徐 珊，杜 沖，馬艷民，謝宏俊，高 楊， 石 琦，王新陽，賀大林，郭 鵬

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院：1. 第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710061； 2. 環(huán)境和疾病相關(guān)基因教育部重點實驗室, 陜西西安 710061)

HaCaT細胞是一種人永生化表皮細胞系，具有表皮基底層細胞的分化特性，與原代角質(zhì)形成細胞相同，遺傳特性穩(wěn)定，不具有腫瘤特性[1]。HaCaT細胞可代替人正常角質(zhì)形成細胞，是皮膚疾病研究中理想的細胞模型，可用于檢測各種藥物和理化因素對人正常角質(zhì)形成細胞的影響，是研究上皮性器質(zhì)病變以及基因功能的理想體外模型[2-3]。

對于上皮性器質(zhì)病變以及基因功能的研究，大多數(shù)實驗方法是進行基因治療，即細胞轉(zhuǎn)染，以達到治療疾病的目的或者得到目的基因與疾病表現(xiàn)的關(guān)系[4]。但是，HaCaT細胞是公認(rèn)的難轉(zhuǎn)染細胞，我們對已報道有關(guān)HaCaT細胞轉(zhuǎn)染的文獻進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)大多實驗研究中均使用了病毒介導(dǎo)法[5-6]。

細胞轉(zhuǎn)染方法大致分為兩種類型：病毒介導(dǎo)法和非病毒介導(dǎo)法。病毒介導(dǎo)法的優(yōu)點是具有很好的轉(zhuǎn)染效率，但是存在易發(fā)生插入突變、病毒構(gòu)建時間長、生物安全和經(jīng)費消耗大等問題。相比較病毒介導(dǎo)法，非病毒介導(dǎo)法雖然轉(zhuǎn)染效率不是很理想，但是費用低，也易操作[7]。

非病毒介導(dǎo)法分為兩大類，化學(xué)轉(zhuǎn)染方法(DEAE-葡聚糖法、磷酸鈣法、人工脂質(zhì)體法等)和物理轉(zhuǎn)染方法(顯微鏡注射、基因槍和電轉(zhuǎn)染等)[7-8]。理想的細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)是可獲得高效的轉(zhuǎn)染效率，同時對細胞毒性作用小，可獲得較好的細胞存活率。目前，人工脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染雖然應(yīng)用比較普遍，但是該方法還是存在很多不足，如對細胞毒性大、脂質(zhì)體會參與調(diào)節(jié)細胞某些基因的表達、細胞特異性強等缺點[9-11]。電轉(zhuǎn)染法是通過高脈沖電壓電擊細胞，使細胞膜形成微孔，外源基因能夠通過可逆孔洞進入細胞得以表達[12]。電轉(zhuǎn)染方法與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法以及病毒介導(dǎo)法相比，有轉(zhuǎn)染效率高、一次可轉(zhuǎn)染大量細胞、殘余毒性小、無試劑費用、安全、適用范圍廣等優(yōu)點，但電轉(zhuǎn)染需高電壓脈沖刺激，會降低細胞的存活率[4,8-9]。

為了獲得較好的轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率，本研究對電轉(zhuǎn)染技術(shù)進行優(yōu)化，通過改變脈沖電壓、脈沖時間、脈沖周期以及電轉(zhuǎn)染前孵育溫度，確定人永生化表皮細胞系HaCaT的最佳電轉(zhuǎn)染條件，為該細胞系后續(xù)相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)人永生化表皮細胞系HaCaT購自美國種質(zhì)保藏中心(American Type Culture Collection)。用含100 mL/L胎牛血清(美國HyClone公司)的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)在37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2.5 g/L胰酶(美國Sigma公司)消化及傳代。

1.2質(zhì)粒及其制備質(zhì)粒pGPU6/GFP/nev購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，將pGPU6/GFP/nev轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，37 ℃、250 r/min、LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，QIAGEN質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，BioTek Epoch超微量微孔板分光光度計測定質(zhì)粒濃度及質(zhì)粒純度，質(zhì)粒純度要求達到A260/A280≥1.8。用質(zhì)粒pGPU6/GFP/nev轉(zhuǎn)染HaCaT細胞，借助綠色熒光蛋白的表達，判斷轉(zhuǎn)染效率。

1.3HaCaT細胞最低低滲緩沖液耐受力檢測以及細胞直徑大小的測量首先，配制90、150、200、250、280 mOsmol/kg的電擊緩沖液，配方為KCl 25 mmol/L，KH2PO40.3 mmol/L，K2HPO40.85 mmol/L，肌醇(90、150、200、250、280)mOsmol/kg，pH 7.2。

其次，取對數(shù)生長期細胞HaCaT，2.5 g/L胰酶消化細胞，分別用90、150、200、250、280 mOsmol/kg的電擊緩沖液懸浮細胞，取一半細胞懸液室溫孵育15 min，用細胞計數(shù)器(Vi-cellTMXR，Beckman公司)測量細胞直徑大小。根據(jù)細胞直徑大小確定細胞最小脈沖電壓，細胞電轉(zhuǎn)染最小脈沖電壓表見表1。另一半細胞懸液室溫孵育30 min，用細胞計數(shù)器統(tǒng)計活細胞數(shù)目，選擇室溫孵育30 min后細胞存活率大于90%的最低等滲溶液作為細胞電擊緩沖液。

表1細胞電轉(zhuǎn)染最小脈沖電壓表

Tab.1 Minimum pulse voltage of cell electrotransfection

細胞直徑(μm)電壓(V)2-mm電轉(zhuǎn)杯(室溫)電壓(V)2-mm電轉(zhuǎn)杯(4℃) 553011001027054015180360201302602511022030901803580160407014045601205050100604080803060

1.4細胞轉(zhuǎn)染電轉(zhuǎn)染儀為Multiporator(德國eppendorf)，取對數(shù)生長期細胞，用100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640懸浮稀釋細胞，1 000 r/min離心，棄上清，用1.3最適細胞電轉(zhuǎn)液懸浮細胞，加入質(zhì)粒，使細胞數(shù)為1.5×106cell/mL，質(zhì)粒濃度為20 μg/mL，輕輕吹打混勻，取400 μL加入到eppendorf 2-mm電轉(zhuǎn)杯中，勿產(chǎn)生氣泡，選擇不同的電壓、脈沖時間、電擊次數(shù)、脈沖周期等條件組合后電擊細胞。電擊完畢，室溫放置10 min，將細胞懸液加入到60 mm培養(yǎng)皿中，同時加入37 ℃預(yù)熱的100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基4 mL，將細胞放在37 ℃、50 mL/L CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后利用熒光顯微鏡觀察綠色熒光，隨機取3個視野做平均值，細胞轉(zhuǎn)染效率=發(fā)出綠色熒光的細胞數(shù)/可見光下總細胞數(shù)×100%。

1.5電轉(zhuǎn)染細胞存活率的統(tǒng)計按照1.5實驗方法，選擇不同電壓、脈沖時間、電擊次數(shù)、脈沖周期等條件電擊HaCaT細胞，未進行任何電擊處理的HaCaT細胞作為對照組，不同條件電擊處理的HaCaT細胞作為實驗組，每組重復(fù)5孔，8 000 cell/well，37 ℃、50 mL/L CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，MTT法檢測細胞存活率。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理每組實驗在相同條件下重復(fù)3次，所得組間數(shù)據(jù)結(jié)果用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析(ANOVA)進行組間差異比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1HaCaT細胞電轉(zhuǎn)液及電轉(zhuǎn)染最低脈沖電壓的確定細胞電擊緩沖液是細胞電擊時使用的液體，不同細胞對電擊緩沖液的要求也不一樣。電擊緩沖液的選擇原則一般是：選擇細胞存活率大于90%的最低滲透壓緩沖液，這是因為低滲緩沖液可降低電導(dǎo)并限制Joule作用，同時使細胞達到最大腫脹程度(達到最大細胞直徑)，有利于質(zhì)粒進入細胞，從而獲得較高的轉(zhuǎn)染率。

從實驗結(jié)果表2可見，在90 mOsmol/kg滲透壓緩沖液下，HaCaT細胞存活率大于90%，符合電擊緩沖液的選擇原則，故實驗選擇90 mOsmol/kg為細胞的電擊緩沖液。HaCaT細胞在90 mOsmol/kg緩沖液中細胞直徑膨脹為16.44 μm，根據(jù)實驗表1，可以確定細胞的最小脈沖電壓為180 V。

表2不同滲透壓緩沖液下HaCaT細胞的存活率和細胞直徑

Tab.2 The survival rate and diameter of HaCaT cell in different osmotic pressure buffer

電擊緩沖液細胞存活率(%)細胞直徑(μm)90mOsmol/kg90.516.44150mOsmol/kg93.816.02200mOsmol/kg95.515.50250mOsmol/kg96.214.86280mOsmol/kg98.614.44

2.2脈沖電壓對HaCaT電轉(zhuǎn)率和細胞存活率的影響根據(jù)實驗結(jié)果2.1，在90 mOsmol/kg電擊緩沖液下，選擇180、360、540、720 V不同電壓，40 μs脈沖時間，1個脈沖周期，細胞濃度1.5×106/mL，室溫下對細胞進行電轉(zhuǎn)染，細胞培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計不同脈沖時間下細胞的轉(zhuǎn)染效率和存活率。

不同電壓強度下HaCaT細胞電轉(zhuǎn)效率和細胞存活率見圖1。180、360、540、720 V四組不同脈沖電壓的轉(zhuǎn)染效率分別為(3.83±0.44)%、(9.87±0.41)%、(20.27±2.17)%、(33.00±1.33)%，并且不同組間電轉(zhuǎn)染效率均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。MTT法檢測四組細胞的存活率分別為88.08%、83.38%、47.99%、23.02%。從實驗結(jié)果可以得到如下結(jié)論，隨著脈沖電壓的不斷增加，細胞轉(zhuǎn)染效率不斷提高，但細胞存活率卻顯著下降，而且720 V脈沖電壓下，HaCaT細胞生長狀態(tài)極差。故在其它電轉(zhuǎn)條件一樣的前提下，依據(jù)電轉(zhuǎn)染效率、細胞存活率和細胞生長狀態(tài)，540 V的脈沖電壓是比較理想的電轉(zhuǎn)染電壓。

圖1脈沖電壓對HaCaT細胞電轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率的影響

Fig.1 Effects of electric voltage on HaCaT cell electrotransfection efficiency and survival rate

*P<0.05vs. 180 V；△P<0.05vs. 360 V；▲P<0.05vs. 540 V。

2.3脈沖時間對HaCaT電轉(zhuǎn)率和細胞存活率的影響電轉(zhuǎn)染效率同樣受到脈沖時間的影響，這是因為在一定的脈沖電壓下，脈沖時間過短，則目的基因不能夠有效進入細胞，但是脈沖時間過長，又會導(dǎo)致細胞內(nèi)外離子交換時間過長，從而引起細胞死亡。

根據(jù)實驗2.2結(jié)果，選擇90 mOsmol/kg電擊緩沖液，540 V電壓，設(shè)定40、60、80、100、120 μs不同脈沖時間，1個脈沖周期，細胞濃度1.5×106/mL，室溫下對細胞進行電轉(zhuǎn)染，細胞培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計不同脈沖時間下細胞的轉(zhuǎn)染效率和存活率。實驗結(jié)果為40、60、80、100、120 μs五組不同脈沖時間的電轉(zhuǎn)染效率分別為(17.77±0.83)%、(27.60±1.97)%、(30.53±2.48)%、(33.73±4.88)%、(36.07±2.10)%，細胞存活率分別為61.58%、52.36%、34.77%、33.03%、23.22%。實驗結(jié)果提示，雖然增加脈沖時間可以提高電轉(zhuǎn)染效率，但卻使細胞存活率顯著下降(圖2)。綜上所述，在保證細胞存活率的前提下，選擇60 μs作為HaCaT細胞電轉(zhuǎn)的最佳脈沖時間。

圖2脈沖時間對HaCaT細胞電轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率的影響

Fig.2 Effects of pulse time on HaCaT cell electrotransfection efficiency and survival rate

*P<0.05vs. 40 μs；△P<0.05vs. 60 μs；▲P<0.05vs. 80 μs。

2.4脈沖周期對HaCaT電轉(zhuǎn)率和細胞存活率的影響增加電轉(zhuǎn)染脈沖周期次數(shù)，可以增加細胞膜上的穿孔，從而提高轉(zhuǎn)染率。根據(jù)實驗2.3結(jié)果，選擇90 mOsmol/kg電擊緩沖液，540 V電壓，60 μs脈沖時間，設(shè)置1次、2次、3次、4次和5次脈沖周期，1個脈沖周期，細胞濃度1.5×106/mL，室溫下對細胞進行電轉(zhuǎn)染，細胞培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計不同脈沖周期下細胞的轉(zhuǎn)染效率和存活率。從實驗結(jié)果可以看出，脈沖周期為2時，轉(zhuǎn)染效率由30.95%提高到32.88%，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，脈沖周期為3次、4次和5次時非但沒有增加轉(zhuǎn)染效率，反而導(dǎo)致大量HaCaT細胞死亡(圖3)。根據(jù)電轉(zhuǎn)染效率和細胞的生存率，選擇1次脈沖周期為HaCaT細胞電轉(zhuǎn)染的最佳條件。

圖3脈沖周期對HaCaT細胞電轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率的影響

Fig.3 Effects of electronic shock cycle on HaCaT cell electrotransfection efficiency and survival rate

*P<0.05vs. 1 T.

2.5脈沖溫度對HaCaT電轉(zhuǎn)率和細胞存活率的影響溫度對于電轉(zhuǎn)染效率的影響在于低溫可使細胞電擊后細胞膜修復(fù)變慢，延長外源性基因進入細胞的時間，提高外源性基因的攝入量。根據(jù)實驗2.4結(jié)果，選擇90 mOsmol/kg電擊緩沖液，540 V電壓，60 μs脈沖時間，1個脈沖周期，細胞濃度1.5×106/mL，設(shè)置室溫和4 ℃分別對細胞進行電轉(zhuǎn)染，細胞培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計不同脈沖溫度下細胞的轉(zhuǎn)染效率和存活率。實驗結(jié)果見圖4。室溫和4 ℃電轉(zhuǎn)染效率分別為33.23%和31.93%，統(tǒng)計學(xué)顯示無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，故選擇室溫為HaCaT細胞的電轉(zhuǎn)染溫度。

圖4脈沖前孵育溫度對HaCaT細胞電轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率的影響

Fig.4 Effects of pre-pulse incubation temperature on HaCaT cell electrotransfection efficiency and survival rate

A：溫度對HaCaT細胞電轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率的影響；B：HaCaT細胞電轉(zhuǎn)染后的生長狀態(tài)。

3 討 論

本實驗為了尋找適合HaCaT細胞電轉(zhuǎn)染的最佳轉(zhuǎn)染條件，我們選擇了脈沖電壓、脈沖時間、脈沖周期以及電轉(zhuǎn)染前孵育溫度等關(guān)鍵條件進行優(yōu)化以獲得目的基因希望的表達水平，為后續(xù)基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

電轉(zhuǎn)染效率受很多因素的影響，外界因素如脈沖電壓、孵育溫度、脈沖時間和培養(yǎng)基的成分等，還有細胞本身的因素。例如：細胞膜的流動性和細胞生長狀態(tài)(貼壁生長或者懸浮生長)[13]。脈沖電壓是影響電轉(zhuǎn)染效率的一個關(guān)鍵因素。這是因為脈沖電壓影響細胞膜通透作用，從而影響細胞膜與目的基因的結(jié)合以及吸收[13-15]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在其它轉(zhuǎn)染條件不變的情況下，隨著脈沖電壓的不斷升高(180～720 V)，HaCaT細胞電轉(zhuǎn)染效率由3.83%提高到33.00%。

研究表明，長時間的脈沖時間比較短脈沖時間更有利于提高細胞電轉(zhuǎn)染效率[16-17]。所以，本實驗比較了不同脈沖時間(40～120 μs)對HaCaT細胞電轉(zhuǎn)染效率的影響。實驗結(jié)果顯示，40 μs到120 μs的脈沖時間，HaCaT細胞電轉(zhuǎn)染率可增加大約20%。同時，我們還比較了HaCaT細胞60 μs/Pulse1、60 μs/Pulse2、60 μs/Pulse3、60 μs/Pulse4和60 μs/Pulse5之間的電轉(zhuǎn)染效率，發(fā)現(xiàn)60 μs/Pulse2比60 μs/Pulse1電轉(zhuǎn)染效率有所增加。這與LIU等[16]報道第1次脈沖可促使細胞膜形成穿孔，第2次脈沖更有利于目的基因進入細胞，從而提高細胞電轉(zhuǎn)染效率的文獻相符合。但是，HaCaT細胞每增加1次脈沖周期，細胞死亡率會直線上升，死亡原因可能為多次脈沖可大大提高細胞通透性，導(dǎo)致細胞內(nèi)外離子交換過多，引發(fā)細胞死亡[9,14]。死亡原因可能為細胞電擊之后，由于受到外界環(huán)境物理因素的刺激，細胞對環(huán)境條件的變化產(chǎn)生應(yīng)答，啟動有序變化的死亡過程，引發(fā)細胞死亡[16]。本實驗還未對HaCaT細胞電轉(zhuǎn)染細胞死亡的原因進行分析，但是電轉(zhuǎn)染實驗中我們發(fā)現(xiàn)，高電壓、長時間脈沖或多次脈沖周期均會導(dǎo)致HaCaT細胞形態(tài)變小變圓，并且貼壁不牢，繼續(xù)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，發(fā)生形態(tài)改變的細胞最終走向了死亡，死亡原因有待進一步驗證。所以，本實驗在選擇最佳HaCaT細胞電轉(zhuǎn)染條件的依據(jù)之一是：細胞存活率大于50%，且細胞大小及生長狀態(tài)未發(fā)生明顯改變。

電轉(zhuǎn)染與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)相比較，具有操作簡單、適用范圍廣、安全等優(yōu)點。本實驗根據(jù)電轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率兩個因素，最終確定540V/60 μs/Pulse1/RT為HaCaT細胞電轉(zhuǎn)染的最佳條件組合，細胞電轉(zhuǎn)染效率可達到33.23%，細胞存活率為61.22%。應(yīng)用電轉(zhuǎn)染技術(shù)使疾病相關(guān)基因在HaCaT細胞中表達，再結(jié)合相應(yīng)抗生素進行陽性細胞篩選，得到穩(wěn)定表達體系，進而進行目的基因功能分析，可以發(fā)現(xiàn)目的基因與疾病表型之間的關(guān)系。

參考文獻：

[1] SCHOOP VM, MIRANCEA N, FUSENIG NE. Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts[J]. J Invest Dermatol, 1999, 112(3):343-353.

[2] LEHMANN B. HaCaT cell line as a model system for vitamin D3 metabolism in human skin[J]. J Invest Dermatol, 1997, 108(1):78-82.

[3] SCHURER N, KOHNE A, SCHLIEP V, et al. Lipid composition and synthesis of HaCaT cells, an immortalized human keratinocyte line, in comparison with normal human adult keratinocytes[J]. Exp Dermatol, 1993, 2(4):179-185.

[4] ESCOFFRE JM, PORTET T, WASUNGU L, et al. What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues[J]. Mol Biotechnol, 2009, 41(3):286-295.

[5] KOIVISTO L, JIANG G, HAKKINEN L, et al. HaCaT keratinocyte migration is dependent on epidermal growth factor receptor signaling and glycogen synthase kinase-3alpha[J]. Exp Cell Res, 2006, 312(15):2791-2805.

[6] YANG Y, TETREAULT MP, YERMOLINA YA, et al. Kruppel-like factor 5 controls keratinocyte migration via the integrin-linked kinase[J]. J Biol Chem, 2008, 283(27):18812-18820.

[7] SONG L, CHAU L, SAKAMOTO Y, et al. Electric field-induced molecular vibration for noninvasive, high-efficiency DNA transfection[J]. Mol Ther, 2004, 9(4):607-616.

[8] SALIMZADEH L, JABERIPOUR M, HOSSEINI A, et al. Non-viral transfection methods optimized for gene delivery to a lung cancer cell line[J]. Avicenna J Med Biotechnol, 2013, 5(2):68-77.

[9] GUO H, HAO R, WEI Y, et al. Optimization of electrotransfection conditions of mammalian cells with different biological features[J]. J Membr Biol, 2012, 245(12):789-795.

[10] GHARTEY-TAGOE EB, BABBIN BA, NUSRAT A, et al. Plasmid DNA and siRNA transfection of intestinal epithelial monolayers by electroporation[J]. Int J Pharm, 2006, 315(1-2):122-133.

[11] KANEDA Y, TABATA Y. Non-viral vectors for cancer therapy[J]. Cancer Sci, 2006, 97(5):348-354.

[12] WU M, YUAN F. Membrane binding of plasmid DNA and endocytic pathways are involved in electrotransfection of mammalian cells[J]. PLoS One, 2011, 6(6):e20923.

[13] MARIJANOVIC I, HABERL S, MIKLAVCIC D, et al. Analysis and comparison of electrical pulse parameters for gene electrotransfer of two different cell lines[J]. J Membr Biol, 2010, 236(1): 97-105.

[14] WOLF H, ROLS M P, BOLDT E, et al. Control by pulse parameters of electric field-mediated gene transfer in mammalian cells[J]. Biophys J, 1994, 66(2 Pt 1): 524-531.

[15] PHEZ E, FAURIE C, GOLZIO M, et al. New insights in the visualization of membrane permeabilization and DNA/membrane interaction of cells submitted to electric pulses[J]. Biochim Biophys Acta, 2005, 1724(3):248-254.

[16] LIU L, JOHNSON C, FUJIMURA S, et al. Transfection optimization for primary human CD8+ cells[J]. J Immunol Methods, 2011, 372(1-2):22-29.

[17] CHOPINET L, BATISTA-NAPOTNIK T, MONTIGNY A, et al. Nanosecond electric pulse effects on gene expression[J]. J Membr Biol, 2013,