DNA-PKcs在鉑類耐藥形成過程中的動態(tài)表達(dá)及臨床因素的相關(guān)性分析

石麗君李夢迪李 力 王 琪

作者單位：530021 南寧 廣西腫瘤防治研究所實驗研究部；廣西區(qū)域性高發(fā)腫瘤教育部重點實驗室；△廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

基礎(chǔ)研究

DNA-PKcs在鉑類耐藥形成過程中的動態(tài)表達(dá)及臨床因素的相關(guān)性分析

石麗君△李夢迪△李 力 王 琪

作者單位：530021 南寧 廣西腫瘤防治研究所實驗研究部；廣西區(qū)域性高發(fā)腫瘤教育部重點實驗室；△廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

目的 動態(tài)檢測裸鼠鉑類耐藥模型DNA依賴蛋白激酶催化亞單位（DNA-PKcs）在鉑類耐藥形成過程的變化，分析卵巢癌患者DNA-PKcs的表達(dá)水平與臨床因素的相關(guān)性，為腫瘤患者的個體化治療提供實驗依據(jù)。方法 以實時熒光定量PCR技術(shù)檢測DNA-PKcs mRNA的表達(dá)；Pearson相關(guān)分析卵巢癌患者DNA-PKcs的表達(dá)量與卵巢癌患者臨床因素的相關(guān)性，Kaplan-Meier法分析臨床因素及DNA-PKcs的表達(dá)對患者無疾病進展生存時間和總生存時間的影響；Cox回歸模型分析卵巢癌預(yù)后相關(guān)因素對患者生存的影響。結(jié)果 裸鼠體內(nèi)鉑類耐藥移植瘤DNA-PKcs的表達(dá)顯著低于鉑類敏感對照（P=0.003），鉑類敏感細(xì)胞在獲得性耐藥形成過程中DNA-PKcs的表達(dá)逐漸下降，耐藥細(xì)胞產(chǎn)生以后，DNAPKcs基因的表達(dá)始終在較低的水平。Pearson分析表明DNA-PKcs的表達(dá)與患者對鉑類藥物初始治療的反應(yīng)和鉑類耐藥的產(chǎn)生呈顯著負(fù)相關(guān)（P=0.000）。Kaplan-Meier法分析顯示，F(xiàn)IGO分期越早、無術(shù)后殘余病灶、對鉑類初次治療有效、鉑類治療敏感、DNA-PKcs高表達(dá)的患者的生存時間顯著延長（P＜0.05）。Cox回歸模型分析發(fā)現(xiàn)納入影響卵巢癌患者總生存時間的危險因素為鉑類初始治療反應(yīng)（P=0.047）和鉑類耐藥產(chǎn)生（P=0.047），鉑類藥物治療完全有效和部分有效患者的DNA-PKcs表達(dá)量顯著高于腫瘤無消退和腫瘤增長的兩組患者（P=0.000），鉑類敏感患者DNA-PKcs平均表達(dá)量顯著高于鉑類耐藥患者（P=0.000）。結(jié)論 DNA-PKcs的表達(dá)下降與鉑類耐藥形成相關(guān)，可能作為判斷卵巢癌鉑類耐藥產(chǎn)生的潛在標(biāo)志分子。

卵巢腫瘤；耐藥性，鉑類；DNA依賴蛋白激酶催化亞單位

卵巢癌是死亡率居首位的女性生殖道惡性腫瘤。雖經(jīng)過規(guī)范的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和以鉑類/紫杉醇為基礎(chǔ)的化療，但仍有70%的患者面臨復(fù)發(fā)或疾病進展，晚期患者的5年生存率不足40%。腫瘤細(xì)胞對于化療藥物產(chǎn)生耐藥性是影響患者預(yù)后的重要因素，臨床上對鉑類耐藥進行預(yù)測，對于指導(dǎo)患者的個體化治療和改善卵巢癌的預(yù)后具有重要意義。

DNA依賴蛋白激酶催化亞單位（DNA-PKcs）是DNA修復(fù)基因家族成員，研究表明，各種惡性腫瘤中普遍存在DNA-PKcs表達(dá)的變化，提示該酶可作為一種腫瘤標(biāo)志物，其表達(dá)水平不但與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，還與某些腫瘤的病理類型、分期及侵襲性有關(guān)，并與腫瘤放化療敏感性和預(yù)后有重要關(guān)系。本研究利用前期建立的裸鼠體內(nèi)耐藥模型，動態(tài)觀察鉑類耐藥形成過程中DNA-PKcs動態(tài)表達(dá)的變化，并分析臨床大樣本量卵巢癌患者DNA-PKcs的表達(dá)水平與患者的臨床分期、初次化療敏感性和生存時間的關(guān)系，為患者的個體化治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病例標(biāo)本來源 收集2009年9月至2013年4月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行手術(shù)后輔助鉑類為基礎(chǔ)化療的初治上皮性卵巢癌患者冰凍組織256例，詳細(xì)記錄患者相關(guān)的臨床資料，其中鉑類耐藥89例，鉑類敏感167例?；颊叩呐R床資料見表1。以8例年齡50～55歲的子宮肌瘤患者的正常卵巢組織為對照。

1.1.2 實驗動物及細(xì)胞株 SKOV3-GFP為帶有綠色熒光標(biāo)記（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記的SKOV3親本細(xì)胞，SKOV3/DDPⅱ是本課題組前期在裸鼠體內(nèi)由順鉑誘導(dǎo)的SKOV3-GFP耐藥細(xì)胞株［1］，耐藥指數(shù)達(dá)2.42倍。裸鼠（SPF級，BalB/C系）由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，均為4周齡左右的雌性裸鼠，體重為18～20 g。

1.1.3 主要試劑 順鉑為山東齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，Trizol Reagent為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，M-MLV Reverse Transcriptase由美國 Promega公司提供，SYBR Premix Ex TaqⅡ購自日本TAKARA公司，實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

表1 256例以鉑類為基礎(chǔ)化療的上皮性卵巢癌患者的臨床資料

1.2 方法

1.2.1 鉑類耐藥裸鼠模型的建立 動物模型的建立按本實驗前期探索條件完成［1］，SKOV3-GFP和SKOV3/DDPⅱ細(xì)胞接種于18～20 g裸鼠腹股溝皮下，成瘤后用游標(biāo)卡尺測量皮下腫瘤的長（a）和寬（b），腫瘤體積（mm3）=0.52×a×b2，待腫瘤生長至400 mm3后，隔天腹腔內(nèi)注射順鉑，劑量為4 mg/kg，分別在0次、2次、5次和8次注射順鉑后于次日取出瘤組織，-80℃保存。

1.2.2 QRT-PCR檢測DNA-PKcs的表達(dá) 取裸鼠移植瘤和患者卵巢癌的冰凍組織，以Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以QRT-PCR技術(shù)檢測DNA-PKcs的表達(dá)。DNA-PKcs上游引物為5′-TTTCCAGAGATTTCGGTTTGC-3′，下游引物為5′-AATTTCAACAGAGTAAGGTGCGAT-3′；退火溫度54℃。以GAPDH基因為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算實驗組目的基因的表達(dá)相對于對照組表達(dá)量變化的倍數(shù)。

1.2.3 DNA-PKcs的表達(dá)與臨床預(yù)后的相關(guān)性分析以Pearson相關(guān)分析卵巢癌組織DNA-PKcs的表達(dá)量與臨床因素的關(guān)系，包括FIGO分期、病理分級、術(shù)后殘余灶、鉑類初始治療反應(yīng)、無疾病進展生存時間（progression free survival，PFS）、總生存時間（overall survival，OS）、無進展?fàn)顟B(tài)、鉑類耐藥產(chǎn)生、1年內(nèi)復(fù)發(fā)和1年內(nèi)死亡等。

根據(jù)鉑類化療結(jié)束后是否在6個月內(nèi)復(fù)發(fā)，將卵巢癌患者分為鉑類化療敏感組和鉑類耐藥組，根據(jù)鉑類化療敏感組和鉑類耐藥組DNA-PKcs的平均表達(dá)量，將患者分為DNA-PKcs值≥耐藥組均值和DNAPKcs值≤敏感組均值兩組，以Kaplan-Meier法分析各臨床因素及DNA-PKcs的表達(dá)對PFS和OS影響。Cox回歸模型分析與PFS相關(guān)的臨床因素。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。DNA-PKcs表達(dá)量差異的比較采用t檢驗。用Pearson相關(guān)分析DNA-PKcs的表達(dá)量與臨床因素之間的關(guān)系。Kaplan-Meier法采用long-rank進行檢驗。Cox回歸模型分析采用相對風(fēng)險比（RHR）及其95%置信區(qū)間（95%CI）對多種指標(biāo)的共同效應(yīng)進行評價，若RHR＞1時，則不利因素占主導(dǎo)地位，若RHR＜1時，則保護因素占主導(dǎo)地位；若RHR=1或以95%CI包含1時，則兩者處于平衡狀態(tài)。P＜0.05作為顯著性檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 順鉑給藥后DNA-PKcs在裸鼠腫瘤組織中的動態(tài)表達(dá)

順鉑作用于裸鼠體內(nèi)移植瘤后，隨時間推移雖然腫瘤重量增加，但是SKOV3/DDPⅱ形成的瘤塊重量始終明顯大于SKOV3-GFP移植瘤，而且第8次注射順鉑以后，SKOV3-GFP移植瘤變?。▓D1A）。QRT-PCR法檢測結(jié)果顯示，給藥初期SKOV3/DDPⅱ瘤塊的DNA-PKcs表達(dá)量顯著低于SKOV3-GFP（P=0.003），DNA-PKcs的表達(dá)量隨順鉑給藥次數(shù)的增加而下降（圖1B）。但以DNA-PKcs的表達(dá)為縱坐標(biāo)，瘤塊重量為橫坐標(biāo)繪制散點圖，結(jié)果表明SKOV3-GFP瘤塊中DNA-PKcs相對表達(dá)量的降低速度明顯大于SKOV3/ DDPⅱ，SKOV3-GFP的斜率是SKOV3/DDPⅱ的7.9倍（圖1C）。

圖1 連續(xù)予順鉑注射處理后，裸鼠移植瘤重量和DNA-PKcs基因表達(dá)量的變化

2.2 卵巢癌組織DNA-PKcs的表達(dá)量與臨床預(yù)后因素的相關(guān)性分析

以Pearson相關(guān)分析卵巢癌組織DNA-PKcs的表達(dá)量與臨床預(yù)后因素的相關(guān)性。結(jié)果表明DNA-PKcs的表達(dá)與患者對鉑類藥物初始治療的反應(yīng)和鉑類耐藥的產(chǎn)生呈顯著負(fù)相關(guān)（P=0.000）。見表2。根據(jù)卵巢癌患者對鉑類藥物初始治療的反應(yīng)情況，分為完全有效、部分有效、腫瘤無消退和腫瘤增長4個組，結(jié)果顯示鉑類藥物治療完全有效和部分有效組DNA-PKcs的表達(dá)量顯著高于腫瘤無消退和腫瘤進展兩組患者（圖2A，P=0.000）；根據(jù)鉑類化療結(jié)束后6個月內(nèi)是否復(fù)發(fā)，將卵巢癌患者分為鉑類敏感組和鉑類耐藥組，結(jié)果可見鉑類敏感組的DNA-PKcs平均表達(dá)量為3.678±0.225，顯著高鉑類于耐藥組的2.327±1.048（P=0.000，圖2B）。

圖2 鉑類藥物治療不同效果的卵巢癌患者DNA-PKcs的表達(dá)比較

表2 卵巢癌組織DNA-PKcs的表達(dá)量與臨床預(yù)后因素的Pearson相關(guān)分析

用Kaplan-Meier法分析卵巢癌患者FIGO分期、病理分級、術(shù)后殘余灶、鉑類初始治療反應(yīng)和鉑類耐藥產(chǎn)生對OS和PFS的影響，結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO分期越早、術(shù)后無殘余病灶、對鉑類初次治療有效，并且鉑類治療敏感的患者其OS和PFS顯著增長（P＜0.05），反之生存時間則較短（圖3、圖4）。根據(jù)鉑類化療敏感組和鉑類耐藥組的DNA-PKcs平均表達(dá)量，將患者分為DNA-PKcs值≥3.678和DNA-PKcs值≤2.327兩組，以Kaplan-Meier法分析DNA-PKcs的表達(dá)對OS和PFS的影響，結(jié)果DNA-PKcs值≥3.678組的OS和PFS均顯著長于DNA-PKcs值≤2.327組（圖5）。Cox回歸模型分析上述Kaplan-Meier法分析具有差異顯著性的因素，發(fā)現(xiàn)納入影響卵巢癌患者的OS和PFS的危險因素為鉑類初始治療反應(yīng)（P=0.047）和鉑類耐藥產(chǎn)生（P=0.047），DNA-PKcs雖然沒有被納入，但差異接近顯著性水平（P=0.067）。

圖3 Kaplan-Meier法分析卵巢癌患者FIGO分期、術(shù)后殘余病灶、鉑類初始治療反應(yīng)和鉑類耐藥產(chǎn)生對總生存時間的影響

圖4 Kaplan-Meier法分析卵巢癌患者FIGO分期、術(shù)后殘余病灶、鉑類初始治療反應(yīng)和鉑類耐藥產(chǎn)生對無疾病進展生存時間的影響

圖5 DNA-PKcs的表達(dá)對卵巢癌患者總生存時間和無疾病進展生存時間的影響

3 討論

目前，以順鉑及其類似物卡鉑和奧沙利鉑為基礎(chǔ)結(jié)合紫杉醇類的聯(lián)合化療是上皮性卵巢癌重要的治療手段［2］。盡管順鉑初期治療卵巢癌表現(xiàn)出極度敏感［3］。但仍有15%～20%患者出現(xiàn)原發(fā)耐藥，80%的患者雖然對鉑類敏感，但可能在反復(fù)的化療過程中產(chǎn)生獲得性耐藥［4］。臨床上普遍存在的腫瘤化療多藥耐藥（multi drug resistance，MDR）現(xiàn)象是導(dǎo)致化療失敗、制約提高生存率的中心環(huán)節(jié)。因此，尋找可用于判斷卵巢癌MDR產(chǎn)生及其預(yù)后的分子，以采取更有效的化療方案，是提高患者預(yù)后及生存質(zhì)量的關(guān)鍵。

本研究利用前期建立的卵巢癌鉑類誘導(dǎo)耐藥動物模型，篩選與耐藥產(chǎn)生相關(guān)的差異基因［5］，發(fā)現(xiàn)鉑類敏感的卵巢癌細(xì)胞高表達(dá)DNA-PKcs mRNA，當(dāng)接受順鉑刺激后，DNA-PKcs mRNA的表達(dá)水平明顯下降，在獲得性耐藥形成過程中隨順鉑給藥次數(shù)的增加而下降，當(dāng)耐藥細(xì)胞產(chǎn)生以后，DNA-PKcs的基因表達(dá)始終在較低的水平。說明DNA-PKcs的表達(dá)下降可能與鉑類耐藥形成相關(guān)。

對256例卵巢癌患者DNA-PKcs基因表達(dá)分析表明，DNA-PKcs的表達(dá)水平與患者對鉑類治療初次反應(yīng)和鉑類耐藥產(chǎn)生呈負(fù)相關(guān)，而Cox回歸模型分析顯示對鉑類治療初次反應(yīng)和鉑類耐藥產(chǎn)生是影響患者生存時間的危險因素。Kaplan-Meier單因素生存分析表明，DNA-PKcs高表達(dá)組患者的生存時間明顯長于低表達(dá)組患者的生存時間。上述結(jié)果提示DNA-PKcs可能作為判斷卵巢癌鉑類耐藥產(chǎn)生的標(biāo)志分子。

既往研究表明DNA-PKcs是DNA-PK復(fù)合物由一個催化亞基DNA-PKcs和兩個調(diào)節(jié)亞基Ku80和Ku70組成，是DNA損傷修復(fù)的關(guān)鍵酶。DNA-PKcs在腫瘤組織、腫瘤旁組織及正常組織中均有表達(dá)，表明DNA-PKcs對DNA的損傷修復(fù)能力是一種基本的細(xì)胞功能，腫瘤的發(fā)生都與DNA-PKcs的損傷有關(guān)，DNA-PKcs受損后其活性下降，使人體極易發(fā)生各種惡性腫瘤［6］。鉑類藥物治療腫瘤的關(guān)鍵是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、生長。有研究發(fā)現(xiàn)，DNA-PKcs高表達(dá)的患者相對于低表達(dá)的患者對鉑類治療高度敏感［7］。Stronach等［8］研究表明Akt信號通路參與卵巢癌細(xì)胞凋亡，DNA-PKcs可以維持Akt信號通路。DNA-PKcs除了參與DNA修復(fù)，還參與DNA復(fù)制調(diào)控、免疫球蛋白和T細(xì)胞表面抗原受體V（D）J重組，作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)某些基因的表達(dá)，細(xì)胞程序性死亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、維持端粒結(jié)構(gòu)等多種生化反應(yīng)［9］。因此，我們推測DNA-PKcs的低表達(dá)可能使卵巢癌細(xì)胞不能得到有效的DNA修復(fù)以及不能啟動細(xì)胞凋亡程序，從而促進卵巢癌細(xì)胞增殖和復(fù)發(fā)。

通過基因芯片、分子雜交等分析發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的早期階段受到抑制，惡性轉(zhuǎn)化后其表達(dá)又上升，表明腫瘤細(xì)胞同樣可利用DNA-PKcs的修復(fù)功能進行生長、增殖［10］。前列腺癌細(xì)胞核染色DNA-PKcs陽性與放療抵抗密切相關(guān)［11］。DNA-PKcs和PARP-1可能通過激活細(xì)胞自噬誘導(dǎo)乳腺癌化療耐藥［12］。DNA-PKcs的表達(dá)對腫瘤耐藥可能具有雙向作用，具體取決于DNA-PKcs修復(fù)與細(xì)胞凋亡相關(guān)途徑還是耐藥相關(guān)途徑如細(xì)胞自噬等。DNA-PKcs可否用于判斷卵巢癌鉑類耐藥的產(chǎn)生，還需要進一步分析DNA-PKcs調(diào)控的下游機制，有關(guān)方面有待深入研究。

［1］ 石麗君，于紅靜，李 力，等.順鉑作用于耐順鉑卵巢上皮癌細(xì)胞后其細(xì)胞生物學(xué)特性的改變［J］.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，30（1）：33-37.

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［2014-04-09收稿］［2014-05-22修回］［編輯 阮萃才］

Dynamics of DNA-dependent protein kinase expression in the development of platinum resistance and correlation with clinical factors

SHI Li-jun△，LI Meng-di△，LI Li，WANG Qi（Department of Research，Guangxi Cancer Institute；Key Laboratory of High Incidence of Tumors of the Guangxi Region，Ministry of Education；△Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

WANG Qi.E-mail：qi_catcat@163.com

Objective To analyze the dynamics of DNA-dependent protein kinase（DNA-PKcs）expression in a nude mouse model of platinum resistance，as well as correlate the dynamics with clinicopathological characteristics of ovarian cancer patients，in order to develop an experimental system for individualized chemotherapy.Methods DNA-PKcs expression was measured by real-time fluorescence quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction（qRT-PCR）.Pearson correlation was used to examine associations between expression levels and clinical factors in patients with ovarian cancer.Kaplan-Meier analysis was used to examine association of DNA-PKcs expression with progression-free survival（PFS）and overall survival（OS）.Factors affecting patient survival were identified by Cox regression.Result DNA-PKcs expression was significantly lower in transplanted platinum-resistant tumors than in platinum-sensitive controls（P=0.003）.Development of drug resistance was associated with a gradual decrease in DNA-PKcs expression，which remained low during the production of platinum-resistant tumor cells.Pearson analysis showed that DNA-PKcs expression correlated negatively with both patient response to platinum treatment and the level of platinum resistance（P=0.000）.Kaplan-Meier analysis showed significantly higher survival rates for patients at an early FIGO stage，patients without residual disease，patients who responded to primary platinum treatment，patients sensitive to platinum，and patients with high DNA-PKcs expression（P＜0.05）.Cox regression identified two factors affecting survival time in patients with ovarian cancer：response to primary platinum treatment（P=0.047）and platinum resistance（P=0.047）.DNA-PKcs expression was significantly higher in patients who responded completely to platinum treatment than in patients with stable or progressive tumors（P=0.000）.Similarly，DNA-PKcs expression was significantly higher in platinumsensitive patients than in platinum-resistant ones（P=0.000）.Conclusion The development of platinum resistance may be associated with a reduction in DNA-PKcs expression，suggesting that DNA-PKcs may be a useful biomarker of platinum resistance in ovarian cancer.

Ovarian neoplasm；Drug resistance，Platinum；DNA-dependent protein kinase

R735.7

A

1674-5671（2014）02-07

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.02.04

國家自然科學(xué)基金資助項目（81360341）；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃資助項目（桂科攻1140003A-34）；廣西自然科學(xué)基金資助項目（2011GXNSFA018190）；廣西醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗中心開放基金資助項目（KFJJ2010-3）【通信作者】王 琪。E-mail：qi_catcat@163.com