羅麗丹王鑫華童夏生馮利平王恩智

1浙江省溫嶺市第四人民醫(yī)院兒科 臺州 317523 2浙江省臺州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院

呼吸道感染患兒血清Toll樣受體、Dectin及CD14測定臨床意義

羅麗丹1王鑫華2童夏生2馮利平2王恩智2

1浙江省溫嶺市第四人民醫(yī)院兒科 臺州 317523 2浙江省臺州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院

呼吸道感染；兒童；Toll樣受體；Dectin；CD14；臨床意義

機體免疫系統(tǒng)對感染的識別及應(yīng)答依賴于模式識別受體，Toll樣受體（TLR）被認為是最主要的模式識別受體[1]，參與感染、哮喘、腫瘤等疾病的炎癥過程。最近研究發(fā)現(xiàn)TLR2、6與Dectin、膜蛋白細胞分化抗原14（CD14）等模式識別受體具有協(xié)同作用，共同對微生物和外源性分子等產(chǎn)生免疫應(yīng)答，它們通過髓樣分化因子（MyD88）/NF-κB途經(jīng)產(chǎn)生TNFα、IL-12等炎癥因子起到相互增強作用[2]。本研究檢測毛細支氣管炎和急性上呼吸道感染患兒血清模式識別受體TLR2、Dectin及可溶性CD14（sCD14）的表達，以了解血清模式識別受體在兒童呼吸道感染中的發(fā)病機制，報道如下。

1 臨床資料

選取2011年10月—2012年8月本院住院患兒118例，其中毛細支氣管炎[3]53例，男31例，女22例；年齡0.3～4歲，平均（1.9±0.9）歲；急性上呼吸道感染[3]65例，男39例，女26例；年齡0.5～4歲，平均（2.1±1.0）歲；病程均＜48h。并取30名門診健康體檢兒童為健康對照組，男17名，女13名；年齡0.41～4歲，平均（2.0±1.1）歲。三組年齡、性別比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2 方法

采集患兒入院當(dāng)天靜脈血2mL，對照組門診體檢時采集。靜置2h后3000r/min離心15min，分離血清，-80℃冰箱貯存，集中檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法，檢測血清TLR2、Dectin及sCD14的蛋白濃度，試劑盒均購自上海研吉生物科技有限公司。

測定方法：試劑盒平衡于室溫20～25℃待用，取96孔反應(yīng)板，加入40μL標品于反應(yīng)孔里，然后再加生物素標記的TLR2、Dectin及sCD14抗體各10μL，輕輕晃動混勻。用封板膜封板后置37℃溫育30min，洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后洗滌5次，每孔加入酶標試劑50μL，再經(jīng)溫育、洗滌，每孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min，每孔加終止液50μL終止反應(yīng)，以空白空調(diào)零，全自動酶標儀（芬蘭Labsystems Dragon公司）450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值），繪制標準曲線，根據(jù)各標本吸光度值在標準曲線上查得相應(yīng)濃度。

統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（） 表示，采用F檢驗、t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

毛細支氣管炎組和急性上呼吸道感染組血清TLR2、Dectin及sCD14蛋白濃度均顯著高于健康對照組（P＜0.01）；毛細支氣管炎組血清Dectin蛋白濃度顯著高于急性上呼吸道感染組（P＜0.01），兩組血清TLR2和sCD14差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），見表1。

表1 三組血清TLR2、Dectin及sCD14比較（） ng/mL

表1 三組血清TLR2、Dectin及sCD14比較（） ng/mL

注：與健康對照組比較，*P＜0.01；與急性上呼吸道感染組比較，△P＜0.01

?

4 討論

天然免疫是機體識別和清除外源性病原體的主要途經(jīng)，是環(huán)境暴露和調(diào)節(jié)細胞因子應(yīng)答的重要環(huán)節(jié)。急性上呼吸道感染和毛細支氣管炎是兒童最為常見的急性感染性疾病，主要由呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒等感染引起，繼而機體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)[4]。

介導(dǎo)天然免疫的主要模式識別受體包括TLR、Dectin、CD14、核苷酸寡聚化域樣受體和維A酸誘導(dǎo)基因Ⅰ樣受體等。TLR屬于Ⅰ型跨膜蛋白，表達于細胞表面或細胞內(nèi)，通過胞外區(qū)的亮氨酸的重復(fù)序列，特異性識別病毒，并啟動細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，發(fā)揮抗病毒作用，它還與其它模式識別受體之間具有相互協(xié)同作用。Dectin是一個包涵細胞外C型凝集素樣碳水化合物識別域的糖基化的Ⅱ型跨膜受體，主要表達于單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞上，通過這些細胞的吞噬作用達到清除病原體的目的，并產(chǎn)生大量的炎癥因子和細胞因子。還能通過β-葡聚糖和非β-葡聚糖依賴性方式與T細胞相互作用，促進Th1/Th17細胞的活化及Treg細胞的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生免疫記憶[5]。不僅在支氣管上皮細胞的真菌感染中起重要作用[6]，還能使肺泡巨噬細胞對H1N1流感病毒A型產(chǎn)生天然免疫應(yīng)答，產(chǎn)生大量的干擾素、炎癥因子和趨化因子[7]。CD14表達于單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞上，有膜結(jié)合型（mCD14）和可溶性兩種形式。CD14和脂多糖、脂多糖結(jié)合蛋白一起形成一種復(fù)合體，與細胞膜上Toll樣受體結(jié)合，介導(dǎo)機體細菌或病毒感染的天然免疫過程。在巨噬細胞介導(dǎo)的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌肺炎和壞死性肺炎的天然免疫反應(yīng)中，潘頓-瓦倫丁殺白細胞素是通過TLR2、CD14、MyD88、白介素1受體相關(guān)激酶、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6依賴的方式產(chǎn)生免疫反應(yīng)[8]。在HIV-2感染的患者中，血清sCD14的濃度升高與病情危重程度有關(guān)，還與高敏C反應(yīng)蛋白及IL-6等生物標記物呈正相關(guān)，認為它是一個能預(yù)測病情的炎癥標記物[9]。在呼吸道合胞病毒感染的毛細支氣管炎患者中，血清sCD14的濃度與病情的進展有關(guān)，其程度受基因多態(tài)性影響[10]，還與喘鳴的發(fā)作次數(shù)有關(guān)，有喘鳴再次發(fā)作的患者低于不再喘息發(fā)作的患者，提示它傾向于Th1發(fā)展趨勢[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，血清TLR2、Dectin、sCD14的蛋白濃度在毛細支氣管炎組及急性上呼吸道感染組中升高，提示它們共同參與呼吸道感染的天然免疫應(yīng)答；同時還發(fā)現(xiàn)毛細支氣管炎組血清Dectin蛋白濃度高于急性上呼吸道感染組，而TLR2和sCD14的蛋白濃度無差異，提示Dectin的反應(yīng)可能因病而異，對判斷疾病或許有一定的參考價值，而TLR2和sCD14對病毒的應(yīng)答可能沒有選擇性差異。相似的研究發(fā)現(xiàn)，在上呼吸道感染小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，肺組織TLR3的表達升高，而在恢復(fù)期降到正常水平[12]，進一步提示TLR在上呼吸道感染的免疫反應(yīng)中也起了一定的作用。

綜上所述，毛細支氣管炎及急性上呼吸道感染患兒血清TLR2、Dectin、sCD14濃度升高（P＜0.01），提示在呼吸道感染急性期模式識別受體被激活，從而提升機體清除病原體的能力。檢測患兒模式識別受體的表達，為毛細支氣管炎及急性上呼吸道感染發(fā)病機制的研究提供了理論依據(jù)，為判斷病情提供參考價值。

參考文獻

［1］Wei L，Jiao P，Yuan R，et al.Goose Toll-like receptor 7（TLR7），myeloid differentiation factor 88（MyD88）and antiviral molecules involved in anti-H5N1 highly pathogenic avian influenza virus response［J］.Vet Immunol Immunopathol，2013，153（1-2）：99-106.

［2］Dennehy KM，Willment JA，Williams DL，et al.Reciprocal regulation of IL-23 and IL-12 following co-activation of Dectin-1 and TLR signaling pathways［J］.Eur J Immunol，2009，39（5）：1379-1386.

［3］胡亞美，江載芳.諸福棠實用兒科學(xué)［M］.第7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1199-1201.

［4］李晨虹，童夏生，羅冬嬌，等.腫瘤壞死因子-α及其受體在急性毛細支氣管炎患者血清中的表達［J］.中國婦幼保健，2011，26（8）：1210-1212.

［5］Carvalho A，Giovannini G，De Luca A，et al.Dectin-1 isoforms contribute to distinct Th1/Th17 cell activation in mucosal candidiasis［J］.Cell Mol Immunol，2012，9（3）：276-286.

［6］Sun WK，Lu X，Li X，et al.Dectin-1 is inducible and plays a crucial role in Aspergillus-induced innate immune responses in human bronchial epithelial cells［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2012，31（10）：2755-2764.

［7］Jieru Wang，Mrinalini P.Nikrad，Emily A.Travanty，et al.Innate Immune Response of Human Alveolar Macrophages during Influenza a Infection［J］.PLoS One，2012，7（3）：e29879.

［8］Zivkovic A，Sharif O，Stich K，et al.TLR 2 and CD14 mediate innate immunity and lung inflammation to staphylococcal Panton-Valentine leukocidin in vivo［J］.J Immunol，2011，186（3）：1608-1617.

［9］Thiébaut R，Charpentier C，Damond F，et al.Association of soluble CD14 and inflammatory biomarkers with HIV-2 disease progression［J］.Clin Infect Dis，2012，55（10）：1417-1425.

［10］Inoue Y，Shimojo N，Suzuki Y，et al.CD14-550 C/T，which is related to the serum level of soluble CD14,is associated with the development of respiratory syncytial virus bronchiolitis in the Japanese population［J］.J Infect Dis，2007，195（11）：1618-1624.

［11］Soferman R，BarZohar D，Jurgenson U，et al.Soluble CD14 as a predictor of subsequent development of recurrent wheezing in hospitalized young children with respiratory syncytial virus-induced bronchiolitis［J］.Ann Allergy Asthma Immunol，2004，92（5）：545-548.

［12］鄭艷，耿連藝，盛夏，等.上感顆粒對病毒性上呼吸道感染小鼠肺組織TLR3及PKR mRNA表達的影響［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，31（3）：410-413.

2013-08-06

修回日期：2013-12-16

浙江省溫嶺市科技局基金資助項目（No.2011-1-85）

通迅作者：童夏生，E-mail：xshtzg@163.com