龔國利，王 娜， 劉麗麗， 游銀偉

(1.陜西科技大學 生命科學與工程學院， 陜西 西安 710021； 2.山東省農業(yè)科學院 高新技術研究中心， 山東 濟南 250100)

0 引言

粘細菌是一類普遍存在于土壤、堆肥及腐敗的樹皮中的原核生物[1]，屬于革蘭氏陰性細菌，具有復雜的多細胞行為[2].粘細菌是生物活性物質的生產者，能夠產生廣泛的具有活性的次級代謝產物，同時也是天然藥物的優(yōu)良資源之一.纖維堆囊菌是粘細菌中唯一能降解纖維素的種群[3]，從中發(fā)現(xiàn)了許多作用機制獨特、結構新穎的生物活性物質，引起了學者研究的興趣.

埃博霉素(epothilone)是一類粘細菌纖維堆囊菌產生的天然大環(huán)內酯類物質[4,5]，是一種新型的抗腫瘤藥物.它的作用機制與紫杉醇相同，通過促微管聚合作用抑制腫瘤細胞的增殖[6,7]，但它在水溶性、安全性以及抗腫瘤活性等方面優(yōu)于紫杉醇[8].埃博霉素化學結構簡單，易于進行修飾，引起了生物、醫(yī)學、制藥及有機合成等學科領域的高度重視.埃博霉素A和埃博霉素B是纖維堆囊菌產生的兩種主要產物[9]，因其在埃博霉素的類似物中活性較高而被廣泛研究，其中埃博霉素B活性更高，大量體外實驗的評價顯示了埃博霉素B是紫杉醇最具希望的替代者[10].2007年，施貴寶公司開發(fā)的埃博霉素B衍生物Lxabepilone獲得FDA批準在美國上市，在治療乳腺癌方面具有明顯的效果[11].

目前，埃博霉素產量低，不穩(wěn)定，受培養(yǎng)條件和環(huán)境等因素的影響很大，這些因素為其開發(fā)和應用帶來了很大的困難，所以在發(fā)酵生產過程中，主要通過菌種選育和優(yōu)化發(fā)酵工藝條件來提高埃博霉素產量.微生物發(fā)酵的生產水平不僅取決于生產菌種本身的性能，而且要賦予合適的環(huán)境條件才能夠使它的生產能力充分表現(xiàn)出來，這兩個環(huán)節(jié)是相輔相成的.

為了提高埃博霉素B的產量，降低生產成本，本實驗在前期優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎上，通過單因素試驗和正交試驗設計對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，為其規(guī)?；a奠定了基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

纖維堆囊菌SoF5-76(Sorangium cellulosum SoF5-76)本實驗室保存菌.來源：由本實驗室從土壤中篩選，經(jīng)過基因組重組技術選育獲得，埃博霉素B產量為14.3 mg/L[12].

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)CNST培養(yǎng)基： KNO30.05%， Na2HPO40.025%，MgSO4·7H2O 0.1%， FeCl30.001%， 微量元素液1 mL/L， 瓊脂2 %， pH 7.2.

(2)M26培養(yǎng)基：馬鈴薯淀粉0.8%，大豆蛋白胨0.2%，葡萄糖 0.2%， 酵母粉0.2%， MgSO40.1%，CaCl20.1%， EDTA-Fe3+1 mL/L， pH 7.2.

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯淀粉3.9 g/L，脫脂奶粉2.2 g/L，無水氯化鈣1.3 g/L，葡萄糖1 g/L，豆餅粉1.5 g/L，七水硫酸鎂2.5 g/L，EDTA-Fe3+3 mL/L，微量元素(TE )0.5 mL/L，pH 7.2，樹脂XAD-16 2% .1×105Pa高壓蒸汽滅菌20 min.

1.1.3 主要試劑與儀器

(1)主要試劑：Epothilone B標準品購于Singma公司；XAD-16樹脂購于美國Sigma公司.

(2)儀器： Waters-2487-2420-1525高效液相色譜儀，美國Waters公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

(1)種子培養(yǎng)：將保藏在固體斜面培養(yǎng)基中的菌種接入放有已滅菌濾紙片的CNST平板上，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中在30 ℃條件下培養(yǎng)5～7 d后，轉接于 M26培養(yǎng)基中，裝液量為50/250 mL三角瓶，在30 ℃、170 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h后，得到作為發(fā)酵培養(yǎng)的種子液.

(2)發(fā)酵培養(yǎng)：以5%(V/V)接種量將所得種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖床培養(yǎng)，發(fā)酵體系為300 mL三角瓶裝液量為50 mL，在30 ℃、170 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)5 d.

1.2.2 埃博霉素B提取及含量測定

(1)埃博霉素B提?。喊l(fā)酵結束后，收集樹脂，用10倍體積甲醇振蕩浸提24 h后，棄去樹脂，甲醇浸提液放入真空干燥箱中烘干，再加入500μL甲醇復溶，轉移到離心管中.

(2)埃博霉素B檢測：采用HPLC定量分析，液相色譜條件為：色譜柱,YWG，C18，10μm，250×4.6 mm；Waters-2487高效液相色譜儀；UV紫外檢測器；檢測波長,249 nm;流動相,甲醇∶水=65∶35(體積比)；上樣體積,20μL;時間,30 min;流速,1 mL/min.埃博霉素B的定量采用本實驗室用的標準曲線，方程如下：

Y=0.132X+0.003 5

采用HPLC檢測埃博霉素B所得的峰面積，根據(jù)標準曲線換算成埃博霉素B產量.

1.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

(1)單因素試驗設計.采用單因素試驗，分別考察發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH、裝液量、轉速、接種量、種齡、溫度和發(fā)酵時間對埃博霉素B產量的影響.

(2)正交試驗設計.在單因素試驗的基礎上，選取部分對埃博霉素B產量影響較大的因素(初始pH、裝液量、接種量、溫度)進一步進行發(fā)酵條件的優(yōu)化，每個因素設定三個水平，采用四因素三水平正交設計L9(34)進行試驗.正交試驗因子與水平設計見表1.

表1 正交試驗因子與水平設計

2 結果與討論

2.1 不同單因素對埃博霉素B發(fā)酵產量的影響

2.1.1 培養(yǎng)基初始pH對埃博霉素B產量的影響

pH是影響微生物正常生理活動的一個重要指標[13]，纖維堆囊菌培養(yǎng)的pH范圍是中性的，為了確定菌株發(fā)酵產埃博霉素B的最佳pH，選擇了初始pH為5.0、5.8、6.6、7.4、8.2的發(fā)酵培養(yǎng)基進行試驗，其他培養(yǎng)條件保持不變，即種齡為72 h，接種量5%(V/V)，裝液量為50 mL /250 mL，在30 ℃、170 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)5 d.試驗結果如圖1所示.分析可知，在發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為7.4時，埃博霉素B產量達到最大值為28.02 mg/L.

圖1 培養(yǎng)基初始pH對埃博 霉素B產量的影響

2.1.2 裝液量對埃博霉素B產量的影響

在微生物發(fā)酵過程中，控制溶氧，滿足生產菌對養(yǎng)分的需求，是提高發(fā)酵水平的關鍵因素之一[14].搖瓶發(fā)酵時，培養(yǎng)基的裝液量與搖床轉速基本可以反映溶氧水平.在初始pH 7.4、轉速170 r/min、種齡為72 h、接種量5%(V/V)、溫度30 ℃、發(fā)酵時間為5 d的條件下，本次試驗通過改變250 mL搖瓶裝液量，研究不同裝液量對埃博霉素B發(fā)酵產量的影響.實驗結果見圖2.結果顯示，裝液量對埃博霉素B產量影響顯著，裝液量為20 mL時，雖然溶解氧量充足，但由于養(yǎng)分不足，菌體生長緩慢，導致埃博霉素B產量較低.隨著裝液量增加，養(yǎng)分充足，埃博霉素B產量開始增加，裝液量增加到50 mL時，產量達到最大為28.53 mg/L.繼續(xù)增加裝液量，由于溶解氧不足，菌體生長受限制，發(fā)酵產量開始下降.故選取50 mL為最適裝液量.

圖2 裝液量對埃博霉素B產量的影響

2.1.3 搖床轉速對埃博霉素B產量的影響

搖床轉速同樣影響發(fā)酵液中氧氣的溶解量.在初始pH為7.4、裝液量為50/250 mL、種齡為72 h、接種量5%(V/V)、溫度30 ℃、發(fā)酵時間為5 d的條件下，改變轉速(140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min)，進行發(fā)酵培養(yǎng).發(fā)酵結束后進行埃博霉素B檢測，結果如圖3所示.經(jīng)分析可知，當搖床轉速較低時，發(fā)酵液中溶解氧量不足，不利于菌體生長，導致埃博霉素B發(fā)酵產量較低，當轉速達到200 r/min時，產量達到最大值為29.81 mg/L.隨著轉速繼續(xù)升高，發(fā)酵產量開始下降，可能是由于轉速過高，使部分菌受到破壞，從而使發(fā)酵產量下降.所以選取200 r/min為搖床轉速的最優(yōu)值.

圖3 搖床轉速對埃博霉素B產量的影響

2.1.4 種齡對埃博霉素B產量的影響

在發(fā)酵過程中，種齡能夠影響種子的質量及接入發(fā)酵培養(yǎng)基的效果，生命力旺盛的種子有利于菌體生長，老化的種子不利于菌體的生長繁殖，會影響菌株發(fā)酵產量.在初始pH為7.4、裝液量為50/250 mL、轉速為200 r/min、接種量為5%(V/V)、溫度為30 ℃、發(fā)酵時間為5 d的條件下，本試驗選取不同種齡的種子進行搖瓶發(fā)酵實驗，結果見圖4.經(jīng)分析可知，種齡在36～60 h變化時，埃博霉素B產量隨之增加，在60 h時，達到最大值為30.16 mg/L.種齡繼續(xù)增大，埃博霉素B產量先緩慢下降，然后迅速降低.故最適種齡為60 h.

圖4 種齡對埃博霉素B產量的影響

2.1.5 接種量對埃博霉素B產量的影響

在抗生素發(fā)酵過程中，采用較大的接種量可以縮短菌體增殖時間，提高抗生素產量.但是接種量過大會使菌體生長過快，造成營養(yǎng)基質缺乏或溶氧不足，影響抗生素的合成.為了提高埃博霉素B產量，必須選擇合適的接種量.在初始pH為7.4、裝液量為50/250 mL、轉速為200 r/min、種齡為60 h、溫度為30 ℃、發(fā)酵時間為5 d的條件下，研究不同接種量對埃博霉素B產量的影響.由圖5可知，當接種量為2%時，由于菌體數(shù)量限制使得埃博霉素B產量較低，隨著接種量增大，產量緩慢增加，當接種量為8%時，產量達到最大值為30.63 mg/L.接種量繼續(xù)增大，產量卻隨之降低.因此本試驗選取8%為最適接種量.

圖5 接種量對埃博霉素B產量的影響

2.1.6 溫度對埃博霉素B產量的影響

在初始pH為7.4、裝液量為50/250 mL、轉速為200 r/min、種齡為60 h、接種量為8%(V/V)、發(fā)酵時間為5 d的條件下，研究不同溫度對埃博霉素B產量的影響.由圖6可知，低溫不利于纖維堆囊菌發(fā)酵產埃博霉素B，隨著溫度升高，菌體代謝加快，埃博霉素B產量大幅度提高，當溫度達到30 ℃時，發(fā)酵產量最高為30.15 mg/L.隨著溫度繼續(xù)升高，產量卻大幅度降低，故最適溫度為30 ℃.

圖6 溫度對埃博霉素B產量的影響

2.1.7 發(fā)酵時間對埃博霉素B產量的影響

埃博霉素B為纖維堆囊菌的次級代謝產物，穩(wěn)定期開始大量積累，同時接種量也對發(fā)酵時間有一定的影響.本次試驗在初始pH為7.4、裝液量為50/250 mL、轉速為200 r/min、種齡為60 h、接種量為8%(V/V)、溫度為30 ℃的條件下，進行搖瓶發(fā)酵，分別培養(yǎng)3、4、5、6、7 d后進行埃博霉素B檢測，試驗結果如圖7.結果分析可知，發(fā)酵時間為6 d時，埃博霉素B產量達到最高31.28 mg/L.繼續(xù)增加培養(yǎng)時間，產量基本保持不變，故最適發(fā)酵時間為6 d.

圖7 發(fā)酵時間對埃博霉素B產量的影響

2.2 正交試驗設計

根據(jù)上述單因素試驗結果，初始pH、裝液量、接種量、溫度對纖維堆囊菌發(fā)酵產埃博霉素B的影響較大，將這4個因素進一步通過四因素三水平L9(34)正交試驗進行優(yōu)化，得到最優(yōu)組合.正交試驗結果以及直觀分析結果見表2.

表2 正交試驗結果與分析

由表2可知，RA>RD>RB>RC，即選取的4個因素對埃博霉素B產量影響的主次關系為：初始pH>溫度>裝液量>接種量，表明發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH對埃博霉素B發(fā)酵產量影響最為顯著，最不顯著的影響因子為接種量.此外從表中還可以看出發(fā)酵條件的最優(yōu)組合為：A2B2C3D2，即初始pH為7.4，裝液量為50 mL/250 mL，接種量為10%，溫度為30 ℃.由于正交試驗表中沒有符合此發(fā)酵條件的方案，所以按照上述得到的最優(yōu)發(fā)酵條件做驗證試驗.

2.3 驗證試驗

在上述所得到的最優(yōu)發(fā)酵條件下進行搖瓶發(fā)酵，同時將優(yōu)化前的發(fā)酵條件即在初始pH為7.2、種齡為72 h、接種量5%(V/V)、裝液量為50 mL/300 mL、溫度30 ℃、轉速170 r/min、發(fā)酵時間5 d的條件下作為對照.試驗結果見表3.由表3可知，最優(yōu)發(fā)酵條件下埃博霉素B的產量為35.24 mg/L，與優(yōu)化前(29.95 mg/L)相比產量提高了17.67%.

表3 驗證試驗

3 結論

纖維堆囊菌易受菌體本身以及環(huán)境條件的影響，進而影響菌體的生物合成能力.為了提高埃博霉素B的產量，以降低生產成本，本試驗在前期優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，進一步對發(fā)酵條件進行優(yōu)化.首先采用單因素試驗考察初始pH、裝液量、轉速、種齡、接種量、溫度、發(fā)酵周期7個因素對埃博霉素B產量的影響，得到各因子的最優(yōu)水平.在單因素試驗的基礎上，將對埃博霉素B影響較大的因素(初始pH、裝液量、接種量、溫度)進一步進行正交試驗，得到最優(yōu)組合.最終確定最優(yōu)發(fā)酵條件為:初始pH7.4、裝液量50 mL、轉速200 r/min、種齡60 h、接種量10%、溫度30 ℃、發(fā)酵周期6 d.在此最優(yōu)條件下進行搖瓶發(fā)酵，埃博霉素B產量達到35.24 mg/L，比優(yōu)化前(29.95 mg/L)提高了17.67%.

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