雍康+張傳師（等）

摘要：為了解奶牛S100A12基因序列的特征及其在乳腺和生殖系統(tǒng)中的表達情況，采用RT-PCR技術從奶牛外周血液中擴增S100A12基因，重組到pMD19-T Simple載體中，進行了測序和序列分析，并應用RT-PCR技術檢測了奶牛乳腺和生殖系統(tǒng)（卵巢、輸卵管、子宮頸、子宮體、陰道等組織）中S100A12 mRNA的表達分布。結(jié)果顯示，克隆的S100A12基因包含一個279 bp的完整開放閱讀框（ORF），與GenBank中的奶牛S100A12基因（NM_174651）編碼區(qū)序列100%相同，該ORF編碼的92個氨基酸含有一個EF手型結(jié)構(gòu)（位于49-84氨基酸殘基）；另外，還預測到3個蛋白激酶C磷酸化位點，分別位于19-21、44-46和70-73氨基酸殘基。S100A12基因在奶牛乳腺和生殖系統(tǒng)上皮組織中均有表達。推測S100A12基因在奶牛乳腺和生殖系統(tǒng)中具有一定作用。

關鍵詞：S100A12基因；組織表達；基因克??；奶牛

中圖分類號：S858.23 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）07-1616-05

Cloning of Mastitis Resistance-Related Gene S100A12 in Dairy Cow and Its Expression in Lacteal Gland and Genital System

YONG Kang1， ZHANG Chuan-shi1， YANG Qing-wen1，YAO Xue-ping2，CAO Sui-zhong2

（1.Department of Animal Science and Technology，Chongqing Three Gorges Vocational College， Chongqing 404155， China；

2. College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Yaan 625014，Sichuan，China）

Abstract： To study the characteristics of dairy cow S100A12 gene and its expression in lacteal gland and genital system， the S100A12 gene was amplified by RT-PCR from peripheral blood of dairy cow and sequenced and analyzed after recombination in pMD19-T Simple vector. The expression distributions of S100A12 mRNA in dairy cows lacteal gland and genital system were detected by RT-PCR. The results showed that the cloned S100A12 gene had a 270bp ORF， 100% identical with S100A12 gene in GenBank. In ORF， there was a EF hand formation consisted of 92 amino acids（49-84 amino acids residue）. Three phosphorylation sites of protein kinase C were found in 19-21， 44-46， 70-73 amino acid residues. S100A12 gene was expressed in all epithelial tissue of dairy cow lacteal gland and genital system. It might play an important role in dairy cow lacteal gland and genital system.

Key words： S100A12 gene； tissue expression； gene clone； cow

奶牛乳房炎是影響世界奶牛業(yè)發(fā)展、給乳品生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟損失的一種常見病和多發(fā)病，研究奶牛乳房炎抗性的分子機理，尋找出調(diào)控乳房炎抗性的關鍵或重要的基因及其信號通路，則可以通過營養(yǎng)調(diào)控、開發(fā)新藥治療和遺傳選育等各種策略提高乳房炎抗性，降低乳房炎的發(fā)生率[1]。血液白細胞在奶牛乳腺免疫中發(fā)揮著關鍵的作用，乳房炎的發(fā)生與乳腺的免疫密切相關，而奶牛乳腺免疫是一個十分復雜的過程，白細胞中大量相關基因以直接或間接的方式參與乳腺免疫[2]，這些因子中就包括S100A12。S100A12是1994年在豬粒細胞中發(fā)現(xiàn)的[3]。S100A12蛋白與大多數(shù)S100家族蛋白一樣，具有較低的相對分子質(zhì)量和兩個EF-手型鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域[4]，以共價二聚體的形式存在，蛋白由兩個EF手型結(jié)構(gòu)組成，EF手型結(jié)構(gòu)又由具有高親和性和選擇性結(jié)合于鈣離子的螺旋-環(huán)-螺旋配基組成，兩側(cè)為疏水區(qū)，中央為鉸鏈區(qū)[5]。N端由14個氨基酸組成，呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，與鈣離子的親和性低，C端則通常由12個氨基酸組成，并與鈣離子具有較高的親和性[6]。S100A12正常表達于中性粒細胞，同時在淋巴細胞、單核細胞中有低豐度表達[7]。當與鈣離子結(jié)合后，S100A12蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出與靶蛋白的結(jié)合位點，進而通過與相應的靶蛋白作用發(fā)揮其生物學效應。因此，S100蛋白被認為是一種鈣傳感器蛋白，通過鈣離子信號傳導途徑在細胞增殖、分化、肌肉收縮、基因表達、分泌及細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[8]。S100A12具有上調(diào)內(nèi)皮細胞黏附分子、活化炎性細胞、趨化特性和抗菌活性等功能 [9]。S100A12與RAGE結(jié)合后通過NF-kB和MAP激酶信號通路直接引起內(nèi)皮細胞、單核吞噬細胞和淋巴細胞活化，結(jié)果導致促炎細胞因子的合成和分泌[10]，在機體的免疫反應和炎癥反應中發(fā)揮重要作用。

本研究以奶牛外周血白細胞為材料，應用RT-PCR技術獲得了S100A12基因，擬通過分子克隆和生物信息學分析，為深入研究奶牛乳房炎抗性的分子機理提供重要的線索，為基因診斷、抗性育種提供新的資料。并應用RT-PCR技術檢測了奶牛乳腺和生殖系統(tǒng)（卵巢、輸卵管、子宮頸、子宮體、陰道等組織）中S100A12 mRNA的表達分布，為探索控制奶牛乳房炎抗性的分子遺傳機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物及樣品采集 成年4～5歲健康奶牛，由四川省雅安市雨城區(qū)多營屠宰場提供。屠宰前頸靜脈無菌采血10 mL，4 000 r/min常溫離心10 min，移液槍小心吸取中間白細胞層置于5 mL RNA store樣品保存液中混勻，4 ℃保存。屠宰后，立即采集乳腺、陰道、子宮頸、子宮體、輸卵管和卵巢等組織，分別剪成小塊，用RNA store 4 ℃浸泡過夜后-20 ℃冷凍保存?；既榉垦啄膛５娜橄俳M織由四川農(nóng)業(yè)大學傳染病實驗室自存。

1.1.2 菌株、克隆載體及試劑 克隆宿主菌E.coli DH5α、RNA store樣品保存液、RNA simple總RNA抽提試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA Marker均為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；pMDTM19-T Simple Vector、TaKaRa Prime Script RT-PCR Kit、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamH I為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)GenBank中已有的牛S100A12基因序列（NM_174651）以及酶切位點，借助計算機軟件Oligo6.0Primer primer 5.0設計了一對引物，上游引物P1：5′-CCGGATCCACTAAGCTGGAAGATCACCTGGAGG-3′；下游引物P2：5′- CCAAGCTTTACTCTTTG TGGATATCTATGTGGGCTG-3′，5′端分別添加BamH I、Hind Ⅲ酶切位點（下劃線部分）；由上海英俊生物技術有限公司合成。

1.2.2 中國荷斯坦奶牛外周血總RNA的抽提 取20 mL外周血，按總RNA抽提試劑盒說明書提取各組織總RNA。

1.2.3 RT-PCR反應和cDNA擴增 參照TaKaRa Prime Script RT-PCR Kit說明書操作合成cDNA第一鏈。RT反應體系包括10 mmol/L dNTP Mixture 1 μL，Oligo dT Primer（2.5 μmol/L）1 μL，總RNA 2.5 μL，RNase Free ddH2O補至10 μL，在PCR儀上進行變性、退火反應（65 ℃ 5 min）。然后在上述Microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應液：5×PrimeScriptTM Buffer 4 μL，RNase Inhibitor （40 U/μL） 0.5 μL，PrimeScriptTM RTase（for 2 step） 0.5 μL，RNase Free ddH2O 5 μL，在PCR儀上按42 ℃ 30 min退火延伸，95 ℃ 5 min使反轉(zhuǎn)錄酶失活，4 ℃保存，合成cDNA第一鏈。PCR擴增S100A12基因采用20 μL體系：上述的RT反應液1 μL，dNTP Mixture （10 mmol/L） 10 μL，上、下游PCR引物各1 μL，RNase Free ddH2O 7 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃保持10 min；4 ℃保存。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

1.2.4 PCR產(chǎn)物與pMD19-T Simple載體的連接 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化后，與載體連接。按pMD19-T Simple載體試劑盒說明書操作，反應體系10 μL：Solution 5 μL，pMDl9-T Simple載體1 μL，PCR純化產(chǎn)物3 μL，無菌ddH2O補足至10 μL，混勻后16 ℃連接30 min，連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α。

1.2.5 酶切鑒定及測序 挑取單個白色菌落，接種于5 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振搖培養(yǎng)過夜，抽提質(zhì)粒經(jīng)BamH I+Hind Ⅲ雙酶切，鑒定正確的質(zhì)粒送上海英駿生物技術有限公司測序，測得序列用DNAStar軟件進行序列分析并用Blast進行同源性比較。

1.2.6 S100A12在奶牛乳腺和生殖系統(tǒng)中的表達分析 取凍存的健康奶牛乳腺、卵巢、輸卵管、子宮頸、子宮體、陰道和患乳房炎奶牛乳腺組織各100 mg，分別提取總RNA，進行RT-PCR反應，瓊脂糖凝膠電泳檢測，方法同“1.2.2”與“1.2.3”。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛S100A12基因的克隆及重組質(zhì)粒的酶切鑒定

RT-PCR擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，在287 bp處均出現(xiàn)一條DNA條帶，與預期的產(chǎn)物長度吻合（圖1A），表明本試驗成功地完成了總RNA的抽提與S100A12 cDNA的RT-PCR擴增。陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)Hind Ⅲ+BamH I雙酶切鑒定，獲得約2 700 bp（T克隆載體）與287 bp的DNA條帶（圖1 B）。結(jié)果與預期的片段大小相符，證實目的片段已插入T-載體。

2.2 DNA序列分析

將陽性克隆質(zhì)粒的測序結(jié)果用Blast進行同源性比較，與GenBank中的奶牛S100A12基因編碼區(qū)序列100%相同，包含279 bp（除去內(nèi)含子）的S100A12基因完整開放閱讀框（ORF），推導該序列編碼92個氨基酸（圖2）。表明克隆所獲得的基因片段為預期的奶牛S100A12序列。

奶牛S100A12基因與其他哺乳動物S100基因序列同源性的比較結(jié)果（表1）顯示，奶牛S100A12基因與豬S100A12基因的同源性最高，為85.7%，其次是猿猴和人，其同源性分別為77.5%、77.2%。對比發(fā)現(xiàn)，奶牛S100A12基因除了與奶牛S100A9、S100A4、S100A2基因的同源性較高（同源性分別為61.2%、59.5%、59.2%）以外，與奶牛其他S100基因同源性都不高，其中與奶牛S100A11基因的同源性最低（29.4%）。

奶牛S100A12基因與人及其他哺乳動物S100 cDNA全序列的生物進化樹分析結(jié)果（圖3）顯示，奶牛S100A12基因與人、猿猴S100A12基因親緣關系最近，三者構(gòu)成親緣關系相近的一個分支；其次親緣關系較近的是豬S100A12基因；另外與奶牛S100A8基因的親緣關系也比較近，構(gòu)成了一個較小的分支。

利用ExPASy的ProtParam軟件分析，相對分子質(zhì)量為10 575，理論等電點為5.67，利用蛋白質(zhì)功能位點數(shù)據(jù)庫PROSITE對奶牛S100A12基因編碼氨基酸進行結(jié)構(gòu)功能域分析發(fā)現(xiàn)，在49-84位氨基酸之間存在一個EF手型結(jié)構(gòu)；另外，還預測到3個蛋白激酶C磷酸化位點，分別位于19-21、44-46和70-73氨基酸殘基（圖2）。

2.3 S100A12在奶牛乳腺和生殖器官中的表達

從奶牛乳腺和生殖器官（輸卵管、卵巢、子宮頸、子宮體、陰道）組織中擴增出了S100A12基因（圖4），表明S100A12基因在奶牛的輸卵管、卵巢、子宮頸、子宮體、陰道和乳腺中均有表達。

3 討論

奶牛乳房炎抗性是一個極為復雜的功能。長期以來，雖然對奶牛乳房炎抗性的機理進行了大量研究，但是迄今為止對有關乳房炎抗性的分子機理并不十分清楚，因此進一步篩選和克隆與乳房炎抗性相關的基因并進行基因功能分析對深入了解乳房炎抗性的分子機理具有重要的意義[11]。

Lutzow等[12]通過轉(zhuǎn)錄分析牛奶中基因表達的變化，用不同劑量金黃色葡萄球菌感染3頭奶牛乳房不同乳區(qū)，發(fā)現(xiàn)乳腺組織中S100A12基因表達加強，在感染乳區(qū)的牛奶中該基因所表達的蛋白質(zhì)水平顯著（P<0.01）提高。Mitterhuemer等[13]將大腸桿菌灌入奶牛乳房后發(fā)現(xiàn)，感染乳區(qū)和相鄰未感染乳區(qū)牛奶中S100A12蛋白含量分別比正常牛奶中該蛋白含量高出110倍、4倍。運用蛋白質(zhì)組學方法，Smolenski等[14]確定了S100鈣結(jié)合蛋白3個家庭成員（S100A12、S100A11、S100A9）存在于患乳房炎奶牛的牛奶中，但在泌乳高峰期的牛奶或初乳中并沒有發(fā)現(xiàn)這3種蛋白。據(jù)此推測，牛奶中存在的天然免疫蛋白可能決定了乳腺組織的敏感度及抗感染能力。Lippolis等[15]在奶牛嗜中性粒細胞中鑒定出了包括鈣結(jié)合蛋白S100A12、S100A9在內(nèi)的250個蛋白，并將S100A12、S100A9歸類到具有抗菌活性的免疫蛋白組中。曹隨忠[11]利用反向Northern斑點雜交技術對健康奶牛和患乳房炎奶牛外周血液白細胞中差異基因進行了篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S100A12基因出現(xiàn)的頻率最高，據(jù)此推測S100A12蛋白可能在奶牛防御乳房炎病原菌感染中發(fā)揮重要作用。周雷[16]利用半定量RT-PCR技術檢測健康奶牛與患乳房炎奶牛外周白細胞中基因表達情況發(fā)現(xiàn)，S100A12等4種基因在奶牛乳房炎時高度表達。充足的證據(jù)表明，白細胞在奶牛乳腺免疫中發(fā)揮著關鍵作用，奶牛乳房炎的發(fā)生與奶牛乳腺免疫密切相關，研究患乳房炎奶牛與健康奶牛血液白細胞中基因的差異表達可能是鑒定乳房炎抗性相關基因的關鍵[11]。

本研究中克隆的奶牛S100A12基因編碼92個氨基酸，其cDNA序列與人、豬、猿猴和奶牛其他S100基因進化樹的分析結(jié)果顯示，奶牛與人、豬、猿猴S100A12基因親緣關系比較近，說明S100A12基因的表達具有種屬特異性。奶牛、人、豬、猿猴S100A12基因與奶牛S100A8基因之間的關系也較近，形成了1個小的分支。

細胞外S100A12蛋白可以促發(fā)多種信號傳導途徑，包括磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）、蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）、鈣離子流出、鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ、絲裂原激活蛋白激酶的激酶（MEK）等途徑，人類S100A12的表達需要PKC的激活[17]。在LPS刺激下能激活PKC并能引起S100A12蛋白的分泌[18]。經(jīng)生物信息學分析預測發(fā)現(xiàn)S100A12基因的編碼蛋白中含有3個PKC磷酸化位點（圖2）。因此，PKC可能在奶牛S100A12 mRNA和蛋白水平上提供基本的開關作用。PKC和蛋白激酶A（PKA）以及Ca2+有助于哺乳動物肝臟、單核細胞和海馬神經(jīng)細胞對C/EBPb mRNA的表達[19]。鈣離子作為一種普遍的第二信使在很多細胞信號轉(zhuǎn)導途徑中發(fā)揮著重要的作用，在細胞內(nèi)，有許多鈣結(jié)合蛋白將這種信號再轉(zhuǎn)變成為瞬時信號從而產(chǎn)生一系列的生化反應。這類鈣結(jié)合蛋白家族都具有一種鈣結(jié)合區(qū)域即EF手型結(jié)構(gòu)（EF-hand），每個EF-hand結(jié)構(gòu)包括含E、F兩段螺旋，并形成螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)[5]。本研究通過生物信息學發(fā)現(xiàn)S100A12基因編碼的蛋白中含有一個EF手型結(jié)構(gòu)（位于49-84氨基酸殘基）。

由于乳腺和生殖系統(tǒng)的特殊生理功能，上皮組織是構(gòu)成乳腺和整個生殖道防御外界病原微生物的主要屏障，決定了以中性粒細胞為主要組成的先天性免疫防御系統(tǒng)抵御病原微生物入侵的重要地位，而S100A12是中性粒細胞中的關鍵分子[3]，在發(fā)生炎癥時顯著表達。本試驗發(fā)現(xiàn)，S100A12在奶牛輸卵管、卵巢、子宮頸、子宮體、陰道、乳腺中均有表達。筆者推測S100A12可能通過募集中性粒細胞來擴大炎癥反應，這種基因在抵御乳房炎方面起著重要的作用。

不同生理狀態(tài)下的S100A12基因在乳腺和生殖系統(tǒng)中的表達不同，炎癥時表達量顯著增高。Buhimschi等[20]運用蛋白質(zhì)組技術對羊水的研究表明，鈣粒蛋白C在內(nèi)的4個生物分子可用于檢測子宮內(nèi)感染炎癥的狀態(tài)。Wathes等[21]研究證實，奶牛在產(chǎn)后2周內(nèi)，子宮中S100A12、S100A8、S100A9等抗性基因明顯上調(diào)。Buhimschi等[22，23]首次通過SELDL-TOF質(zhì)譜技術證實了S100A12和S100A8在懷孕和未孕婦女子宮頸中的存在，并推測生物標記的S100A8和S100A12是子宮頸陰道分泌物的組成部分，參與機體的防御系統(tǒng)，很可能對上行性感染提供持久保護。楊永新等[24]研究發(fā)現(xiàn)鈣粒蛋白C類似物在臨床型乳房炎奶牛乳腺組織中表達量增加，據(jù)此推測，鈣粒蛋白C類似物也具有活化吞噬細胞遷移到組織炎癥位點的作用。Buitenhuis等[25]對兩頭奶牛乳腺人工感染大腸桿菌24 h后基因表達分析得知，相對于健康奶牛乳腺組織，其S100A2、S100A8、S100A9和S100A12四種基因重復上調(diào)。

在本試驗中，S100A12在奶牛乳腺和生殖系統(tǒng)中廣泛表達，與其參與乳腺和生殖系統(tǒng)天然免疫防御密切相關，推測其在抵御奶牛乳腺和生殖系統(tǒng)感染中起著至關重要的作用。

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