朱?；郏~學(xué)鋒，謝春光

(成都中醫(yī)藥大學(xué)：1.臨床醫(yī)學(xué)院；2.附屬醫(yī)院腎內(nèi)科；3.附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川成都 610072)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN) 是糖尿病常見的并發(fā)癥，其臨床特點為進(jìn)行性加重的蛋白尿和腎小球硬化，并逐漸進(jìn)展直至終末期腎病。而蛋白尿是DN治療的難點，也是加重腎功能損害的危險因素之一。足細(xì)胞損傷在DN中的作用是目前DN研究的熱點，被認(rèn)為是DN蛋白尿的發(fā)生的關(guān)鍵。研究認(rèn)為，足細(xì)胞損傷時足細(xì)胞特異性標(biāo)志物減少或喪失，發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，是DN蛋白尿發(fā)生的主要原因，也是足細(xì)胞出現(xiàn)脫落和凋亡前的一個可逆過程[1]。有文獻(xiàn)報道，DN足細(xì)胞損傷時足細(xì)胞表面特異性蛋白如nephrin 、podocin、podocalyxin、CD2-AP、Z0-1、desmin等表達(dá)異常[2]，但尚少見中醫(yī)藥在podocalyxin及desmin等方面的研究的報道。清熱益氣通絡(luò)方藥前期實驗研究顯示，其能拮抗足細(xì)胞podocin、nephrin蛋白的表達(dá)異常、降低DN大鼠蛋白尿[3]。本實驗通過單側(cè)腎切除鏈脲佐菌素誘導(dǎo)大鼠糖尿病模腎病模型，探討清熱益氣通絡(luò)方對DN大鼠蛋白尿的治療作用，并從DN足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化方面探討其作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及模型建立健康雄性SD大鼠共60只，體質(zhì)量(200±20)g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供(合格證：SCXK(陜)2007-001)。設(shè)立正常對照組10只，其余50只參照文獻(xiàn)[4]采用單側(cè)腎切除STZ腹腔注射法建立大鼠DN模型：適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，第2周100 g/L水合氯醛溶液(3 mL/kg)ip麻醉，背部切口行左腎切除術(shù)；第4周大鼠禁食16 h，正常對照組大鼠等量枸櫞酸鈉緩沖液ip，其余大鼠10 mg/L的鏈脲佐菌素檸檬酸鈉溶液(55 mg/kg)ip，3 d后尾靜脈穿刺采血測定血糖值，監(jiān)測尿糖、尿量及24 h UPro。以連續(xù)2次隨機血糖>16.7 mmol/L、尿糖強陽性、尿量>原尿量150%、24 h UPro >30 mg者為DN成模標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1.2分組及給藥第6周將造模成功的37只大鼠隨機分為：模型組13只、中藥組12只、厄貝沙坦組12只。對照組和模型組給予等容積純凈水ig、治療組分別給予厄貝沙坦0.05 g/(kg·d)ig，中藥濃縮液36.67 g/(kg·d)ig，共治療12周。

1.3主要藥物及試劑鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ，Sigma公司，批號20120601)；厄貝沙坦(杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司，批號2A245)；中藥飲片(葛根、黃柏、牛蒡子、黃芩、黃芪等購于西安怡康大藥房，煎煮、水浴蒸發(fā)至每毫升含生藥材3 g)；小鼠抗大鼠podocalyxin單抗、兔抗鼠WT1多抗(Abcam公司，購于博研生物科技有限公司，批號20121001)；兔抗鼠desmin多抗、羊抗兔IgG/FITC、山羊抗小鼠IgG/Cy3(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號20121002)；肌酐、考馬斯亮藍(lán)蛋白檢測試劑盒(南京建成生物工程有限公司，批號20101025)；大鼠umAlb ELISA試劑盒(蘇州卡爾文生物科技有限公司,批號20121002B)。

1.4檢測指標(biāo)及方法

1.4.1BW/KW、24 h UPro、24 h umAlb、CCr的檢測 第18周實驗結(jié)束，代謝籠收集大鼠24 h尿液，股動脈采血離心取血清。ELISA試劑盒檢測24 h umAlb，考馬斯亮蘭法檢測24 h UPro，苦味酸法測血、尿Cr，計算CCr。大鼠稱重，右腎去包膜稱重，計算BW/KW。

1.4.2podocalyxin、desmin的檢測 免疫熒光雙標(biāo)記podocalyxin、desmin，在熒光顯微鏡下通過轉(zhuǎn)換濾色鏡采集同一視野兩種熒光圖像，并用Image-Pro Plus軟件疊加合成圖像，分析兩種抗原單位面積腎小球平均吸光度(單位面積腎小球平均積分吸光度=陽性區(qū)積分吸光度/腎小球面積)。

1.4.3足細(xì)胞計數(shù)及密度 免疫熒光標(biāo)記WT1蛋白，每切片選30個腎小球，計數(shù)每個腎小球內(nèi)WT1陽性細(xì)胞個數(shù)，計算足細(xì)胞密度(WT1陽性細(xì)胞數(shù)/腎小球面積)，取其平均值。

1.4.4病理觀察 部分腎組織經(jīng)Carnoy固定液固定，PAS染色，光鏡觀察；取約1 mm3腎皮質(zhì)25 mL/L戊二醛固定，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié) 果

2.1一般情況對照組大鼠活潑、反應(yīng)敏捷，皮毛潔凈,攝食及飲水正常；其余3組大鼠活動明顯減弱，皮毛無光澤，尾部污垢，明顯多飲、多食、多尿，消瘦，實驗過程出現(xiàn)不同程度其他糖尿病并發(fā)癥及死亡(模型組、中藥組各死亡3只，厄貝沙坦組死亡4只，死亡原因為中風(fēng)、腎膿腫、腹瀉及嚴(yán)重便秘并發(fā)癥)。

2.2各組KW/BW、24hUPro、24humALb、Ccr的比較表1顯示，模型組大鼠KW/BW、24 h umALb、24 h Upro、Ccr升高，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；中藥及厄貝沙坦均能降低KW/BW、24 h UPro、24 h umALb(P<0.01，P<0.05)，厄貝沙坦還可降低過高的Ccr(P<0.05)；中藥降低24 h UPro作用顯著優(yōu)于厄貝沙坦組(P<0.05)。

表1各組KW/BW、24hUPro、umALb、Ccr的比較

Tab.1 Comparison of KW/BW, 24 h UPro, umALb and Ccr in all the groups

組 別例數(shù) KW/BW(mg/g) Ccr[mL/(min·kg)] 24h umALb(mg) 24h UPro(mg)對照組103.42±0.282.91(2.51～2.93)0.22(0.19～0.28)22.11(17.64～25.73)模型組108.85±0.46*6.31(5.34～7.31)*4.86(3.46～5.42)*175.96(125.86～195.22)*厄貝沙坦組88.38±0.33*4.64(4.54～6.12)#3.47(2.69～3.81)#125.18(112.50～152.31)#中藥組98.33±0.34*5.64(4.16～6.07)3.20(2.23～3.88)▲107.77(92.51～122.92)△▲F(Z) 521.19 22.42 24.63 29.53P 0.000 0.000 0.000 0.000

與對照組比，*P<0.01；與模型組相比，#P<0.05,△P<0.01；與厄貝沙坦組比，▲P<0.05。

2.3各組足細(xì)胞計數(shù)及密度的比較表2顯示，與對照組相比，DN模型組大鼠腎小球足細(xì)胞絕對計數(shù)無明顯降低(P>0.05)，但足細(xì)胞密度顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，中藥組及厄貝沙坦組足細(xì)胞密度顯著升高(P<0.01)。

表2腎小球足細(xì)胞計數(shù)及足細(xì)胞密度

Tab.2 Comparison of podocyte number and density in glomerulus in all the groups

組 別例數(shù)足細(xì)胞絕對計數(shù)(個)足細(xì)胞密度(個/μm2)對照組1037.63±2.045.48±0.29E-03模型組1036.50±1.954.03±0.30E-03*厄貝沙坦組836.92±2.154.55±0.20E-03△中藥組936.99±1.644.48±0.31E-03△ F0.57 74.337 P0.639 0.000

與對照組比，*P<0.01；與模型組相比，△P<0.01。

2.4各組podocalyxin、desmin表達(dá)及吸光度的比較比較同一視野采集的腎小球podocalyxin/desmin免疫熒光雙標(biāo)記圖像(圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，podocalyxin蛋白在對照組大鼠腎小球血管襻大量均勻表達(dá)(紅色)；模型組、中藥組及厄貝沙坦組DN大鼠腎小球血管襻podocalyxin蛋白表達(dá)量少，個別腎小球甚至完全無表達(dá)。對照組大鼠腎小球desmin蛋白(亮綠色)主要表達(dá)在系膜區(qū)，與對照組相比DN大鼠腎小球內(nèi)desmi蛋白表達(dá)顯著增加，在毛細(xì)血管壁沿基底膜出現(xiàn)了較強的陽性表達(dá)，呈線性分布，在部分腎小球毛細(xì)血管袢兩種蛋白表達(dá)有重疊(黃綠色或橙色)。與對照組組相比，模型組大鼠腎小球podocalyxin蛋白單位面積腎小球吸光度顯著降低(P<0.01)，desmin蛋白吸光度顯著增高(P<0.01)；中藥及厄貝沙坦均能顯著上調(diào)DN大鼠腎小球podocalyxin表達(dá)及下調(diào)desmin表達(dá)，與模型組比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)；中藥上調(diào)podocalyxin表達(dá)的作用優(yōu)于厄貝沙坦(P<0.05，表3)。

圖1podocalyxin/desmin共表達(dá)

Fig.1 Colocalization of podocalyxin and desmin in the glomerulus of different groups of rats (×400)

A：對照組；B：模型組；C：厄貝沙坦組；D：中藥組。

2.5腎小球的光鏡及電鏡病理觀察光鏡下模型組大鼠腎小球體積增大，血管袢擴張，部分腎小球系膜區(qū)輕度增寬，可見腎小管上皮細(xì)胞水腫及小管擴張現(xiàn)象；間質(zhì)無明顯水腫。中藥組及厄貝沙坦組病變與模型組類似但程度稍輕(圖2)。電鏡下對照組大鼠腎小球毛細(xì)血管襻管腔充盈，基底膜厚度基本均勻，足細(xì)胞足突結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，足突間隙基本正常。模型組大鼠腎小球毛細(xì)血管襻管腔增大，病變小球血管襻基底膜節(jié)段性增厚，足細(xì)胞足突排列紊亂、增寬、節(jié)段性融合，嚴(yán)重者融合廣泛，未見有明顯足細(xì)胞缺失。中藥組及厄貝沙坦組電鏡下病變程度及范圍相對較輕(圖3)。

表3腎小球podocalyxin、desmin單位面積腎小球平均吸光度的比較

Tab.3 Comparison of podocalyxin, desmin integral optical density per unit area in glomerulus (IA/glomerular area)

組 別例數(shù)podocalyxindesmin對照組100.2454±0.02110.1071±0.0167模型組100.0978±0.0167*0.2185±0.0234*厄貝沙坦組90.1272±0.0163△0.1907±0.0174*中藥組80.1459±0.0152△0.1944±0.0152# F 130.25 63.46 P 0.000 0.000

與對照組比，*P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，△P<0.01；與厄貝沙坦組比，▲P<0.05。

3 討 論

根據(jù)文獻(xiàn)報道，應(yīng)用單側(cè)腎切除STZ糖尿病大鼠可以在較短時間內(nèi)出現(xiàn)糖尿病的腎臟病理改變，而保留雙腎的STZ糖尿病大鼠往往在9～12個月才出現(xiàn)早期腎臟改變[3]。因此，我們選用單側(cè)腎切除STZ腹腔注射建立DN模型，與前期實驗[2]采用STZ誘導(dǎo)的DN模型比較，蛋白尿升高明顯，腎臟病理改變更為典型。

中醫(yī)無糖尿病腎病病名，歷代醫(yī)家在消渴病、水腫、尿濁、關(guān)格等相關(guān)病證中，從不同層面對進(jìn)展后DN進(jìn)行了豐富的辯證論治。明代戴原禮《證治要訣》則指出：“三消久而小便不臭，反作甜氣，在溺中滾涌，更有浮溺面如豬脂，此精不禁，真元竭也?！边@種尿液表現(xiàn)可見于糖尿病腎病尿中有較大量蛋白者。多數(shù)中醫(yī)學(xué)者都認(rèn)同消渴病腎病的基本病機是氣陰兩傷為本、燥熱瘀血為標(biāo)，氣虛血瘀，貫穿始終，致腎失封藏，脾失統(tǒng)攝，精微下流形成蛋白尿。根據(jù)歷代醫(yī)家對糖尿病腎病的認(rèn)識，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)研究[6-7]及臨床實踐，葉學(xué)鋒教授認(rèn)為，燥熱內(nèi)盛是早期DN發(fā)生的主要病機，血瘀貫穿于DN發(fā)生發(fā)展的始終，清熱解毒、活血通絡(luò)可能是防治DN的有效方法一。清熱益氣通絡(luò)方選用葛根為君藥清熱生津，升舉陽氣；黃芩清熱燥濕，苦寒堅陰，牛蒡子苦寒清熱，臣輔君藥堅陰；山茱萸補肝腎之陰、黃芪補肺脾之氣；川芎、水蛭活血通絡(luò)。諸藥協(xié)同起到清熱活血、固本通絡(luò)的作用，臨床應(yīng)用于早中期DN療效顯著。方中主要藥物葛根、黃芪等現(xiàn)代藥理研究證實對糖尿病腎病具有治療和保護(hù)作用。文獻(xiàn)報道，葛根素能提高糖尿病腎病CAT、SOD、GSH-Px，降低腎組織MDA含量，有效抑制糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng),改善腎功能[8]。 黃芪主要含有黃芪多糖及黃芪皂甙等， 文獻(xiàn)報道[9]其主要通過降糖、調(diào)脂、調(diào)節(jié)內(nèi)皮素與一氧化氮平衡、改善血小板功能、抗過氧化、抗蛋白非酶糖化等作用治療糖尿病腎病。本實驗結(jié)束時觀察到模型組大鼠腎臟肥大，KW/BW、24 h umALb、24 h UPro、Ccr升高；光鏡病理顯示糖尿病大鼠腎小球體積顯著增大，部分小球出現(xiàn)輕度系膜區(qū)增寬；電鏡下腎小球毛細(xì)血管腔擴張，病變腎小球基底膜呈節(jié)段性增厚，病變足細(xì)胞足突變寬、融合。以上提示本實驗糖尿病腎病模型復(fù)制成功。清熱益氣通絡(luò)方及厄貝沙坦均能顯著降低以上指標(biāo)，且清熱益氣通絡(luò)方降低24 h UPro的作用顯著優(yōu)于厄貝沙坦。

圖2光鏡下各組腎組織的病理變化

Fig.2 Kidney pathology of different groups of rats (PAS staining, ×400)

A：對照組；B：模型組；C：厄貝沙坦組；D：中藥組。

圖3各組腎小球的超微結(jié)構(gòu)

Fig.3 Glomerular ultramicrostructure observation of different groups of rats (×30 000)

A：對照組；B：模型組；C：厄貝沙坦組；D：中藥組。

足細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是指在某些刺激物作用下，足細(xì)胞失去上皮細(xì)胞樣表型標(biāo)志物如nephrin、ZO-1、P-cadherin等，而表達(dá)上調(diào)間充質(zhì)細(xì)胞樣表型標(biāo)志物如FSP-1、desmin、膠原Ⅰ(collagenⅠ)等，顯現(xiàn)轉(zhuǎn)分化特征，在蛋白尿發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用[10]。若早期去除損傷因素，足細(xì)胞能恢復(fù)至正常的上皮細(xì)胞表型,而并不發(fā)展至凋亡和脫落。因此，采取合理措施在DN早期能逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化即可減輕或消除蛋白尿。本實驗借助足細(xì)胞特定標(biāo)志物WT1染色計數(shù)足細(xì)胞數(shù)，選用podocalyxin作為正常足細(xì)胞的標(biāo)志物，desmin作為轉(zhuǎn)分化后細(xì)胞標(biāo)志物，免疫熒光雙標(biāo)記染色觀察DN大鼠足細(xì)胞表型變化和清熱益氣通絡(luò)方對它們的影響。WT1[11]是一種鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子，腎臟形成后僅定位于成熟足細(xì)胞，在腎臟內(nèi)皮細(xì)胞及系膜細(xì)胞不表達(dá)，是足細(xì)胞特異性標(biāo)志之一，常用來標(biāo)記計數(shù)足細(xì)胞。podocalyxin由腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和足細(xì)胞合成，是腎小球主要帶負(fù)電荷的蛋白分子，組成GBM電荷屏障，在足細(xì)胞成熟過程中固定于腎小球足細(xì)胞頂膜，因含有大量負(fù)電荷而具備抗粘附的特性被認(rèn)為是保持濾過膜開放的重要分子[12]。desmin屬于細(xì)胞骨架的中間絲蛋白，正常情況下主要在系膜細(xì)胞表達(dá)，當(dāng)足細(xì)胞因各種原因發(fā)生損傷時,可大量表達(dá)結(jié)蛋白。本實驗結(jié)果顯示，DN大鼠腎小球WT1陽性細(xì)胞絕對計數(shù)與對照組相比無明顯減少，但密度顯著低于對照組，結(jié)合電鏡對腎小球超微結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果，提示DN糖尿病腎病大鼠在本實驗時段里無明顯足細(xì)胞的脫失。模型組大鼠腎小球足細(xì)胞標(biāo)志物podocalyxin表達(dá)顯著降低，desmin表達(dá)升高，podocalyxin與desmin表達(dá)量呈反向關(guān)系，且兩種蛋白在腎小球毛細(xì)血管襻有共表達(dá)現(xiàn)象(黃綠色)；清熱益氣通絡(luò)中藥及厄貝沙坦均能夠拮抗糖尿病腎病大鼠腎組織podocalyxin蛋白表達(dá)降低和結(jié)蛋白desmin表達(dá)升高的異常，且清熱益氣通絡(luò)方上調(diào)podocalyxin的作用優(yōu)于厄貝沙坦。

本研究表明，清熱益氣通絡(luò)中藥雖無厄貝沙坦的顯著降壓、降低腎小球高濾過、高壓的作用，但在拮抗足細(xì)胞損傷后出現(xiàn)的足細(xì)胞表型異常方面具有一定優(yōu)勢。通過拮抗 DN大鼠足細(xì)胞表型podocalyxin表達(dá)降低和desmin表達(dá)升高的異常，一定程度上抑制足細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化，可能是清熱益氣通絡(luò)方藥治療糖尿病腎病蛋白尿的部分作用機制。

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