李傳偉 王雪迪 張 智 李東東 余國堂 徐 靜

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院；△廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科

臨床研究

FKBP12和FKBP52在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

李傳偉 王雪迪 張 智 李東東 余國堂 徐 靜△

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院；△廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科

目的 分析FKBP12和FKBP52在肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）組織中的表達(dá)，并探討其與HCC臨床病理因素的關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組化SP法檢測FKBP12和FKBP52在60例HCC組織、60例癌旁組織、10例肝血管瘤組織和10例正常肝組織中的表達(dá)水平，并結(jié)合臨床病理因素分析其臨床意義。結(jié)果 在HCC組織、癌旁組織、肝血管瘤組織和正常肝組織中FKBP12的陽性表達(dá)率分別為66.7%、30.0%、20.0%和40.0%，F(xiàn)KBP12在HCC組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織、肝血管瘤組織和正常肝組織中的表達(dá)（P均＜0.05）。在HCC組織、癌旁組織、肝血管瘤組織和正常肝組織中FKBP52的陽性表達(dá)率分別為63.3%、26.7%、40.0%和20.0%，F(xiàn)KBP52在HCC組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織和正常肝組織中的表達(dá)（P均＜0.05），與肝血管瘤組織中的表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。FKBP12和KBP52在HCC組織中的表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。FKBP12在HCC組織中的表達(dá)水平與患者年齡、性別、合并肝硬化和乙肝病毒感染無明顯關(guān)系（P均＞0.05），而與腫瘤直徑、病理分級和血清中AFP的水平有關(guān)（P均＜0.05）。FKBP52在HCC組織中的表達(dá)水平與患者年齡、性別、腫瘤直徑、合并肝硬化和血清中AFP的水平無明顯關(guān)系（P均＞0.05），而與病理分級、乙肝病毒感染有關(guān)（P均＜0.05）。結(jié)論 FKBP12和FKBP52的高表達(dá)與HCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。FKBP12可能參與HCC癌細(xì)胞的增殖以及分化過程，并且可能與HCC患者血清中AFP水平的升高有關(guān)；FKBP52可能參與HCC的分化過程，并且可能與乙肝病毒感染密切相關(guān)。

肝腫瘤；肝細(xì)胞癌；FKBP12；FKBP52；免疫組織化學(xué)

FKBP52和FKBP12同屬于FK506結(jié)合蛋白的家族，具有肽基脯氨酰順反異構(gòu)，其分子酶（PPIase）活性量分別為52kD和12kD。FKBP52N端結(jié)構(gòu)域（FKBP52-N，140個(gè)氨基酸）與FKBP12的序列同源性高達(dá)49%，可與FK506結(jié)合。FKBP12除了作為免疫抑制劑FK-506的受體參與免疫抑制功能之外，還具有順式/反式肽脯氨酸異構(gòu)酶（PPIase）活性、脫乙酰激酶（Deacetylase）活性［1］和伴侶樣蛋白的重折疊活性［2］，而且又可結(jié)合理阿諾堿（Ry）受體、三磷酸肌醇（IP3）受體和轉(zhuǎn)化生長因子受體（transforming growth factor receptor，TGFR）等，因而具有Ca2+通道調(diào)節(jié)和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等重要的生理功能［3～5］，這些FKBP12的生理作用對研究腫瘤血管形成的機(jī)制和腫瘤細(xì)胞的增殖過程提供了一個(gè)新的途徑。Liu等［6］的研究表明，F(xiàn)KBP52在小鼠肝組織和人肝癌組織以及血清中高表達(dá)。目前國內(nèi)外已有較多關(guān)于FKBP12和FKBP52在腫瘤組織中的表達(dá)及其相關(guān)研究的報(bào)道［7，8］，但在原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)研究仍較為缺乏，因此本研究旨在觀察和分析FKBP12和FKBP52在肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）組織中的表達(dá)水平，并探討其與HCC臨床病理因素的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

60例HCC組織標(biāo)本均為2011年9～12月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行肝腫瘤切除術(shù)獲得，取其癌組織及相應(yīng)癌旁組織（距離癌組織邊緣至少2 cm），所有病例均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)為HCC。其中男性50例，女性10例，年齡29～73歲，中位年齡51歲。另收集10例肝血管瘤組織標(biāo)本作為對照組，其中男性5例，女性5例。10例正常肝組織作為正常對照組。本研究所取的組織標(biāo)本均經(jīng)患者簽署知情同意書，并通過廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

免疫組化采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法（SP法），兔抗人FKBP12抗體和兔抗人FKBP52抗體均購自美國BD公司，SABC免疫組化染色試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。免疫組化染色的主要步驟：石蠟組織切片經(jīng)脫蠟水化后，用0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)抗原30 min，以山羊血清封閉20 min，F(xiàn)KBP12抗體和FKBP52抗體分別按1∶200和1∶400稀釋后，4℃保存過夜，羊抗兔二抗37℃孵育1 h，DAB顯色1 min，蘇木素復(fù)染，透明，干燥，封片。以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照，用已知的陽性切片作陽性對照。

1.3 結(jié)果判斷

采用人工計(jì)數(shù)法，由3名研究生根據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行獨(dú)立判定，細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色、棕黃色或棕褐色顆粒者為陽性細(xì)胞。陽性反應(yīng)強(qiáng)度的分級兼顧染色深淺和陽性細(xì)胞所占百分比，根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)［9］，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），每個(gè)視野數(shù)100個(gè)細(xì)胞，先按陽性細(xì)胞所占百分比評分：≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分；再按染色強(qiáng)度評分：不著色或者淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。最后將二者乘積數(shù)＞3定為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析和處理。計(jì)數(shù)資料的比較用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化SP法檢測FKBP12和FKBP52的表達(dá)

FKBP12在HCC組織中的表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)為主，呈棕黃色，陽性表達(dá)率為66.7%，在部分癌旁組織、肝血管瘤組織和正常肝組織中亦有少量表達(dá)，其陽性表達(dá)率分別為30.0%、20.0%和40.0%，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對FKBP12在HCC組織、癌旁組織、肝血管瘤組織和正常肝組織中的表達(dá)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示FKBP12在HCC組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織、肝血管瘤組織和正常肝組織中的表達(dá)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表1、圖1。

FKBP52在HCC組織中的表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)為主，呈棕黃色，其陽性表達(dá)率為63.3%，在部分癌旁組織、肝血管瘤組織和正常組織中也有少量表達(dá)，其表達(dá)率分別為26.7%、40.0%和20.0%，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對FKBP52在HCC組織、癌旁組織、肝血管瘤組織和正常肝組織中的表達(dá)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示FKBP52在HCC組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織和正常肝組織中的表達(dá)，兩組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），F(xiàn)KBP52在HCC組織中的表達(dá)高于肝血管瘤組織的表達(dá)，兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、圖1。

表1 FKBP12和FKBP52在HCC組織、癌旁組織、肝血管瘤組織和正常肝組織中的陽性表達(dá)情況［n（%）］

圖1 免疫組化SP法檢測FKBP12和FKBP52在HCC組織、癌旁組織、肝血管瘤組織和正常肝組織中的表達(dá)（SP×400）

2.2 FKBP12和FKBP52在HCC組織中表達(dá)的比較

FKBP12和FKBP52在HCC組織中均有較高的表達(dá)，F(xiàn)KBP12在HCC組織中的陽性表達(dá)率（66.7%）高于FKBP52在HCC組織中的陽性表達(dá)率（63.3%），兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 FKBP12和FKBP52在HCC組織中的陽性表達(dá)比較［n（%）］

2.3 FKBP12和FKBP52在HCC組織中的陽性表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

FKBP12在HCC組織中的陽性表達(dá)水平與患者年齡、性別、合并肝硬化、乙肝病毒感染無明顯關(guān)系（P均＞0.05）；而與腫瘤直徑、病理分級、血清中AFP的水平有關(guān)（P均＜0.05）。FKBP52在HCC組織中的陽性表達(dá)水平與患者年齡、性別、腫瘤直徑、合并肝硬化、血清中AFP的水平無明顯關(guān)系（P均＞0.05）；而與病理分級和乙肝病毒感染有密切關(guān)系（P均＜0.05）。見表3。

表3 FKBP12和FKBP52的陽性表達(dá)與患者臨床病理因素的關(guān)系

3 討論

HCC是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在所有癌癥中分別占第5位和第2位。目前關(guān)于HCC的發(fā)病機(jī)制尚未確定，但其發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素包括患者年齡、性別、飲食、煙酒、乙型病毒性肝炎、肝硬化和血清中AFP水平及遺傳易感因素等［10～12］。近年來隨著醫(yī)療技術(shù)水平的提高，HCC患者的5年生存率已達(dá)50%～70%，目前HCC主要的治療手段包括肝腫瘤切除術(shù)、肝介入治療術(shù)、射頻消融術(shù)以及肝移植等［13～15］。但是肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率仍然維持在較高的水平，因此研究并探討肝癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，并尋找新的肝癌治療靶點(diǎn)仍然是一項(xiàng)艱巨而迫在眉睫的任務(wù)。

Shou等［16］研究發(fā)現(xiàn)FKBP12缺陷的小鼠細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期G1期中，這些細(xì)胞能被轉(zhuǎn)染的FKBP12激活。FKBP12可抑制由TGF-βR信號的過度活動(dòng)引起的p21上調(diào)和細(xì)胞周期停滯。TGF-βR對基因表達(dá)的信號通過SMAD、p38和ERK/MAP激酶的途徑介導(dǎo)。SMAD的信號傳導(dǎo)在FKBP12缺陷細(xì)胞中下調(diào)。抑制ERK/MAP激酶不能導(dǎo)致p21上調(diào)。相反，在FKBP12缺陷細(xì)胞中氧化磷酸化的p38顯著地增加，而且p21上調(diào)可被p38的抑制劑阻止。因此在正常情況下FKBP12通過下調(diào)TGF-βR信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞生理周期。Higgins等［17］應(yīng)用CD31、CD34和FKBP12對59種血管瘤進(jìn)行免疫組化和Western blot分析，結(jié)果顯示，與CD31和CD34相比，F(xiàn)KBP12的相對敏感性為94.9%，特異性為96.5%，提示FKBP12在良惡性血管內(nèi)皮中表達(dá)豐富，并認(rèn)為FKBP12可作為血管或血管內(nèi)皮細(xì)胞鑒定的另一標(biāo)志物。腫瘤的增生和分化與腫瘤供血血管的增生和細(xì)胞周期有密切聯(lián)系，鑒于FKBP12在細(xì)胞周期和血管增生中的生物學(xué)特性，提示其可能在腫瘤的增生方面發(fā)揮重要作用。

本研究通過免疫組化SP法檢測FKPB12在HCC組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，HCC組織中FKBP12的陽性表達(dá)率高于癌旁組織、肝血管瘤組織和正常肝組織，差異比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），提示FKBP12可能參與HCC的發(fā)生，并且具有陽性表達(dá)的特異性，同時(shí)腫瘤直徑大的HCC組織FKBP12的表達(dá)率高；高分化的HCC組織FKBP12的表達(dá)水平亦高，提示FKBP12參與肝癌細(xì)胞的增殖和分化，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。血清中AFP水平的檢測有助于早期肝癌的診斷，本研究結(jié)果顯示血清中AFP水平高的HCC組織其FKBP12的表達(dá)水平也較高，提示FKBP12可能與血清中AFP水平的升高有關(guān)系，測定FKBP12的表達(dá)有助于HCC的診斷。

Kumar等［7］研究顯示FKBP52在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)高于正常乳腺組織，認(rèn)為FKBP52與乳腺癌細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。Lin等［8］研究證實(shí)FKBP52在前列腺癌組織中的表達(dá)高于前列腺增生組織，提示FKBP52與前列腺癌細(xì)胞的增殖有關(guān)。Liu等［6］的研究表明FKBP52在小鼠和人HCC組織和血清中高表達(dá)，認(rèn)為FKBP52與肝癌細(xì)胞的增殖和分化有關(guān)。以上這些研究均表明FKBP52與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示FKBP52在HCC中的表達(dá)明顯高于癌旁組織和正常肝組織中的表達(dá)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），從而進(jìn)一步證實(shí)了FKBP52的這一生物學(xué)特性。同時(shí)本研究結(jié)果顯示FKBP52的高表達(dá)與病理分級和乙肝病毒感染有關(guān)，高分化HCC組織其FKBP52的表達(dá)亦高，合并有乙肝感染的HCC患者，其癌組織FKBP52的表達(dá)水平高，提示FKBP52可能參與HCC的分化并且與乙肝病毒感染有關(guān)，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)

FKBP12和FKBP52的高表達(dá)與HCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。FKBP12可能參與腫瘤細(xì)胞的增殖及分化過程；FKBP12的表達(dá)可能與HCC患者血清中AFP的水平升高有關(guān)系。FKBP52可能與HCC的分化有關(guān)，并且與乙肝病毒感染有密切關(guān)系。針對FKBP12和FKBP52在HCC中的表達(dá)及其與臨床病理因素的關(guān)系，我們將采用蜂毒素等中藥單體干預(yù)并探討其對肝癌細(xì)胞株的影響，為中西醫(yī)結(jié)合治療HCC探索新的治療途徑。

［1］ Zohlnhofer D，Klein CA，Richter T，et al.Gene expression profiling of human stent-induced neointima by cDNA array analysis of microscopic specimens retrieved by helix cutter atherectomy：Detection of FK506-binding protein 12 upregulation［J］.Circulation，2001，103（10）：1396-1402.

［2］ Yano M，Ono K，Ohkusa T，et al.Altered stoichiometry of FKBP12.6 versus ryanodine receptor as a cause of abnormal Ca2+leak through ryanodine receptor in heart failure［J］.Circulation，2000，102（17）：2131-2136.

［3］ Chaube R，Hess DT，Wang YJ，et al.Regulation of the skeletal muscle ryanodine receptor/Ca2+-release channel RyR1 by S-Palmitoylation［J］.J Biol Chem，2014，289（12）：8612-8619.

［4］ MacMillan D.FK506 binding proteins：cellular regulators of intracellular Ca2+signalling［J］.Eur J Pharmacol，2013，700（1-3）：181-193.

［5］ Doi M，Yano M，Kobayashi S，et al.Propranolol prevents the development of heart failure by restoring FKBP12.6-mediated stabilizati on of ryanodine receptor［J］.Circulation，2002，105（11）：1374-1379.

［6］ Liu Y，Li C，Xing Z，et al.Proteomic mining in the dysplastic liver of WHV/c-myc mice-insights and indicators for early hepatocarcinogenesis［J］.FEBS J，2010，277（19）：4039-4053.

［7］ Kumar P，Mark PJ，Ward BK，et al.Estradiol-regulated expression of the immunophilins cyclophilin 40 and FKBP52 in MCF-7 breast cancer cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2001，284（1）：219-225.

［8］ Lin JF，Xu J，Tian HY，et al.Identification of candidate prostate cancer biomarkers in prostate needle biopsy specimens using proteomic analysis［J］.Int J Cancer，2007，121（12）：2596-2605.

［9］ 于 萍，步 宏，王 華，等.免疫組化結(jié)果的圖像分析與人工計(jì)數(shù)方法的對比研究［J］.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2003，20（2）：288-290.

［10］施純朝，薛 峰，孫延富，等.乙型肝炎肝硬化并發(fā)原發(fā)性肝癌的危險(xiǎn)因素［J］.實(shí)用癌癥雜志，2013，28（4）：399-401.

［11］孫麗紅.原發(fā)性肝癌飲食危險(xiǎn)因素的流行病學(xué)研究［J］.中國衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)，2010，27（3）：269-270，277.

［12］齊魯楠，彭 濤，苗志國，等.乙肝病毒/黃曲霉毒素雙暴露因素下肝癌13號染色體畸變以及RB1基因表達(dá)的初步研究［J］.中國癌癥防治雜志，2012，4（4）：307-311.

［13］Fan Qi，Wang X，Zhang H，et al.Silencing cathepsin S gene expression inhibits growth，invasion and angiogenesis of human hepatocellular carcinoma in vitro［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，425（4）：703-710.

［14］吳飛翔，王方為，馬 良，等.原發(fā)性肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)246例再治療的近期療效［J］.中國癌癥防治雜志，2012，4（2）：167-170.

［15］ Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

［16］ Shou W，Aghdasi B，Armstrong DL，et al.Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12［J］.Nature，1998，391（6666）：489-492.

［17］Higgins JP，Montgomery K，Wang L，et al.Expression of FKBP12 in benign and malignant vascular endothelium：an immunohistochemical study on conventional sections and tissue microarrays［J］.Am J Surg Pathol，2003，27（1）：58-64.

［2014-03-16收稿］［2014-04-30修回］［編輯 阮萃才］

Expression and clinical significance of FKBP12 and FKBP52 in primary hepatocellular carcinoma

LI Chuan-wei，WANG Xue-di，ZHANG Zhi，LI Dong-dong，YU Guo-tang，XU-Jing△（Graduate School of Guangxi Medical University；△Department of Hepatobiliary Surgery，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

XU Jing.E-mail：jxuapr@aliyun.com

Liver neoplasm；Hepatocellular carcinoma；FKBP12；FKBP52；Immunohistochemistry

R735.7

A

1674-5671（2014）02-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.02.08

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81360372）；廣西衛(wèi)生廳中醫(yī)藥管理局科研基金資助項(xiàng)目（GZKZ10-114）【通信作者】徐 靜。E-mail：jxuapr@aliyun.com

【Abstract】Objective To analyze the expression of FKBP12 and FKBP52 in hepatocellular carcinoma（HCC）and explore its relationship with clinicopathological factors.Methods Expression of FKBP12 and FKBP52 was measured in 60 samples of HCC tissue，60 samples of normal adjacent tissue，10 samples of hepatic hemangioma and 10 cases of normal liver tissue.Expression was analyzed using the immunohistochemical streptavidin-peroxidase method and correlated with clinicopathological factors.Results Expression of FKBP12 was detected in 66.7%of HCC samples，a rate significantly higher than the 30.0%of adjacent tissues，20.0%of liver hemangioma and 40.0%of normal liver tissues（P＜0.05）.The rate of FKBP52 expression was significantly higher in HCC tissues（63.3%）than in adjacent tissues（26.7%）and normal liver tissues（20.0%），but similar to the rate in liver hemangioma（40.0%）.Rates of FKBP12 and FKBP52 expression were similar in HCC tissues.There was no significant relationship between FKBP12 expression in HCC tissue and patient age，gender，cirrhosis，or hepatitis B virus infection，but expression was related to tumor size，pathology grade，and serum AFP level.There was no significant relationship between FKBP52 expression in HCC tissue and age，gender，tumor size，cirrhosis，or serum AFP level（P＞0.05），but expression was related to pathology grade and hepatitis B virus infection（P＜0.05）.Conclusion Expression of FKBP12 and FKBP52 correlate closely with incidence of HCC.FKBP12 may be involved in the proliferation and differentiation of tumor cells，and it may contribute to elevated serum AFP levels in liver cancer patients.FKBP52 may contribute to the differentiation of hepatocellular carcinoma and may participate in cellular processes in liver infected by hepatitis B virus.