楂干預(yù)組和對(duì)照組小鼠血清中TC、TG含量的比較

與對(duì)照組小鼠比較，*P<0.05。

2.3飲食干預(yù)后小鼠血脂譜的變化FPLC法分離脂蛋白，分別測(cè)定其TC(圖2A)和TG含量(圖2B)。分離管6～13收集液為VLDL，第14～30管收集液為L(zhǎng)DL/IDL混合液，第31～45管收集液為HDL。結(jié)果顯示，山楂干預(yù)組小鼠與正常對(duì)照組相比，VLDL和IDL/LDL峰值明顯下降，VLDL-TC/TG和IDL/LDL-TC/TG含量均顯著降低。然而，山楂干預(yù)組和對(duì)照組小鼠的HDL無明顯差別。

圖2山楂干預(yù)組和對(duì)照組LDLR-/-小鼠脂蛋白TC和TG的變化

Fig.2 Changes of serum lipoprotein TC and TG in LDLR-/-mice of hawthorn group and control group

2.4小鼠肝臟總脂質(zhì)及TC、TG含量的比較用氯仿︰甲醇(2︰1，V/V)混合液抽提肝臟總脂質(zhì)，試劑盒檢測(cè)肝臟總脂質(zhì)中TC、TG的含量。統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，山楂干預(yù)組小鼠肝臟總脂質(zhì)、TC和TG含量與正常對(duì)照組相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

2.5脂代謝相關(guān)基因mRNA的表達(dá)為闡明山楂干預(yù)對(duì)LDLR-/-小鼠脂代謝的影響，Real-time PCR法檢測(cè)脂代謝相關(guān)基因mRNA水平的表達(dá)情況(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山楂干預(yù)組的脂肪酸合成酶(FAS)mRNA表達(dá)水平比對(duì)照組降低了30.8%(P<0.05)(圖3A)，其上游調(diào)控基因SREBP-1c同樣顯著下調(diào)，降低了77.8%(P<0.05，圖3B)。山楂干預(yù)組脂肪酸氧化相關(guān)調(diào)控基因PPARα的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，與對(duì)照組相比升高44.2%(P<0.05，圖3C)。山楂干預(yù)組與正常飲食對(duì)照組相比，膽固醇合成限速酶HMG-CoAR的mRNA表達(dá)水平下降55.9%(P<0.05，圖3D)。

表3山楂干預(yù)組和對(duì)照組小鼠肝臟總脂質(zhì)、TC和TG含量的比較

與對(duì)照組小鼠比較，*P<0.05,**P<0.01。

圖3山楂干預(yù)組和對(duì)照組小鼠脂代謝相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

Fig.3 The mRNA expression of genes related to lipid metabolism in hawthorn group and control group (n=10)

A：FAS mRNA表達(dá)水平；B：SREBP-1c mRNA表達(dá)水平；C：PPARα mRNA表達(dá)水平；D：HMG-CoAR mRNA表達(dá)水平。與對(duì)照組小鼠比較，*P<0.05。

3 討 論

天然植物提取物預(yù)防或治療疾病在臨床上已被廣泛應(yīng)用[9]。本研究通過山楂飲食干預(yù)LDLR-/-小鼠，結(jié)果顯示飲食后顯著降低血脂TC、TG水平和肝臟脂質(zhì)水平。

研究結(jié)果顯示，山楂能顯著降低小鼠血清中TC、TG水平(表2)。根據(jù)FPLC結(jié)果顯示山楂能顯著降低VLDL-TG和VLDL-TC水平，可能與抑制FAS和HMG-CoAR基因表達(dá)有關(guān)(圖3A)。HMG-CoAR和FAS表達(dá)降低抑制了肝臟膽固醇和脂肪酸的合成，降低了肝臟中TC、TG含量。然而，在山楂干預(yù)組中，與脂肪酸氧化相關(guān)的調(diào)控基因PPARα表達(dá)升高(圖3C)，山楂可能會(huì)促進(jìn)肝臟脂肪酸的氧化分解，這與其他文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。有研究報(bào)道，以兔為動(dòng)物模型同樣發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組血清中的TC和TG水平顯著低于對(duì)照組，而血清中HDL-C水平無明顯差異[7]，F(xiàn)PLC結(jié)果也證實(shí)了山楂飲食不影響血清中的HDL-TC和HDL-TG含量(圖2)。

綜上所述，山楂可以調(diào)節(jié)LDLR-/-小鼠脂代謝，降低肝臟脂質(zhì)及血脂水平，對(duì)脂代謝引起的相關(guān)疾病有一定預(yù)防和保護(hù)作用，也為研究山楂的藥用價(jià)值提供了理論基礎(chǔ)。

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