朱艷芳，馬應(yīng)波，劉東華，張愛民,2，薛建平,2，盛 瑋,2

（1.淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000；2.資源植物生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 淮北 235000；3.昆山東海農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，江蘇 昆山 215301）

黃秋葵（Abelmoschus esculentus（L.）Moench）屬于錦葵科秋葵屬一年生草本植物，別名補(bǔ)腎草、秋葵和羊角豆等.相關(guān)研究表明，可食用的嫩果營養(yǎng)成分豐富，富含蛋白質(zhì)、多糖、黃酮、不飽和脂肪酸、維生素等多種化合物，是一種營養(yǎng)型保健蔬菜［1-3］，美國人稱其為“植物偉哥”，日本人稱其為“綠色人參”，經(jīng)常食用可增強(qiáng)人體體質(zhì)，所以被許多國家定為運(yùn)動員的首選蔬菜.許多研究還表明，黃秋葵的嫩果具有抗疲勞［4-5］、治療燒（燙）傷［6］等功能，黃秋葵多糖具有結(jié)合膽酸［7］及抗氧化［8］等作用.黃秋葵既是營養(yǎng)豐富的保健型蔬菜，又是療效顯著的常用中藥，其花、葉、芽、果均可食用.花、種子和根還可入藥，有滋陰補(bǔ)陽的功能，是一種名副其實(shí)的菜、藥、花兼用型植物［9］.因此，黃秋葵具有很高的開發(fā)價(jià)值.

黃秋葵原產(chǎn)于非洲東部地區(qū)，現(xiàn)廣泛栽培于熱帶和亞熱帶地帶，上世紀(jì)90年代初黃秋葵被引入我國內(nèi)陸.目前，我國大陸南北方各地均有黃秋葵的分布與栽培，種植較多的有北京、廣東、上海、山東、江蘇、浙江、海南、云南、安徽、福建等省市.目前對黃秋葵的果實(shí)研究比較多，但是，作為黃秋葵的副產(chǎn)物其花也含有多種營養(yǎng)成分，我們主要對黃秋葵花提取物的抗氧化活性進(jìn)行初步研究，為黃秋葵花的開發(fā)利用提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

黃秋葵花由江蘇省昆山東海農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供.

六氰合鐵酸鉀（K3［Fe（CN）6］）、K2HPO4、KH2PO4、三（羥甲基）氨基甲烷、三氯乙酸（TCA）、FeCl3、95%乙醇、鄰二氮菲、鄰苯三酚、FeSO4、過氧化氫（H2O2）、HCl等均為國產(chǎn)分析純（購于上海國藥集團(tuán)），DPPH·（二苯代苦味酰基自由基）（購于Sigma公司）.

UV-4802型紫外可見分光光度計(jì)（尤尼科上海儀器有限公司），ANO124電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司），RE52-98型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞容生化儀器廠）.

1.2 方法

1.2.1 黃秋葵花提取物制備

稱取一定量的干燥黃秋葵花，碾碎成粉末，過20目篩，按料液比為1：25加入65% 乙醇，在70 ℃水浴中浸提1.5 h，過濾得提取溶液，減壓濃縮后，真空冷凍干燥，即得黃秋葵花提取物粉未.

1.2.2 黃秋葵花提取物還原能力測定

將5 mL 不同濃度黃秋葵花提取液放于試管中，加入5 mL pH 6.6 的磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L）和5 mL 1% 的 K［3Fe（CN）6］，搖勻，50 ℃ 水浴保溫 20 min，快速冷卻，再加入 5 mL 的 10% TCA，混勻，6 000 r/min 離心10 min，取5 mL 上清于試管中，再依次加入5 mL 蒸餾水和1 mL 0.1% FeCl3，充分混勻，靜置10 min，以蒸餾水為對照，分光光度計(jì)測定700 nm處的吸光度值A(chǔ)700nm，即可表示還原能力的強(qiáng)弱，A700nm越大還原能力越強(qiáng)［10-11］.

1.2.3 黃秋葵花提取物對DPPH·的清除能力測定

在5 mL DPPH· 溶液（6.5×10-5mol /L）中分別加入不同濃度的黃秋葵花提取物溶液1 mL，混勻后室溫靜置30 min，測定在517 nm 處的吸光度值，計(jì)算黃秋葵花提取物對DPPH· 的清除率［12］：

式中：AS為加入黃秋葵提取物在517 nm 處吸光度；AC為未加入樣品在517 nm 處吸光度.

1.2.4 黃秋葵花提取物對羥自由基（·OH）的清除能力測定

采用鄰二氮菲-Fe2+的方法［13］測定黃秋葵花提取物對·OH 的清除能力，步驟為：加入鄰二氮菲溶液、150 mmol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液和黃秋葵花提取物溶液（損傷管及未損傷管不加黃秋葵花提取物，用蒸餾水補(bǔ)充體積），搖勻，加入FeSO4溶液快速搖勻，再加入H2O（2未損傷管不加），達(dá)到終濃度為：鄰二氮菲0.15%、FeSO40.75 mmol/L、H2O20.3%，總體積10 mL.37 ℃恒溫水浴1 h，測定各管在536 nm波長下的吸光度值A(chǔ)536nm，不同濃度黃秋葵花提取物對·OH的清除率按下式計(jì)算［14］.

其中A樣為加入黃秋葵花提取物和H2O2在536 nm的吸光度值，A損為加入H2O2在536 nm的吸光度值，A未損為不加入黃秋葵花提取液和H2O2在536 nm的吸光度值.

1.2.5 黃秋葵花提取物對超氧陰離子自由基（O2·-）的清除能力測定［15］

在不同濃度黃秋葵花提取物中加入50 mmol/L pH 8.4 的Tris-HCl 緩沖液，混勻后25 ℃水浴保溫20 min，加入25 ℃預(yù)熱的100 mmol /L鄰苯三酚溶液0.1 mL，快速混勻，啟動反應(yīng)后每30 s測一次325 nm處的吸光度值A(chǔ)325nm，至4.5 min為止.將A325nm值與時(shí)間（min）進(jìn)行回歸分析，其斜率為V0.不同濃度黃秋葵花提取物對O2·-的清除率按下式計(jì)算：

1.2.6 黃秋葵花提取物對由H2O2引起的小鼠紅細(xì)胞溶血的保護(hù)作用測定［16］

取成年昆明小鼠血用肝素鈉抗凝，低速離心取沉淀紅細(xì)胞，預(yù)冷生理鹽水洗滌數(shù)次，制備0.5%的紅細(xì)胞懸液.取1 mL 紅細(xì)胞懸液，加入0.5 mL 不同濃度的黃秋葵花提取物，以0.5 mL 0.05mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液作為陽性對照組，再加入0.5 mL的50 mmol/L H2O2開始反應(yīng).37 ℃下反應(yīng)1 h后，生理鹽水稀釋5倍，4 000 r/min離心10 min，取上清液，分光光度計(jì)測415 nm處的吸光度值A(chǔ)415nm，按下式計(jì)算黃秋葵花提取物對由H2O2引起溶血的抑制率：

2 結(jié)果與分析

2.1 黃秋葵花提取物的還原能力測定

還原力是評價(jià)物質(zhì)潛在抗氧化活性的重要指標(biāo)，還原力大小與抗氧化力大小呈正相關(guān).還原力強(qiáng)的物質(zhì)是良好的電子和氫的供體，可以通過提供電子使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的物質(zhì)，終止自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng).同時(shí)，可與過氧化物的前體物質(zhì)作用，阻止過氧化物的產(chǎn)生，進(jìn)而起到抗氧化的作用［16］.在黃秋葵花提取物還原能力測定試驗(yàn)中，提取物中黃酮類等還原性物質(zhì)將六氰合鐵酸鉀中的Fe3+還原為Fe2+，F(xiàn)e2+可生成在700 nm處有最大吸光度的Perl普魯士藍(lán)，分光光度計(jì)測定700 nm處的吸光度值來間接反映抗氧化劑還原能力的大小.由圖1可知,黃秋葵花提取物的還原能力隨著濃度的增大而增強(qiáng)，且呈明顯的量效關(guān)系.提取物濃度與還原力的線性方程為y=1.642 4x+0.030 1，相關(guān)系數(shù)R2為0.994 8，EC50（吸光度0.5 時(shí)樣品的質(zhì)量濃度）為0.286 1 mg/ mL.

圖1 黃秋葵花提取物的還原能力Fig.1 Reducing activities of the extracts from okra flower

2.2 黃秋葵花提取物對DPPH·的清除效果

二苯代苦味?；杂苫―PPH·）是一種較穩(wěn)定的自由基，能與有供氫能力的化合物反應(yīng)，其溶液呈深紫色，在517 nm波長處有最大吸收.當(dāng)有抗氧化劑存在時(shí)，抗氧化劑與DPPH·反應(yīng)使其吸光度值減小甚至消失，此變化與抗氧化劑的抗氧化能力及其數(shù)量呈定量關(guān)系.樣品的抗氧化活性可通過清除DPPH·的量來確定［17］.由圖2可知不同濃度的黃秋葵花提取物對DPPH· 均有一定的清除作用，且隨著濃度的增加清除率隨之增加.線性回歸分析表明，黃秋葵花提取物對DPPH·的清除率與提取物濃度符合一元二次方程模型，其方程為y=-105.76x2+145.56x+27.984，相關(guān)系數(shù)R2為0.997 8，半數(shù)清除濃度為0.173 mg/mL，說明黃秋葵花提取物具有較強(qiáng)的清除DPPH·的作用.

圖2 黃秋葵花提取物對DPPH· 的清除能力Fig.2 Scavenging activities of the extracts from okra flower on DPPH·

2.3 黃秋葵花提取物對·OH的清除效果

生物體內(nèi)羥自由基是造成組織脂過氧化，蛋白質(zhì)解聚、聚合，核酸斷裂，多糖解聚的重要活性氧.羥自由基清除率是反映物質(zhì)抗氧化作用的重要指標(biāo)［13］.橙紅色的鄰二氮菲-Fe2+被反應(yīng)生成的·OH氧化成鄰二氮菲-Fe3+，在536 nm波長處的最大吸收峰消失，可利用鄰二氮菲-Fe2+的褪色程度來衡量·OH的清除量.由圖3可知，不同濃度的黃秋葵花提取物對反應(yīng)中生成的·OH有一定的清除能力，且隨著黃秋葵花提取物濃度的升高，對·OH清除效果逐漸增強(qiáng).多項(xiàng)回歸分析表明，黃秋葵花提取物對·OH的清除作用具有一定的量效關(guān)系，其關(guān)系方程為y=-299.68x2+360.48x-18.624，相關(guān)系數(shù)R2為0.984 4，半數(shù)清除濃度為0.237 mg/mL，說明黃秋葵花提取物是一種較強(qiáng)的羥基自由基（·OH）清除劑.

圖3 黃秋葵花提取物對·OH的清除作用Fig.3 Scavenging activities of the extracts from okra flower on ·OH

2.4 黃秋葵花提取物對超氧陰離子自由基（O2·-）的清除效果

鄰苯三酚在弱堿性條件下發(fā)生自氧化反應(yīng)，不斷生成超氧陰離子自由基（O2·-）及有色中間產(chǎn)物.抗氧化劑能將超氧陰離子自由基（O2·-）歧化分解為H2O2和O2，從而抑制鄰苯三酚的自氧化反應(yīng).中間產(chǎn)物積累濃度與時(shí)間呈線性關(guān)系，因此測定特定波長下的吸光度值變化，可得到加抗氧化劑后鄰苯三酚的自氧化速率，進(jìn)而間接求得提取物清除超氧陰離子自由基（O2·-）的能力［17］.由圖4可知，不同濃度的黃秋葵花提取物對超氧陰離子自由基（O2·-）有一定的清除作用，隨著濃度的增加清除率隨之增加.線性回歸分析表明，黃秋葵花提取物對O2·-的清除效果與提取物濃度關(guān)系方程為y=-30.566x2+97.545x-2.141，相關(guān)系數(shù)R2為0.999，半數(shù)清除濃度為0.679 mg/mL

圖4 黃秋葵花提取物對O2·-的清除作用Fig.4 Scavenging activities of the extracts from okra flower on O2·-

2.5 黃秋葵花提取物對溶血反應(yīng)的抑制能力測定

由圖5可知，黃秋葵花提取物能有效地抑制紅細(xì)胞膜的破裂，保護(hù)紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，并顯示出一定的量效關(guān)系.線性回歸分析表明，黃秋葵花提取物對紅細(xì)胞保護(hù)效果與提取物濃度之間關(guān)系符合一元二次方程模型，其方程為y=-63.996x2+125.35x+2.610 9，相關(guān)系數(shù)R2為0.987 9，對H2O2引起的紅細(xì)胞溶血半數(shù)抑制濃度為0.511 7 mg/mL.

圖5 黃秋葵花提取物對溶血的抑制能力Fig.5 Inhibition of hemolytic reaction of the extracts from okra flower

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，黃秋葵花提取物對清除羥自由基（·OH）、清除超氧陰離子自由基（O2·-）和二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）等活性氧具有較強(qiáng)的清除作用，并呈明顯的量效關(guān)系.在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，黃秋葵花提取物對羥自由基（·OH）的清除能力大于對超氧陰離子自由基（O2·-）的清除能力.羥自由基是造成組織細(xì)胞損傷的主要活性氧之一，能引起膜過氧化，蛋白質(zhì)交聯(lián)變性，核酸損傷等，許多疾病如腫瘤、炎癥、癌癥、衰老、動脈硬化等的引發(fā)大多數(shù)和羥自由基（·OH）有關(guān)［18］.黃秋葵花提取物對羥自由基有很強(qiáng)的清除作用，是一種很有前景的待開發(fā)的抗氧化活性物質(zhì).本文只研究討論其體外抗氧化的部分試驗(yàn)，至于黃秋葵花提取物在生物體內(nèi)的抗氧化活性如何，我們將繼續(xù)深入研究.總之，對黃秋葵花提取物的生物抗氧化活性進(jìn)行深入研究，論證黃秋葵花在功能性茶及功能性食品上具有很好的應(yīng)用前景，從而提高黃秋葵種植的經(jīng)濟(jì)效益.

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