張金艷+趙紅艷

摘要：采用組織培養(yǎng)與溫室栽培相結(jié)合的方法，對生產(chǎn)鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）藥材的階段式培養(yǎng)和栽培模式進(jìn)行研究。結(jié)果表明，在光照度1 500～2 000 lx，光照時間12 h/d，培養(yǎng)溫度（25±1） ℃條件下，1/2 MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA的組合有利于鐵皮石斛組培苗生長，生物量可達(dá)（4.29±0.11） g/株。組培苗10～15 cm高時，以腐殖質(zhì)土為栽培土，溫度23～25 ℃，光照條件中度遮陰（50%遮陰度），有利于鐵皮石斛次生代謝產(chǎn)物的積累。組織培養(yǎng)能加快繁殖和促進(jìn)試管苗生長，使生物產(chǎn)量快速增加；腐殖質(zhì)土栽培能促進(jìn)其有效成分的合成。將組織培養(yǎng)與腐殖質(zhì)土壤栽培技術(shù)相結(jié)合，建立了鐵皮石斛的階段式培養(yǎng)和栽培模式。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）；組織培養(yǎng)；溫室栽培；階段式培養(yǎng)

中圖分類號：R282；S62 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）07-1599-03

The Staged Training and Cultivation Mode of Dendrobium officinale Kimura et Migo

ZHANG Jin-yan1， ZHAO Hong-yan2， HAO Su-yu1， HAN Qiong1，LIU Yi-qiong1，WANG Tai-xia1

（1.College of Life Science， Henan Normal University，Xinxiang 453007，Henan，China；

2. Department of Life Science and Technology， College of Xinxiang， Xinxiang 453000， Henan，China）

Abstract： The staged training and cultivation mode of Dendrobium officinale Kimura et Migo was studied with the combination of tissue culture and greenhouse cultivation. The results showed that under the condition of the light intensity 1500～2 000 lx， irradiation time 12 h/d， culture temperature （25±1） ℃， 1/2 MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA was better for tissue culture seedlings of Dendrobium officinale Kimura et Migo to grow. The biomass growth reached as high as （4.29±0.11） g per plant. When the height of tissue culture seedlings was 10～15 cm， using the humus soil as cultivated soil， temperature 23～25 ℃， light intensity 50% full light was conducive to the accumulation of Dendrobium officinale Kimura et Migo secondary metabolite. Tissue culture could accelerate the reproduction and promote the growth of plantlets， increase the biomass rapidly. Humus soil cultivation can promote the synthesis of effective components. The staged training and cultivation mode of Dendrobium officinale Kimura et Migo was established by combining the tissue culture with humus soil cultivation technology.

Key words： Dendrobium officinale Kimura et Migo； tissue culture； greenhouse cultivation； staged training

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）又稱鐵皮蘭，隸屬于蘭科石斛屬，多年生附生性草本植物，新鮮或干燥莖入藥[1]，具有清熱驅(qū)毒、調(diào)理胃、滋潤肺部、防止干咳等功效，市場需求量大[2]，其藥效成分主要為多糖和生物堿等[3，4]。鐵皮石斛種子單獨栽種發(fā)芽率相當(dāng)?shù)?，與某些真菌類共生才能保證一定的發(fā)芽率。所以用栽種普通植物的傳統(tǒng)方法種植石斛類的種子很難保證其生長量。加之鐵皮石斛多生長于陰濕環(huán)境中，自然生長和人工栽培緩慢，收獲產(chǎn)量低，供不應(yīng)求。因此，近年來研究者開展了大量有關(guān)鐵皮石斛組織培養(yǎng)的研究，成功進(jìn)行了鐵皮石斛分化誘導(dǎo)和快速繁殖[5]。然而，試管苗雖然繁殖系數(shù)高、生長快，但有效成分含量低，且植物體內(nèi)有較高的植物生長調(diào)節(jié)劑殘留，影響用藥安全。本研究旨在將組織培養(yǎng)繁殖系數(shù)高、生長快的優(yōu)勢與土壤栽培利于有效成分合成、用藥安全優(yōu)勢相結(jié)合，建立一種鐵皮石斛的階段式培養(yǎng)和栽培模式，為后續(xù)研究應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛試管苗，由信陽師范學(xué)院生理學(xué)實驗室培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 鐵皮石斛試管苗快速繁殖和生長條件優(yōu)化 將鐵皮石斛幼莖切成0.8 cm的莖段，分別接種在含有不同濃度的NAA、6-BA的1/2 MS培養(yǎng)基上。在（25±1） ℃[6]條件下，光照度分別為500、1 000、

1 500、2 000、2 500 lx，篩選適于鐵皮石斛快速繁殖和生長的組織培養(yǎng)條件，以獲取較大生物產(chǎn)量，并測定其繁殖系數(shù)[7]。

1.2.2 鐵皮石斛溫室栽培條件優(yōu)化 當(dāng)鐵皮石斛組培苗長至10～15 cm時，用清水沖洗干凈根部培養(yǎng)基，待苗局部晾干且可見水分的程度即可進(jìn)行移栽。栽培的培養(yǎng)基質(zhì)選用腐殖質(zhì)土。將苗栽在花盆中，每花盆種植3～5株。溫室溫度控制在23～25 ℃，空氣濕度控制在75﹪以上，每天噴霧1～3次，1個月噴灑1次大量溶液，適量通風(fēng)。設(shè)置不同光照條件，重度遮陰（80%遮陰度）、中度遮陰（50%遮陰度）、輕度遮陰（30%遮陰度），研究光照條件對鐵皮石斛生長的影響，3個月后測定生物量和莖中有效成分含量，分析不同光照條件對鐵皮石斛苗生長狀況和有效成分含量的影響。

1.2.3 鐵皮石斛莖中有效成分的測定

1）鐵皮石斛多糖含量的測定。取鐵皮石斛莖，在60 ℃烘箱烘干至恒重，用粉碎機(jī)粉碎，過60目篩。精確稱取鐵皮石斛粉末1 g，置于索氏提取器中，用丙酮脫脂處理24 h后，放在空氣中待丙酮完全揮發(fā)。將經(jīng)過處理的樣品加入含有400 mL去離子水的超聲反應(yīng)杯中，制定超聲條件，進(jìn)行超聲輔助提取。提取結(jié)束后抽濾，濾液集中至30 mL，加入10 mL Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=5∶1），搖床振蕩30 min脫蛋白后，10 000 r/min離心10 min，把上清液再重復(fù)脫蛋白，3次重復(fù)。脫蛋白后的濾液緩慢加入95%乙醇，至乙醇為80%，4 ℃冰箱靜置48 h后離心，取沉淀。用適量去離子水復(fù)溶后定容至100 mL，隨后冷凍干燥。精確吸取樣品溶液1 mL，稀釋100倍后取1 mL用于繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[8，9]，計算樣品中多糖的含量。

多糖含量=[（從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得糖的含量/樣品溶液的體積）×提取液體積×（稀釋倍數(shù)/樣品重量）×106]×100%

2）鐵皮石斛總生物堿含量的測定 精確稱取鐵皮石斛粗粉0.50 g，用適量氨水濕潤，密封放置30 min，精確加入氯仿10.0 mL，置于水浴上加熱回流2 h，冷卻后稱重，用氯仿補(bǔ)足失重，過濾。取濾液2.0 mL于分液漏斗中，加氯仿溶液8.0 mL（稀釋5倍），作為樣品溶液。然后精確量取樣品溶液10 mL，將樣品溶液按測定生物堿含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作步驟進(jìn)行操作。同時精確量取石斛堿對照品溶液2.0 mL置于分液漏斗中，同法操作，測定其吸光度，計算總生物堿含量[10]。

總生物堿含量=（樣品溶液吸光度×20 μg）/（標(biāo)準(zhǔn)品吸光度×樣品總體積×吸取樣品溶液的體積）×100﹪

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長調(diào)節(jié)劑對鐵皮石斛試管苗繁殖系數(shù)和生物量的影響

在光照時間12 h/d，培養(yǎng)溫度（25±1） ℃條件下，以1/2 MS為培養(yǎng)基，添加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑組合，研究不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對鐵皮石斛試管苗繁殖系數(shù)和生物量的影響，結(jié)果如表1所示。NAA和6-BA兩種生長素交互作用下對鐵皮石斛試管苗的繁殖系數(shù)影響較大，不同激素濃度組合之間有明顯差異。0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA組合繁殖系數(shù)最大，達(dá)到7，其次是0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA和1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA組合；鐵皮石斛試管苗平均生物量最高的組合也是0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA，為（4.29±0.11） g/株，其他濃度組合下生物量較小。

2.2 光照度對鐵皮石斛試管苗繁殖系數(shù)和生物量的影響

以1/2 MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA的組合進(jìn)行快繁培養(yǎng)，在光照時間12 h/d， 培養(yǎng)溫度（25±1） ℃條件下，研究了不同光照度對鐵皮石斛試管苗繁殖系數(shù)和生物量的影響。結(jié)果（表2）表明，最適于鐵皮石斛試管苗生長的光照度為1 500、2 000 lx，在這兩個光照度下鐵皮石斛平均生物量均大于4.00 g/株，高于其他光照條件下的生物量。

2.3 光照條件對栽培鐵皮石斛生物量和有效成分含量的影響

組培苗長至10～15 cm高時，將苗移栽到盛有腐殖質(zhì)土的溫室花盆中，溫度控制在23～25 ℃，空氣濕度75﹪以上。通過遮陰形成不同光照條件，3個月后測定單株鮮重和有效成分含量，分析不同光照條件對鐵皮石斛苗生長狀況和有效成分含量的影響，結(jié)果如表3所示。不同光照條件對栽培鐵皮石斛生物量和有效成分含量的積累有明顯影響，中度遮陰的情況下，鐵皮石斛生物量較高，也有利于有效成分的合成和積累，其有效成分含量與輕度遮陰下相近。

2.4 試管苗和栽培鐵皮石斛有效成分的比較

分別測量鐵皮石斛試管苗和栽培苗莖中多糖、總生物堿含量，結(jié)果表明鐵皮石斛試管苗中總生物堿含量很少，多糖含量也較低。溫室栽培3個月后，鐵皮石斛莖中有效成分明顯提高，總生物堿含量是試管苗的2.67倍，多糖含量是試管苗的2.25倍（表4）。說明在本試驗過程中，組織培養(yǎng)條件下雖然鐵皮石斛繁殖生長較快，但不利于生物堿、多糖等有效成分的合成和積累。溫室栽培條件下，雖然生長較慢，但有利于有效成分的形成。

3 結(jié)論與討論

由于鐵皮石斛自身繁殖能力低和人為過度采挖，造成野生資源瀕臨滅絕[11]，1992年被《中國植物紅皮書》列為瀕危植物。為緩解鐵皮石斛資源短缺問題，近年來浙江、云南、四川、廣西等地開展鐵皮石斛的組培快繁和大規(guī)模人工種植。組織培養(yǎng)可以在短期內(nèi)提高繁殖系數(shù)、增加生物量，且不受自然環(huán)境條件的限制。但本試驗條件下，通過組培快繁生產(chǎn)的試管苗，其有效成分含量較低，且多數(shù)情況下生長在培養(yǎng)基上的試管苗植物生長調(diào)節(jié)劑殘留較高。因此，試管苗不宜直接作為藥材應(yīng)用。

與組織培養(yǎng)比較，溫室栽培具有成本低、有效成分含量高和植物生長調(diào)節(jié)劑殘留含量低等優(yōu)勢。溫室栽培鐵皮石斛已成為目前石斛藥材的重要來源。但由于鐵皮石斛根系不發(fā)達(dá)，尤其是根毛不發(fā)達(dá)，影響其對土壤中營養(yǎng)成分的吸收，且其葉片小而少，光合效率低。因此，自然生長和溫室栽培的鐵皮石斛生長較慢，通常2～3年才能達(dá)到藥材標(biāo)準(zhǔn)。本試驗結(jié)果表明，組織培養(yǎng)能加快繁殖并促進(jìn)試管苗生長，使生物產(chǎn)量快速增加；腐殖質(zhì)土栽培能促進(jìn)有效成分的合成。將組織培養(yǎng)與腐殖質(zhì)土壤栽培技術(shù)相結(jié)合，建立了鐵皮石斛的階段式培養(yǎng)和栽培模式。通過進(jìn)一步優(yōu)化鐵皮石斛的階段式培養(yǎng)和栽培模式，將有利于提高鐵皮石斛藥材生產(chǎn)的效益。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國家環(huán)境保護(hù)局，中國科學(xué)院植物研究所. 中國珍稀瀕危保護(hù)植物名錄[M].北京：科學(xué)出版社，1987.

[2] 中華人民共和國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

[3] 邵 華，張玲琪，李俊梅，等.鐵皮石斛研究進(jìn)展[J].中草藥，2004，35（1）：109-112.

[4] 陳曉梅，郭順星. 石斛屬植物化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2001，13（1）：70-74.

[5] 李進(jìn)進(jìn)，廖俊杰，許繼勇，等.鐵皮石斛試管苗栽培技術(shù)研究[J].中藥材， 2006， 29（11）：1133-1134.

[6] 吳志剛，劉賢旺，張壽文.石斛屬植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].中藥研究與信息，2005，7（11）：24-25.

[7] 雷祖培，余宏傲，張書潤，等.不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和培養(yǎng)基對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響[J].浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報，2011，28（4）：662-666.

[8] 朱美靜，童群義.猴頭多糖脫蛋白方法的研究[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，26（4）：25-27.

[9] DUBOIS M， GILLES K A， HAMILTON J K，et al.Colormetric method for the determination of sugars and related substances[J].Analytical Chemistry，1956，28（3）：350-356.

[10] 李亞芳，張曉華，孫國明.石斛中總生物堿和多糖的含量測定[J].中國藥事，2002，16（7）：426-429.

[11] 陳瑞蕊，林先貴，施亞琴.藥用石斛及其組培技術(shù)研究概要[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002（5）：65-66.

與組織培養(yǎng)比較，溫室栽培具有成本低、有效成分含量高和植物生長調(diào)節(jié)劑殘留含量低等優(yōu)勢。溫室栽培鐵皮石斛已成為目前石斛藥材的重要來源。但由于鐵皮石斛根系不發(fā)達(dá)，尤其是根毛不發(fā)達(dá)，影響其對土壤中營養(yǎng)成分的吸收，且其葉片小而少，光合效率低。因此，自然生長和溫室栽培的鐵皮石斛生長較慢，通常2～3年才能達(dá)到藥材標(biāo)準(zhǔn)。本試驗結(jié)果表明，組織培養(yǎng)能加快繁殖并促進(jìn)試管苗生長，使生物產(chǎn)量快速增加；腐殖質(zhì)土栽培能促進(jìn)有效成分的合成。將組織培養(yǎng)與腐殖質(zhì)土壤栽培技術(shù)相結(jié)合，建立了鐵皮石斛的階段式培養(yǎng)和栽培模式。通過進(jìn)一步優(yōu)化鐵皮石斛的階段式培養(yǎng)和栽培模式，將有利于提高鐵皮石斛藥材生產(chǎn)的效益。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國家環(huán)境保護(hù)局，中國科學(xué)院植物研究所. 中國珍稀瀕危保護(hù)植物名錄[M].北京：科學(xué)出版社，1987.

[2] 中華人民共和國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

[3] 邵 華，張玲琪，李俊梅，等.鐵皮石斛研究進(jìn)展[J].中草藥，2004，35（1）：109-112.

[4] 陳曉梅，郭順星. 石斛屬植物化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2001，13（1）：70-74.

[5] 李進(jìn)進(jìn)，廖俊杰，許繼勇，等.鐵皮石斛試管苗栽培技術(shù)研究[J].中藥材， 2006， 29（11）：1133-1134.

[6] 吳志剛，劉賢旺，張壽文.石斛屬植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].中藥研究與信息，2005，7（11）：24-25.

[7] 雷祖培，余宏傲，張書潤，等.不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和培養(yǎng)基對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響[J].浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報，2011，28（4）：662-666.

[8] 朱美靜，童群義.猴頭多糖脫蛋白方法的研究[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，26（4）：25-27.

[9] DUBOIS M， GILLES K A， HAMILTON J K，et al.Colormetric method for the determination of sugars and related substances[J].Analytical Chemistry，1956，28（3）：350-356.

[10] 李亞芳，張曉華，孫國明.石斛中總生物堿和多糖的含量測定[J].中國藥事，2002，16（7）：426-429.

[11] 陳瑞蕊，林先貴，施亞琴.藥用石斛及其組培技術(shù)研究概要[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002（5）：65-66.

與組織培養(yǎng)比較，溫室栽培具有成本低、有效成分含量高和植物生長調(diào)節(jié)劑殘留含量低等優(yōu)勢。溫室栽培鐵皮石斛已成為目前石斛藥材的重要來源。但由于鐵皮石斛根系不發(fā)達(dá)，尤其是根毛不發(fā)達(dá)，影響其對土壤中營養(yǎng)成分的吸收，且其葉片小而少，光合效率低。因此，自然生長和溫室栽培的鐵皮石斛生長較慢，通常2～3年才能達(dá)到藥材標(biāo)準(zhǔn)。本試驗結(jié)果表明，組織培養(yǎng)能加快繁殖并促進(jìn)試管苗生長，使生物產(chǎn)量快速增加；腐殖質(zhì)土栽培能促進(jìn)有效成分的合成。將組織培養(yǎng)與腐殖質(zhì)土壤栽培技術(shù)相結(jié)合，建立了鐵皮石斛的階段式培養(yǎng)和栽培模式。通過進(jìn)一步優(yōu)化鐵皮石斛的階段式培養(yǎng)和栽培模式，將有利于提高鐵皮石斛藥材生產(chǎn)的效益。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國家環(huán)境保護(hù)局，中國科學(xué)院植物研究所. 中國珍稀瀕危保護(hù)植物名錄[M].北京：科學(xué)出版社，1987.

[2] 中華人民共和國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

[3] 邵 華，張玲琪，李俊梅，等.鐵皮石斛研究進(jìn)展[J].中草藥，2004，35（1）：109-112.

[4] 陳曉梅，郭順星. 石斛屬植物化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2001，13（1）：70-74.

[5] 李進(jìn)進(jìn)，廖俊杰，許繼勇，等.鐵皮石斛試管苗栽培技術(shù)研究[J].中藥材， 2006， 29（11）：1133-1134.

[6] 吳志剛，劉賢旺，張壽文.石斛屬植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].中藥研究與信息，2005，7（11）：24-25.

[7] 雷祖培，余宏傲，張書潤，等.不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和培養(yǎng)基對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響[J].浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報，2011，28（4）：662-666.

[8] 朱美靜，童群義.猴頭多糖脫蛋白方法的研究[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，26（4）：25-27.

[9] DUBOIS M， GILLES K A， HAMILTON J K，et al.Colormetric method for the determination of sugars and related substances[J].Analytical Chemistry，1956，28（3）：350-356.

[10] 李亞芳，張曉華，孫國明.石斛中總生物堿和多糖的含量測定[J].中國藥事，2002，16（7）：426-429.

[11] 陳瑞蕊，林先貴，施亞琴.藥用石斛及其組培技術(shù)研究概要[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002（5）：65-66.