楊 翠，任建勛，吳紅金，王玉祥

生理狀態(tài)下，心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生與清除處于穩(wěn)態(tài)平衡。氧化應(yīng)激時(shí)，ROS在細(xì)胞內(nèi)過(guò)量蓄積，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，造成細(xì)胞功能障礙，最終導(dǎo)致其壞死和凋亡［1］。過(guò)度氧化應(yīng)激導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡明顯增加，在冠心病、心肌梗死、心力衰竭、心肌缺血再灌注損傷等心血管病理過(guò)程中扮演重要角色。抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞壞死和凋亡是防治缺血缺氧性心臟病的有效策略，成為許多中藥活性成分心肌保護(hù)作用研究的切入點(diǎn)［2，3］。人參皂苷Rb1（Ginsenoside Rb1，Gs－Rb1）是從人參中提取出來(lái)的主要活性成分，大量研究表明 Gs－Rb1能減輕心肌缺血再灌注損傷［4，5］，然而 Gs－Rb1抗氧化保護(hù)心肌細(xì)胞的確切的分子機(jī)制尚未完全闡明。本研究采用H2O2誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞造成氧化性損傷，探索Gs－Rb1對(duì)氧化應(yīng)激所致細(xì)胞損傷的直接保護(hù)作用，并對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生24h的SD大鼠乳鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2012－0001。

1.1.2 主要試劑 人參皂苷Rb1購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于Hyclone公司；胰蛋白酶購(gòu)于Amresco公司；膠原酶Ⅱ購(gòu)于Worthington Biochemical公司；MTT購(gòu)于Sigma公司；TUNEL試劑盒購(gòu)于Roche公司；Phospho－p44／p42ERK1／2Antibody購(gòu)于 Cell Signaling Technology公司；H2O2購(gòu)于北京宏盛苑化工有限公司；原花青素購(gòu)自上?？稻呕び邢薰?。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自SANYO公司；505酶標(biāo)儀購(gòu)自BIO－RAD公司；熒光顯微鏡購(gòu)自O(shè)LYMPUS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng) 出生24h內(nèi)的SD大鼠乳鼠，無(wú)菌操作下取心臟并修剪。磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，在50 mL的離心管中將其剪碎成1mm3～2mm3大小的組織碎塊。隨后用含0.25%胰蛋白酶和0.05%膠原酶Ⅱ的PBS輕柔吹打消化8min，靜置后1min后收集細(xì)胞懸液，放入含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中終止消化；以上過(guò)程反復(fù)進(jìn)行，直至組織塊完全消化。細(xì)胞懸液經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾去除未消化的組織，在4℃時(shí)以1 000r／min離心8min，棄上清，并用10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液重懸。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5×106／L。接種到25mL培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)箱（含95%空氣＋5%CO2）中培養(yǎng)1.5h以純化心肌細(xì)胞（差速貼壁法）。接種到12孔或96孔培養(yǎng)板中，每24h觀察細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)情況，并更換培養(yǎng)液。待72h細(xì)胞融合出現(xiàn)搏動(dòng)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 原代心肌細(xì)胞H2O2損傷模型的建立及分組 上述原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為6組。空白對(duì)照組：37℃孵箱常規(guī)培養(yǎng)；模型組：加入終濃度為100μmol／L H2O2，37℃孵箱培養(yǎng)；陽(yáng)性對(duì)照組：在加入終濃度為100μmol／L原花青素2h后，加入與模型組等量的 H2O2，37℃孵箱培養(yǎng)；Gs－Rb1低、中、高劑量組分別在加入50μmol／L、100μmol／L、200μmol／L Gs－Rb1 2h后，加入與模型組等量的H2O2，37℃孵箱培養(yǎng)。

1.2.3 MMT法檢測(cè)細(xì)胞活性 各組加入H2O2后18h采用MMT法檢測(cè)細(xì)胞活力。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS沖洗后每孔加入 MTT 20μL（0.5mg／mL），置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO 150μL／孔，將培養(yǎng)板置于微孔板震蕩器上振蕩10min，充分溶解，酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度值（OD）。

1.2.4 心肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 各組加入H2O2后18h，吸取培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定。經(jīng)0.2%Triton－X－100液通透處理，加rTdT酶、核苷混合物的混合液37℃避光孵育1 h后終止反應(yīng)，PBS沖洗后在熒光顯微鏡下采用綠色熒光進(jìn)行觀察和分析，對(duì)同一片取5個(gè)不同視野計(jì)數(shù)所有細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，計(jì)算凋亡率。凋亡率＝凋亡細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 心肌細(xì)胞ERK1／2磷酸化水平檢測(cè) 各組加入H2O220min后，采用 Western blot進(jìn)行ERK1／2蛋白磷酸化檢測(cè)。棄去培養(yǎng)基后預(yù)冷的PBS沖洗3次，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液于冰上充分裂解，提取總蛋白并用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。所有不同組蛋白樣本分別加入上樣緩沖液后煮沸5min變性，蛋白進(jìn)行12%SDS－PAGE凝膠電泳分離后采用濕法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白室溫封閉1h，加入磷酸化特異性單克隆ERK1／2抗體孵育、4℃過(guò)夜、TBST洗滌3次（每次10 min）后加入二抗孵育，室溫孵育2h；TBST洗滌3次（每次10 min）后加入ECL處理、X線膠片曝光、顯影及定影。采用IPP 6.0進(jìn)行灰度分析，以p－ERK1／2蛋白條帶灰度值與t－ERK1／2蛋白條帶灰度值比值反映ERK1／2磷酸化的程度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用One－Way ANOVA（單因素方差分析）方法，方差齊性應(yīng)用Student－Newman－Keuls檢驗(yàn)，方差不齊采用Tamhane’sT2檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌細(xì)胞活性的比較 與空白對(duì)照組比較，模型組心肌細(xì)胞活力明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，原花青素組以及Gs－Rb1低、中、高劑量組心肌細(xì)胞活力明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。詳見(jiàn)表1。

2.2 各組心肌細(xì)胞凋亡率的比較 與空白對(duì)照組比較，模型組心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，原花青素組以及Gs－Rb1低、中、高劑量組心肌細(xì)胞凋亡率明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。詳見(jiàn)表1。

表1 各組乳鼠心肌細(xì)胞活力和凋亡率變化（x±s）

2.3 各組心肌細(xì)胞ERK1／2蛋白磷酸化水平的比較 與空白對(duì)照組比較，模型組心肌細(xì)胞p－ERK1／2表達(dá)明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，原花青素組以及Gs－Rb1高劑量組心肌細(xì)胞p－ERK1／2表達(dá)則顯著增加（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖1、表2。

圖1 Gs－Rb1對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞p－ERK1／2蛋白表達(dá)的影響

表2 各組乳鼠心肌細(xì)胞p－ERK1／2蛋白表達(dá)的變化（x±s）

3 討 論

細(xì)胞凋亡，又稱程序性細(xì)胞死亡，是一種嚴(yán)格受基因調(diào)控的細(xì)胞自主性死亡，參與著機(jī)體多種病理生理過(guò)程。氧化應(yīng)激是心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要介導(dǎo)因素，心肌缺血、缺氧時(shí)，大量?jī)?nèi)源性ROS在心肌細(xì)胞內(nèi)發(fā)生蓄積，通過(guò)特殊的信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［1，6］。本研究采用H2O2作為外源性ROS作用于心肌細(xì)胞，MTT法和TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示，H2O2成功造成心肌細(xì)胞氧化損傷，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

一些特定的信號(hào)通路參與氧化應(yīng)激所致的心肌細(xì)胞損傷與凋亡，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路是其中重要的一條，而細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal－regulated kinase，ERK）是 MAPK家族的重要組成部分，精細(xì)調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、存活及凋亡［7］。目前認(rèn)為對(duì)于ERK磷酸化的調(diào)節(jié)是干預(yù)心肌細(xì)胞在缺血缺氧條件下凋亡的重要途徑。研究發(fā)現(xiàn)，中藥成分丹參素對(duì)缺氧所致的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與激活ERK1／2途徑而抑制心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)［8］。α－硫辛酸能增加ERK1／2磷酸化水平對(duì)葡萄糖／葡萄糖氧化酶誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，而使用ERK1／2抑制劑后，該保護(hù)作用消失［9］。此外，瘦素可能通過(guò)活化ERK1／2通路抑制H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡［10］。

現(xiàn)代藥理研究表明人參多種活性成分具有抗心肌細(xì)胞凋亡、清除氧自由基、改善心肌能量代謝和增加心肌收縮力等廣泛的心血管調(diào)節(jié)作用。前期研究發(fā)現(xiàn)［11，12］，人參皂苷Re和人參皂苷Rg1均能抑制60Co照射誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡，ERK、JNK和p38MAPK通路可能參與介導(dǎo)這種心肌細(xì)胞保護(hù)作用。Gs－Rb1作為人參的又一主要活性成分，研究顯示其具有顯著的抗心肌缺血再灌注損傷作用，可能與其上調(diào)eNOS表達(dá)，抑制自由基對(duì)心肌組織的氧化損傷有關(guān)［4］。同時(shí)，Gs－Rb1可能通過(guò)抗脂質(zhì)過(guò)氧化與減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載抑制H2O2誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡［13］。還有研究發(fā)現(xiàn)Gs－Rb1通過(guò)穩(wěn)定線粒體膜電位而發(fā)揮抗心肌細(xì)胞凋亡作用［14］。另有實(shí)驗(yàn)證明［15］，Gs－Rb1能清除ROS，抑制ROS誘導(dǎo)的JNK通路的激活，從而產(chǎn)生心肌細(xì)胞保護(hù)作用。然而，Gs－Rb1是否通過(guò)ERK1／2途徑而減輕氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞的損傷還不得而知，本研究主要以ERK途徑為切入點(diǎn)，細(xì)胞、分子兩個(gè)層面來(lái)探討Gs－Rb1對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。原花青素作為一種強(qiáng)抗氧化劑，具有較強(qiáng)的清除氧自由基作用，被我們選用作為陽(yáng)性藥物對(duì)照組。本研究結(jié)果表明，原花青素及低、中、高劑量的Gs－Rb1均可抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和凋亡。進(jìn)一步研究顯示，與空白對(duì)照組相比，H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷組心肌細(xì)胞的p－ERK1／2表達(dá)下調(diào)，原花青素組和高劑量Gs－Rb1可通過(guò)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞p－ERK1／2表達(dá)增加的途徑對(duì)抗H2O2引起的細(xì)胞氧化損傷和凋亡。

綜上所述，H2O2可誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞損傷和凋亡，而Gs－Rb1能減輕這種細(xì)胞損傷而具有心肌細(xì)胞保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與激活ERK信號(hào)通路相關(guān)。然而，Gs－Rb1介導(dǎo)的這種心肌保護(hù)作用是否與其他信號(hào)通路相關(guān)，其確切的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究證明。

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