劉永惠，常 靖,，薛陸軍，郭少賢,3，王 瑞，孫 燁，夏欣欣，李恩孝

(1. 西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，陜西西安 710061； 2. 西安市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，陜西西安 710001；3.中國人民解放軍第266醫(yī)院腫瘤科，河北承德 067000)

乳腺癌是多種因素、多種機制共同作用的結果，某些癌基因、細胞因子等對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移及預后影響十分顯著。癌基因血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是目前公認的與腫瘤發(fā)生密切相關的因子，其對維持基因穩(wěn)定性和對細胞生長有著重要調節(jié)作用。現(xiàn)代中醫(yī)研究發(fā)現(xiàn),血瘀證是惡性腫瘤的一種常見類型，血瘀是導致癌癥轉移、復發(fā)的重要病理基礎[1]。近幾年來，多項研究發(fā)現(xiàn)，活血化瘀藥物對惡性腫瘤轉移有明顯抑制作用[2]。我們應用活血化瘀藥試圖通過調節(jié)VEGF的表達和活性，抑制腫瘤細胞的過度增殖。本實驗選取活血化瘀藥物麝香的活性物質麝香酮(musk ketone)，檢測麝香酮對血瘀證裸鼠皮下移植瘤的VEGF表達是否存在影響，以探討麝香酮在抗癌方面的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1動物、細胞系、主要試劑及儀器5周齡雌性裸小鼠60只，體重(20±1)g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司(許可證號碼：SCXK(滬)2007-0005)。飼料提供來自西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。實驗和飼養(yǎng)于西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心動物實驗室SPF環(huán)境下進行。乳腺癌細胞株MDA-MB-231s購自北京康為世紀生物科技有限公司。麝香酮標準品購自德國Dr(批號：90527CY)，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，VEGF一抗、VEGF一抗試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司，VEGF二抗、VEGF二抗試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，鹽酸腎上腺素(1 mL∶1 mg)購自上海禾豐制藥有限公司(批號：H31021062)。普通光學顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2細胞培養(yǎng)人乳腺癌細胞系MDA-MB-231s按常規(guī)進行傳代培養(yǎng)，在含100 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)基中50 mL/L CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，待細胞長至瓶底80%～90%，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，3～5 d傳代1次。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3血瘀動物模型的建立將40只雌性裸鼠隨機分為血瘀組(n=30)和空白組(n=10)?？瞻捉M連7 d皮下注射0.2 mL生理鹽水；血瘀組連續(xù)7 d皮下注射0.01%腎上腺素0.2 mL[3]。

1.4測定指標與方法本實驗采用眼球取血法，分別從血瘀組(n=10)和空白組(n=10)中留取血液樣本。取血后及時用肝素抗凝(20 IU/mL血液)，并由西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科測定在切變率為1 S-1、10 S-1、50 S-1、200 S-1的全血黏度。

1.5接種與給藥將0.2 mL(1×107個)人乳腺癌細胞MDA-MB-231s細胞懸液注入于血瘀組中剩余的20只裸鼠背部的外上方皮下，并隨機分為血瘀荷瘤組(n=10)和麝香酮組(n=10)兩組。隨后對麝香酮組給予2 mg/(kg·d)麝香酮灌胃處理，血瘀荷瘤組給予生理鹽水灌胃作為對照，連續(xù)灌胃處理14 d。

1.6HE染色法組織切片后進行HE染色。實驗具體步驟：腫瘤組織石蠟切片厚度為5 μm，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ依次脫蠟，乙醇梯度水化；蘇木素染色，淡氨水(10 mL/L)分化，伊紅染色；乙醇梯度脫水；二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明，中性樹膠封片。

1.7免疫組化法檢測VEGF表達按常規(guī)處理待檢測的石蠟或冰凍組織切片或細胞爬片等樣本，依次在試劑1、試劑2、試劑3、試劑4中室溫孵育，PBS充分漂洗，完成后滴加顯色工作液顯色，最后復染，脫水透明，封片。

VEGF陽性細胞數(shù)計數(shù)：光學顯微鏡下，細胞質為棕黃色顆粒的細胞定為陽性染色細胞。參照文獻[4]計數(shù)方法，在高倍鏡(×400)視野下對每張切片隨機選取4個視野，讀取陽性細胞數(shù)，計算其平均值。

免疫組織化學評分標準：陽性細胞分為0～3四個級：無棕黃色顆粒為0，1%～10%定為1，11%～50%為2，51%以上定為3；染色強度分0～3級，陰性定為0，弱陽性定為1，中度陽性定為2，強陽性定為3。這2項數(shù)值之和即為該片的免疫組化評分。

2 結 果

2.1兩組裸鼠血液流變學的比較對裸鼠進行了血液流變學的檢測，結果表明，空白組與血瘀組比較，4個切變率下的血流變結果差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。提示兩組本實驗血瘀動物模型造模成功，可以進行下一步實驗。

表1兩組裸鼠血液流變學結果的比較

檢測指標空白組(mPa.s)血瘀組(mPa.s)1S-129.47±7.2846.02±10.94#5S-19.66±2.7114.54±3.08#30S-14.21±1.506.11±3.46#200S-12.09±1.343.97±1.67#

與空白組比較，#P<0.05。

2.2大體形態(tài)學觀察、裸鼠體重及瘤體的變化從造模開始，裸鼠生長狀態(tài)良好，飲食、飲水、排便正常，未有拒食，對外刺激反應正常。種植瘤體后接種5 d后可見背部米粒大小腫塊形成，7 d后瘤達100 mm3左右，成瘤率100%。瘤體生長于裸鼠外側背部皮下，色蒼白、質硬、活動性較差、表面光滑，裸鼠體重稍有降低，估計與腫瘤負荷大、消耗增加有關；解剖全部裸鼠未見明顯胸腔及腹腔臟轉移灶。實驗中不同時間點對全部入組裸鼠進行了體重測量。腫瘤體積(mm3)=1/2×腫瘤最長徑×(腫瘤最短徑)2。造模裸鼠腫瘤體積見表2。比較血瘀荷瘤組與麝香酮兩組，結果差別具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示麝香酮可抑制瘤體生長。

表2兩組裸鼠體質量及瘤體體積的比較

用藥后天數(shù)(d)血瘀荷瘤組(mg)麝香酮組(mg)血瘀荷瘤組(mm3)麝香酮組(mm3)021.04±1.9820.67±2.110.059±0.0110.061±0.010320.65±2.3220.50±1.670.143±0.0160.084±0.011619.92±1.7620.32±1.52*0.496±0.0920.179±0.013△918.37±1.7320.11±1.92*0.735±0.1060.233±0.112△1217.52±0.9320.09±0.98*1.261±0.1020.498±0.072△1516.734±1.9820.12±1.87*1.261±0.1020.689±0.69△

與血瘀荷瘤組比較，*P<0.05，△P<0.05。

2.3兩組抑瘤率的比較計算抑瘤率：抑瘤率(%)=[模型組瘤重-實驗組瘤重]/模型組瘤重×100%。對造模裸鼠抑瘤率進行換算，比較以下兩組抑瘤率。結果顯示，血瘀加瘤組和麝香酮組用藥14 d后的瘤重分別為：(1.452 2±0.363 9)g、(0.868 7±0.144 7)g，抑瘤率分別為-%和40.18%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4免疫組織化學VEGF表達及分析免疫組化結果顯示，在血瘀荷瘤組中，VEGF在瘤體中呈高表達，而在麝香酮組中，瘤體中VEGF的表達顯著降低。經過統(tǒng)計分析，麝香酮組瘤體VEGF評分(2.90±0.25)顯著低于血瘀荷瘤組(5.08±0.35)，(P<0.05，圖1)。

圖1兩組裸鼠腫瘤的VEGF免疫組化染色

Fig.1 Immunohistochemical staining of VEGF in the tumor of the two groups of nude mice (×400)

A：血瘀荷瘤組；B：麝香酮組；C：兩組VEGF評分的比較。

3 討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，現(xiàn)每年全球新增乳腺癌的患者已超過100萬[5]，在我國乳腺癌已居婦女惡性腫瘤第1位[6]。目前治療乳腺癌的手術、化療存在一定的局限性且副作用較大，如果配合生物靶向治療有可能推動綜合療法向更高的層次發(fā)展[7-8]。

乳腺癌屬于中醫(yī)的“乳石癰”、“奶巖”等范疇。辨證分為肝郁痰凝證、沖任失調證、正虛毒熾證、氣血兩虧證這四種證型。但在臨床上，依據(jù)現(xiàn)代中醫(yī)理論，結合乳腺癌的特點，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤多以血瘀證特征為多見，血瘀與腫瘤轉移關系極為密切。臨床及實驗室已證實腫瘤患者的血小板功能異?；罨?；血小板聚集、黏附功能呈現(xiàn)亢進狀態(tài)[9]，即血液的濃、黏、聚、凝狀態(tài),認為這種現(xiàn)象類似于中醫(yī)所闡述的“血瘀證”。當血液處于血瘀證的高凝狀態(tài)，血液流動或減緩，或滯而不暢，甚或瘀阻。這樣游離在血管中的腫瘤細胞就有條件從血管壁的湍流區(qū)貼附于管壁，使其得以著床，繼而腫瘤細胞大量增殖再通過血液或淋巴系統(tǒng)進行散播，最終導致轉移的形成。因此，可以認為血瘀證存在于癌癥的各個階段，它是腫瘤轉移的條件和結果。這就相當于種子與土壤的關系。血液高度凝聚的血瘀狀態(tài)為大量增殖、積聚的腫瘤細胞提供良好的散播途徑。血瘀是惡性腫瘤轉移的重要病理基礎。

VEGF是刺激腫瘤血管生成最重要和作用最強的因子[10]。有研究顯示，乳腺癌轉移和預后與VEGF關系密切[11-12]。LINDERHOLM等[13-14]認為，VEGF在乳腺癌細胞中呈高表達，其表達對乳腺癌病人預后的判斷有重要意義。故可通過檢測乳腺癌組織中VEGF以間接通過觀測乳腺癌病理進程和預后。

腫瘤生長所需的營養(yǎng)物質主要依靠血液。腫瘤血管形成是腫瘤生長、轉移的基礎。 若抑制腫瘤血管生成，阻斷其賴以生存的“關卡”，就可以切斷腫瘤營養(yǎng)供給的途徑，腫瘤就會處于靜止休眠狀態(tài)[15]。所以血管已成為腫瘤治療新的靶點，這將是腫瘤治療的重要策略[16-17]。現(xiàn)在一些研究人員嘗試通過使用一些化療藥物抑制VEGF表達，以期達到抗腫瘤作用[18-19]。因此，降低VEGF的異常表達是降低乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的重要因素。

麝香作為藥物已有兩千多年的歷史，其性辛溫，氣味芳香、善走竄，性味辛溫，歸心脾二經，有醒腦開竅、活血化瘀、消腫止痛之功效。清代許克昌在《外科證治全書》中已對乳巖的治療預后有具體的闡述?，F(xiàn)代研究證明，麝香有興奮中樞系統(tǒng)，抗缺氧、強心、抗炎，抑制人體腫瘤細胞及提高免疫力等作用。藥理學研究顯示，麝香的提取成分麝香酮亦稱3-甲基環(huán)十五烷酮(C16H30O)，是麝香的重要成分部分和主要生理活性物質。我們選用活血化瘀藥物麝香的提取成分麝香酮治療腫瘤，探討麝香酮、血瘀證和乳腺癌相關因子之間聯(lián)系，為乳腺癌的治療提供新的方法。

在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，不同組中的裸鼠體質量、瘤體體積、腫塊質量與對照組的差異都有明顯差異。經麝香酮藥物的干預后，裸鼠皮毛較光滑，行動相對敏捷，飲食、排便較規(guī)律，各臟器未見明顯改變，麝香酮的抑瘤率達到40.18%，且麝香酮抑制VEGF的表達。這初步說明通過麝香酮可下調乳腺癌細胞的VEGF的表達，阻止新生血管生成。通過本次實驗，我們初步證實了麝香酮的部分抑瘤作用，它通過阻斷腫瘤所需的血管系統(tǒng)形成、降低血管通透性，消除細胞賴以生存的基礎，以發(fā)揮抑制腫瘤生長、侵襲及轉移的作用。

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