黃 雪謝裕安 楊 帆 駱 敏 趙文潔

作者單位：530021 南寧 廣西腫瘤防治研究所實(shí)驗(yàn)研究部；△廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

基礎(chǔ)研究

PRX2和AKR1B10在二階段化學(xué)誘發(fā)小鼠肝癌形成過程中的表達(dá)及意義

黃 雪△謝裕安 楊 帆 駱 敏 趙文潔

作者單位：530021 南寧 廣西腫瘤防治研究所實(shí)驗(yàn)研究部；△廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

目的 探討PRX2和AKR1B10在二階段化學(xué)誘發(fā)小鼠肝癌形成過程中的表達(dá)及意義。方法 90只C57BL/6J雄性小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（60只）和正常對(duì)照組（30只），用DEN/CCl4/乙醇誘發(fā)小鼠肝癌。于第4周、第8周、第12周、第16周和第20周5個(gè)時(shí)點(diǎn)處死小鼠，觀察其肝臟病理組織的改變，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、免疫組化SP法分別檢測(cè)小鼠肝組織PRX2 mRNA和AKR1B10 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。結(jié)果 ①實(shí)驗(yàn)誘發(fā)小鼠肝癌過程中的第4周見肝細(xì)胞腫脹，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝臟呈炎癥病變；第8周見肝組織炎癥病變加重，出現(xiàn)纖維組織增生及肝細(xì)胞再生；第12周見肝組織呈不典型增生；第16周有典型假小葉形成；第20周可見典型的小鼠肝癌病理改變。②化學(xué)誘癌的第4周至第20周實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織PRX2 mRNA和AKR1B10 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)均高于正常對(duì)照組（P＜0.05），且兩者的表達(dá)水平隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，均呈逐步升高的趨勢(shì)；至第20周肝癌形成時(shí)，實(shí)驗(yàn)組兩者的表達(dá)均顯著高于癌前各時(shí)間點(diǎn)（P＜0.05）。③在二階段化學(xué)誘發(fā)小鼠肝癌形成過程中，PRX2 mRNA和AKR1B10 mRNA的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.674，P=0.05）。結(jié)論 在二階段化學(xué)誘發(fā)小鼠肝癌形成過程中PRX2和AKR1B10的高表達(dá)是化學(xué)誘發(fā)小鼠肝癌形成的早期事件，PRX2和AKR1B10可能在化學(xué)誘發(fā)小鼠肝癌的發(fā)生、發(fā)展和促進(jìn)過程中起重要作用。

肝腫瘤；小鼠肝癌；C57BL/6J小鼠；PRX2；AKR1B10

肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率僅次于肺癌和胃癌，位于第三位［1］。肝癌的發(fā)生歷經(jīng)啟動(dòng)、促進(jìn)、癌變和進(jìn)展的過程，聯(lián)合應(yīng)用化學(xué)誘癌劑和致癌劑可建立小鼠肝癌類似的二階段過程（激發(fā)期和促進(jìn)期）。PRX2是新發(fā)現(xiàn)的過氧化物還原酶，具有抗氧化、參與細(xì)胞的增殖和分化及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等作用。AKR1B10是一種醛糖還原酶，其通過調(diào)節(jié)脂肪代謝和消除羰基而促進(jìn)細(xì)胞生存，調(diào)節(jié)維甲酸信號(hào)通路參與腫瘤的增殖和發(fā)展。兩者在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)。有學(xué)者利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，PRX2和AKR1B10是與肝癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的差異表達(dá)蛋白，在大鼠和人肝癌組織中的表達(dá)明顯增高［2～4］。但在小鼠肝癌模型中未見報(bào)道，故本研究應(yīng)用跨種屬篩選腫瘤關(guān)鍵基因策略驗(yàn)證PRX2和AKR1B10在DEN/CCl4/乙醇誘發(fā)的二階段化學(xué)誘發(fā)小鼠肝癌形成過程中的差異表達(dá)，旨在探討PRX2和AKR1B10在二階段化學(xué)誘發(fā)小鼠肝癌形成過程中的表達(dá)及意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

二乙基亞硝胺（DEN）購自美國Sigma公司；四氯化碳（CCl4）購自天津化學(xué)試劑研究所；乙醇、橄欖油和福爾馬林均購自北京化學(xué)試劑公司；蘇木精、伊紅為上?；瘜W(xué)試劑廠產(chǎn)品?？俁NA提取試劑Trizol為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；M-MuLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒為加拿大 MBI Fermentas公司產(chǎn)品；RealMaster Mix（SYBR Green）為TAKARA公司產(chǎn)品；一抗兔抗鼠PRX2單克隆抗體、兔抗鼠AKR1B10多克隆抗體、免疫組化SP試劑盒和DAB顯色液均購自美國Abgent公司；定量PCR儀為美國MJR公司產(chǎn)品；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 二階段小鼠肝癌模型的建立

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過廣西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（湘）2009-0004，90只C57BL/6J雄性小鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，符合國標(biāo)GB14922-94 SPF級(jí)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。小鼠鼠齡為6～8周，分籠飼養(yǎng)，體重為20～23 g，標(biāo)準(zhǔn)化光照和自由進(jìn)食及飲水，適應(yīng)環(huán)境7 d。將動(dòng)物按體重隨機(jī)分為兩組，即實(shí)驗(yàn)組60只和正常對(duì)照組30只。實(shí)驗(yàn)組小鼠首先用DEN（100 mg/kg）一次腹腔注射，第2周再予腹腔注射一次DEN（100 mg/kg），第3周后開始以20%CCl4橄欖油溶液（0.05 ml/10 g）灌胃，2次/周，同時(shí)給予含10%乙醇水溶液連續(xù)飲用，第8周將CCl4加量至0.06 ml/10 g，第18周后停止給予CCl4和乙醇，繼續(xù)觀察到第20周實(shí)驗(yàn)結(jié)束，實(shí)驗(yàn)期間小鼠喂以顆粒飼料。正常對(duì)照組小鼠僅以小鼠顆粒飼料喂養(yǎng)，并自由飲用滅菌飲用水。觀察小鼠的背毛、精神飲食和體重等一般情況的改變。于誘癌開始后每4周從實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中隨機(jī)各抽取6只小鼠，打開腹腔觀察肝臟表面及色澤，并摘取肝臟組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。連續(xù)觀察20周后處死所有小鼠。

1.3 免疫組化法檢測(cè)

小鼠肝組織常規(guī)固定、石蠟包埋、切片、HE染色。免疫組化法按SP試劑盒說明書進(jìn)行，PRX2和AKR1B10一抗抗體滴度分別為1∶100、1∶300。組織標(biāo)本石蠟切片常規(guī)脫蠟去水；以檸檬酸緩沖液行高壓抗原修復(fù)；一抗4°C培養(yǎng)過夜；二抗37°C培養(yǎng)20 min，DAB顯色，蘇木精襯染后常規(guī)脫水、透明封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知陽性標(biāo)本作為陽性對(duì)照。以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為判斷標(biāo)準(zhǔn)。在不同高倍視野下計(jì)數(shù)上中下左右各200個(gè)細(xì)胞，染色強(qiáng)度判定為：0分為無染色；1分為弱染色；2分為中等強(qiáng)度染色；3分為強(qiáng)染色。陽性細(xì)胞率：0分為＜1%；1分為＜5%；2分為＜25%；3分為＜50%；4分為≥75%。以染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞率之和計(jì)算評(píng)分，0～1分為陰性（-）；2～3分為弱陽性（+）；4～5分為陽性（++）；6～7分為強(qiáng)陽性（+++）［5］。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

根據(jù)Genbank中PRX2和AKR1B10的mRNA序列設(shè)計(jì)特異性引物，以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）作為內(nèi)參照。見表1。取適量實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的肝組織，以傳統(tǒng)Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將cDNA1∶80稀釋后作為PCR模板。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)在美國MJR公司的定量PCR檢測(cè)儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系為20 μl，cDNA為1 μl，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μl，RealMaster Mix（SYBR Green）為12 μl，ddH2O為9 μl。反應(yīng)條件為94℃5 min，然后94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共35個(gè)循環(huán)。每份cDNA樣本均在相同反應(yīng)條件下進(jìn)行。每個(gè)樣本均平行重復(fù)檢測(cè)3次。由定量PCR儀采集熒光信號(hào)，電腦自動(dòng)分析熒光信號(hào)并顯示分析結(jié)果循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）和實(shí)時(shí)定量熒光值動(dòng)態(tài)曲線。目的基因的表達(dá)以β-actin作內(nèi)對(duì)照，采用2-△△Ct方法［6］分析比較目的基因在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組肝組織中的表達(dá)差異。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。若各組數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布、方差齊，則以s表示。計(jì)量資料的比較采用兩個(gè)樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，兩個(gè)因素的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物序列以及產(chǎn)物長(zhǎng)度

2 結(jié)果

2.1 誘癌過程中小鼠肝臟的病理組織變化

實(shí)驗(yàn)成功建立了二階段化學(xué)誘發(fā)小鼠肝癌模型。在誘癌過程中，實(shí)驗(yàn)組60只小鼠在第16周和第20周各死亡2只，死亡率為6.7%（4/60），對(duì)照組30只無死亡，至第20周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)小鼠成瘤率為76.4%（26/34）。對(duì)照組小鼠肝臟表面光滑，色澤鮮艷，質(zhì)軟，顯微鏡下肝組織未見異常。實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟病變表現(xiàn)為：在誘癌的第4周（肝炎期）肝臟表面外觀未見異常，顯微鏡下見肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，肝竇擴(kuò)張，肝細(xì)胞變性腫脹，炎癥反應(yīng)性細(xì)胞浸潤(rùn)；第8周（肝纖維化期）炎癥反應(yīng)加重，顯微鏡下肝小葉結(jié)構(gòu)尚完整，出現(xiàn)纖維組織增生及肝組織再生；第12周（不典型增生期）小鼠肝臟表面開始變?yōu)榇植冢螕p傷繼續(xù)加重，顯微鏡下肝細(xì)胞開始出現(xiàn)非典型增生；第16周（肝硬化期）小鼠肝臟表面變?yōu)楦植?，出現(xiàn)直徑＜5 mm的灰白色類圓形病灶，顯微鏡下肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝組織分隔成大小不一的結(jié)節(jié)狀，呈現(xiàn)典型的假小葉形成；第20周（肝癌形成期）肝臟表面出現(xiàn)大小不一的灰白色結(jié)節(jié)，直徑為2～10 mm。顯微鏡下出現(xiàn)肝癌細(xì)胞，肝細(xì)胞體積增大，呈多形性，細(xì)胞核大且深染，核質(zhì)比增大，核仁顯著，可見病理性核分裂相。見圖1。

2.2 PRX2和AKR1B10的蛋白表達(dá)分析

圖1 不同誘癌時(shí)期小鼠肝組織表面觀和顯微鏡下觀察

PRX2和AKR1B10的蛋白陽性表達(dá)均定位于細(xì)胞質(zhì)，主要沿匯管區(qū)和血管附近表達(dá)，在肝癌組織內(nèi)可見PRX2和AKR1B10陽性細(xì)胞呈點(diǎn)狀、彌漫性分布，在癌周肝硬化組織及異性增生性結(jié)節(jié)內(nèi)可見散在、灶狀及結(jié)節(jié)狀PRX2和AKR1B10陽性細(xì)胞分布。正常對(duì)照組小鼠肝組織中PRX2和AKR1B10為陰性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組隨著小鼠肝臟由炎癥、肝纖維化、肝硬化，直至肝癌病變過程中，PRX2和AKR1B10的表達(dá)逐漸增加。在第4周至第8周的實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織中PRX2和AKR1B10的蛋白表達(dá)均為弱陽性；第12周實(shí)驗(yàn)組小鼠2只肝組織PRX2的表達(dá)呈弱陽性，4只為陽性，AKR1B10的蛋白表達(dá)均為陽性；第16周實(shí)驗(yàn)組小鼠5只肝組織中PRX2的蛋白表達(dá)呈陽性，1只為強(qiáng)陽性，4只小鼠AKR1B10的蛋白表達(dá)呈陽性，2只為強(qiáng)陽性；第20周46.9%（15/32）的小鼠肝組織中PRX2的蛋白表達(dá)呈強(qiáng)陽性，62.5%（20/32）的小鼠肝組織中AKR1B10的蛋白表達(dá)呈強(qiáng)陽性。見圖2。

圖2 不同誘癌時(shí)期小鼠肝組織PRX2和AKR1B10蛋白表達(dá)的水平（DAB×400）

2.3 PRX2 mRNA和AKR1B10 mRNA的表達(dá)分析

化學(xué)誘癌第4周至第20周實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織PRX2 mRNA和AKR1B10 mRNA均呈高表達(dá)，隨著誘癌時(shí)間的延長(zhǎng)，PRX2 mRNA和AKR1B10 mRNA的表達(dá)水平呈同步持續(xù)升高，在第20周時(shí)PRX2 mRNA和AKR1B10 mRNA的表達(dá)均達(dá)到最高水平，和對(duì)照組比較差異尤為顯著。在第4周至第12周實(shí)驗(yàn)組之間PRX2 mRNA的差異表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在第16周和第12周的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第20周的表達(dá)明顯高于第16周，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；AKR1B10 mRNA在各個(gè)誘癌時(shí)間段實(shí)驗(yàn)組之間的差異表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在二階段化學(xué)誘發(fā)小鼠肝癌形成過程中PRX2 mRNA和AKR1B10 mRNA的表達(dá)水平呈明顯正相關(guān)（r=0.674，P=0.05）。見表2。

表2 不同誘癌時(shí)期小鼠肝臟PRX2 mRNA和AKR1B10 mRNA的表達(dá)水平（χ±s）

3 討論

PRX2定位于細(xì)胞質(zhì)，其功能主要是抗氧化和清除自由基，保護(hù)癌細(xì)胞免受自由基的損傷，進(jìn)而刺激細(xì)胞增殖，并抑制細(xì)胞凋亡。AKR1B10是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可溶性的單體氧化還原酶，其通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)羰基的解毒、介導(dǎo)視黃醛的代謝及調(diào)節(jié)脂肪酸合成，從而促進(jìn)細(xì)胞生存。研究表明，該蛋白主要存在于肝癌和胚胎肝中，在正常成年肝臟中不表達(dá)。兩者與腫瘤的關(guān)系日益密切，目前已有PRX2在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)升高的報(bào)道。在肝癌的報(bào)道中，繼Fella等［2］通過建立大鼠肝癌模型發(fā)現(xiàn)PRX2在大鼠肝癌組織的表達(dá)升高之后，Takashima等［3］也發(fā)現(xiàn)PRX2在人肝癌組織中呈高表達(dá)。岳海英等［7］發(fā)現(xiàn)PRX2基因表達(dá)沉默后的人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和克隆形成能力均明顯受到抑制，細(xì)胞凋亡率增加。AKR1B10在人體的過表達(dá)最早發(fā)現(xiàn)于肝癌［4］。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，AKR1B10在54.0%的肝細(xì)胞癌、84.4%的肺鱗狀細(xì)胞癌、29.2%的肺腺癌吸煙者中呈高表達(dá)，有望作為腫瘤診斷和（或）預(yù)后標(biāo)志［8］。Sato等［9］在慢性丙型肝炎至肝癌的研究表明，AKR1B10不僅是預(yù)測(cè)肝癌的標(biāo)志，在肝癌的早期階段也發(fā)揮了重要作用。韋薇等［10］研究結(jié)果表明肝癌細(xì)胞中AKR1B10的表達(dá)被抑制后，其增殖相關(guān)基因的表達(dá)下降，而促凋亡基因的表達(dá)上升，提示可能通過影響相關(guān)基因的表達(dá)參與調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡。Li等［11］應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選出PRX2和AKR1B10作為肝癌發(fā)生的差異表達(dá)蛋白之一，并研究發(fā)現(xiàn)PRX2和AKR1B10在人肝癌組織中的表達(dá)為正常對(duì)照組、癌旁組織和肝癌組織依次上調(diào)。

在本研究中，我們成功應(yīng)用DEN/CCl4/乙醇誘發(fā)小鼠肝癌模型，在小鼠誘癌過程中不同階段的病理組織變化與人肝癌發(fā)生過程比較相似，均經(jīng)歷了從肝損傷、肝纖維化、非典型增生到肝癌的病理變化過程［12］，與其他研究相比，該模型更為全面地觀察了PRX2和AKR1B10在肝癌形成過程中的差異表達(dá)，這是研究人類肝癌發(fā)生、發(fā)展較好的一種動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)在正常對(duì)照組小鼠肝組織中PRX2和AKR1B10的蛋白不表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組小鼠在誘癌的第4周，由于肝臟細(xì)胞受到大劑量DEN的刺激，出現(xiàn)藥物中毒性損傷，肝組織表現(xiàn)為充血水腫、變性壞死的炎性病變，小鼠肝組織中PRX2和AKR1B10的基因表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組，提示PRX2和AKR1B10可能影響化學(xué)誘發(fā)小鼠肝癌的發(fā)生。CCl4自身溶酶的作用可以引起肝損傷，激活肝星狀細(xì)胞而造成肝纖維化。長(zhǎng)期給予乙醇也可造成肝損傷，包括脂肪肝、肝纖維化和肝癌等。所以在CCl4/乙醇長(zhǎng)期聯(lián)合刺激的作用下，至誘癌的第8周至第16周，小鼠肝組織炎性變性加重，隨著肝纖維化、假小葉的形成，PRX2和AKR1B10呈持續(xù)高表達(dá)，說明PRX2和AKR1B10可能參與小鼠肝癌的形成。至誘癌的第20周，當(dāng)小鼠肝臟出現(xiàn)癌結(jié)節(jié)之后，PRX2和AKR1B10的表達(dá)水平達(dá)高峰，實(shí)驗(yàn)組兩者的表達(dá)第4周至第16周均明顯高于對(duì)照組的表達(dá)，提示PRX2和AKR1B10的高表達(dá)可能參與小鼠肝癌的發(fā)展。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)PRX2mRNA和AKR1B10 mRNA在小鼠肝癌發(fā)生過程中的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.674，P=0.05）。

綜上所述，本研究顯示在二階段化學(xué)誘發(fā)小鼠肝癌形成過程中PRX2和AKR1B10呈高表達(dá)，這是化學(xué)誘發(fā)小鼠肝癌形成的早期事件。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果與PRX2和AKR1B10在人、大鼠肝癌中呈高表達(dá)的結(jié)果基本一致，提示二者可能參與化學(xué)誘發(fā)小鼠肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程。但PRX2和AKR1B10之間的協(xié)同作用機(jī)制尚不清楚，其是否可以成為早期診斷肝癌新的分子標(biāo)志物或防治靶標(biāo)，有待進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

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［2014-03-21收稿］［2014-05-06修回］［編輯 阮萃才］

Expression and significance of PRX2 and AKR1B10 during chemically induced hepatocarcinogenesis in mice

HUANG Xue△，XIE Yu-an，YANG Fan，LUO Min，ZHAO Wen-jie（Department of Research，Guangxi Cancer Institute；△Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning，530021，P.R.China）
Corresponding auther：XIE Yu-an.E-mail：gxwskj@163.com

Objective To explore the expression and significance of PRX2 and AKR1B10 during chemically induced hepatocarcinogenesis in mice.Methods Primary hepatocellular carcinoma（HCC）was induced in 60 C57BL/6J mice by exposing them to a combination of diethylnitrosamines（DEN），carbon tetrachloride（CCl4）and ethanol.Another group of 30 mice

no drugs and served as a negative control.Mice were killed on weeks 4，8，12，16 and 20 and tissue samples were harvested for staining with hematoxylin and eosin.Samples were also analyzed by QPT-PCR and immunohistochemistry to detect changes in PRX2 and AKR1B10 mRNA and protein.Results In mice with chemically induced HCC，toxic hepatitis and acute hepatocellular necrosis were observed by week 4.By week 8，hepatocellular necrosis had gotten worse and liver fibrosis was detectable.Atypical hyperplasia was observable by week 12，pseudolobule by week 16 and hepatocellular carcinoma by week 20.Expression of PRX2 and AKR1B10 was significantly higher in the HCC animals than in control animals from week 4 to 20（P＜0.05），and levels continued to increasewith time.Levels were significantly higher in the HCC animals by week 20 than before chemical induction of HCC（P＜0.05）.Expression of PRX2 mRNA positively correlated with that of AKR1B10 mRNA（r=0.674，P=0.05）.Conclusion Overexpression of PRX2 and AKR1B10 may be early events during chemically induced hepatocarcinogenesis in mice and may promote hepatocarcinogenesis.

Liver neoplasm；Hepatocarcinogenesis in mice；C57BL/6J mice；PRX2；AKR1B10

R735.7

A

1674-5671（2014）02-06

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.02.03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81060203）【通信作者】謝裕安。E-mail：gxwskj@163.com