GSTM1、GSTT1及GSTP1(rs1695)基因多態(tài)性與乳腺癌蒽環(huán)和（或）紫杉類藥物化療血液毒性關(guān)系的研究

劉新蘭 趙艷姣 黃 英 姜 敏

GSTM1、GSTT1及GSTP1(rs1695)基因多態(tài)性與乳腺癌蒽環(huán)和（或）紫杉類藥物化療血液毒性關(guān)系的研究

劉新蘭 趙艷姣 黃 英 姜 敏

目的 研究乳腺癌外周血中谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶（GST）M1、GSTT1和GSTP1（rs1695）基因多態(tài)性與乳腺癌患者采用蒽環(huán)類和（或）紫杉類藥物化療發(fā)生血液毒性的關(guān)系。方法應(yīng)用多重PCR技術(shù)（M-PCR）和高分辨熔解曲線技術(shù)（HRM）檢測3個基因在252例女性乳腺癌患者外周血中的基因多態(tài)性。結(jié)果采用紫杉類、蒽環(huán)聯(lián)合紫杉類藥物化療，攜帶GSTP1(rs1695)AG/GG的患者是發(fā)生Ⅲ～Ⅳ度中性粒細胞減低的危險因素(OR=6.111,95％CI 1.526～24.469,P＜0.05和OR=9.257,95％CI 2.903～29.522,P＜0.01)，而GSTM1(+)與GSTM1(-)、GSTT1(+)與GSTT1(-)患者Ⅲ～Ⅳ度血液毒性的發(fā)生率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；采用蒽環(huán)類藥物化療，GSTM1(+)和GSTM1(-)、GSTT1(+)和GSTT1(-)、GSTP1AA和GSTP1AG/GG患者Ⅲ～Ⅳ度血液毒性發(fā)生率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論GSTP1(rs1695)基因多態(tài)性可作為預(yù)測乳腺癌患者采用紫杉類藥物化療發(fā)生中性粒細胞毒性的標(biāo)志。

乳腺腫瘤；抗腫瘤聯(lián)合化療方案；谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶；多態(tài)現(xiàn)象，遺傳；聚合酶鏈反應(yīng)；谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶；化療血液毒性；高分辨熔解曲線技術(shù)

蒽環(huán)類和紫杉類藥物是乳腺癌化療的基石用藥，二者可顯著延長乳腺癌患者的生存期，具有良好的療效及優(yōu)勢，但在應(yīng)用時受到其不良反應(yīng)的限制。且臨床中發(fā)現(xiàn)，即使腫瘤分期、病理類型及治療方案皆相同的患者，化療不良反應(yīng)的程度也可能不同，差異的原因與單核苷酸多態(tài)性（SNP）有關(guān)。研究表明，谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶（GST）M1、GSTT1和GSTP1 （rs1695）基因具有多態(tài)性，GSTM1和GSTT1缺失基因型（-）編碼無活性的酶；GSTP1第5外顯子上A313→G改變（SNP位點rs1695），使其編碼的酶的活性降低甚至消失，引起化療療效及毒性的差異[1-2]。本研究通過檢測252例乳腺癌患者3種酶的基因多態(tài)性，分析其與蒽環(huán)類和（或）紫杉類藥物化療血液毒性的關(guān)系，探討3個基因多態(tài)性作為預(yù)測乳腺癌患者發(fā)生血液毒性的可行性，以期達到個體化及安全有效用藥的目的。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年1月—2013年1月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤醫(yī)院就診、均經(jīng)病理形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)確診、病例資料完整的女性乳腺癌患者252例，年齡30～72歲，中位年齡48歲。按照2011年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）指南進行臨床分期：Ⅰ期53例，Ⅱ期50例，Ⅲ期21例，Ⅳ期128例。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集和DNA提取 所有患者化療前抽取外周靜脈血5 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，全血基因組DNA抽提采用美國OMEGA公司的3392-01試劑盒。Nanodrop2000檢測樣本DNA濃度和純度，統(tǒng)一標(biāo)定模板DNA濃度為25 mg/L，經(jīng)電泳檢測，電泳條帶應(yīng)＞10 kb且無明顯降解，分裝后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計 采用GenBank已知序列設(shè)計引物，引物由上海生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequences of glutathione s-transferase M1,T1 and P1(rs1695)表1 GSTM1、GSTT1和GSTP1(rs1695)基因引物序列

1.2.3 多重PCR技術(shù)（M-PCR） 采用M-PCR技術(shù)檢測GSTM1和GSTT1基因多態(tài)性，β-Globin為內(nèi)對照。M-PCR的反應(yīng)總體系為50 μL，其中0.1 μmol/L的GSTM1、GSTT1和β-Globin上、下游引物各1 μL，PCR-master-mix 25μL，無菌雙蒸水（ddH2O）17 μL，DNA模板2 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性45 s、58℃退火45 s、72℃延伸45 s，共35次循環(huán)，最后72℃延伸7 min，結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，電壓為5 V/cm，電泳35 min，后在美國Bio-Rad Gel Doc 200凝膠成像系統(tǒng)下觀察，攝像并記錄結(jié)果。經(jīng)PCR擴增、電泳后，缺失基因型（-）不被擴增，電泳無條帶顯示。內(nèi)對照β-Globin片段電泳表現(xiàn)為268 bp條帶，GSTM1（+）為215 bp，GSTT1（+）為480 bp。

1.2.4 高分辨熔解曲線技術(shù)（HRM） 采用定量PCR為基礎(chǔ)的HRM技術(shù)檢測GSTP1(rs1695)A313G位點的基因型。HRM反應(yīng)總體系為10 μL，其中0.1 μmol/L上、下游引物各0.25 μL，Eva熒光素0.5 μL，PCR-master-mix 5 μL，ddH2O 2 μL，DNA模板2 μL。HRM反應(yīng)條件：（1）擴增階段。95℃預(yù)變性2 min，95℃變性10 s，61℃退火10 s，72℃延伸7 min，30個循環(huán)。（2）熔解曲線階段。數(shù)據(jù)采集從65℃開始，按照0.25℃/s的速度升溫，期間每隔0.04 s采集1次圖像，升溫至95℃結(jié)束反應(yīng)。Roche 480軟件分析輸出實驗結(jié)果。根據(jù)HRM檢測的不同基因型隨機抽取10％的樣本送至南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司進行基因測序，以驗證HRM技術(shù)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2.5 化療方案 所有患者均接受以蒽環(huán)類和（或）紫杉類藥物為基礎(chǔ)的化療方案，其中以蒽環(huán)類為主方案化療124例（AC/CAF，環(huán)磷酰胺+阿霉素/5-Fu方案）；以紫杉類為主方案化療58例（TX，紫杉醇+卡培他濱），以蒽環(huán)聯(lián)合紫杉類方案化療70例（T/DA，紫杉醇/多西紫杉醇+阿霉素）。阿霉素劑量為50～60 mg/m2靜脈注射，第1天；紫杉醇劑量為135～175 mg/m2或多西紫杉醇（D）60 mg/m2靜脈滴注，第1天；卡培他濱1 000 mg/m2口服第1～14天。

1.2.6 毒性判定 化療2個周期后，對252例患者進行化療血液學(xué)毒性判定，參照CTCAE（Common Terminology Criteria for Adverse Events）v3.0標(biāo)準(zhǔn)[3]，分為0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行分析?；蛐头植疾捎肏ardy-Weinberg遺傳平衡檢驗；χ2檢驗及Fisher確切概率法分析不同基因型與乳腺癌患者化療發(fā)生血液毒性的關(guān)系；非條件Logistic回歸模型計算比值比（OR）和95％可信區(qū)間（CI）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌中GSTM1、GSTT1和GSTP1(rs1695)基因多態(tài)性分布 252例乳腺癌中，GSTM1和GSTT1基因均有非缺失型(+)和缺失型(-)2種分型，缺失基因型系基因發(fā)生片段缺失后，經(jīng)PCR擴增電泳后無目的條帶產(chǎn)生；其中GSTM1(-)占57.1％(144/252)；GSTT1(-)占29.4％(74/252)。GSTP1(rs1695)基因有AA、AG和GG 3種分型，經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，證實本組患者GSTP1(rs1695)基因型分布符合遺傳平衡定律，具有群體代表性，見表2。GSTM1 和GSTT1基因分型電泳結(jié)果見圖1，GSTP1(rs1695)基因多態(tài)性分布圖及測序結(jié)果見參考文獻[4]中圖1、2。

2.2 GSTM1、GSTT1和GSTP1(rs1695)基因多態(tài)性與乳腺癌患者接受不同方案化療血液毒性的關(guān)系

2.2.1 蒽環(huán)類藥物為主化療 124例患者中，GSTM1 （+）和GSTM1（-）、GSTT1（+）和GSTT1（-）、GSTP1AA 和GSTP1AG/GG患者Ⅲ～Ⅳ度血液毒性的發(fā)生率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表3。

Tab.2 Genotype distribution and allele frequency of GSTP1(rs1695)表2 GSTP1(rs1695)基因型分布及等位基因頻率

Fig.1 GSTM1 and GSTT1 gene amplification products圖1 GSTM1和GSTT1基因擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖

Tab.3 Association between GSTM1,GSTT1 and GSTP1 (rs1695)gene polymorphisms with hematologic toxicities of breast cancer patients receiving Anthracycline-based chemotherapy表3 乳腺癌患者蒽環(huán)類藥物化療血液毒性與GSTM1、GSTT1和GSTP1(rs1695)基因多態(tài)性的關(guān)系 例

2.2.2 紫杉類藥物為主化療 58例患者中，發(fā)生0～Ⅱ度中性粒細胞減低毒性占31.03％（18/58），發(fā)生Ⅲ～Ⅳ度中性粒細胞減低毒性占68.97％（40/58）。GSTP1AG/GG攜帶者Ⅲ～Ⅳ度中性粒細胞減低發(fā)生率高于GSTP1AA攜帶者（P＜0.01）。GSTM1（+）和GSTM1（-）、GSTT1（+）和GSTT1（-）患者Ⅲ～Ⅳ度血液毒性的發(fā)生率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；GSTP1AA和GSTP1AG/GG患者Ⅲ～Ⅳ度白細胞減低、血紅蛋白減低及血小板減低的發(fā)生率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

Tab.4 Association between 3 gene polymorphisms with hematologic toxicities of breast cancer patients receiving Paclitaxel-based chemotherapy表4 乳腺癌患者紫杉類藥物化療血液毒性與GSTM1、GSTT1和GSTP1(rs1695)基因多態(tài)性的關(guān)系 例

分別以上述3個基因為自變量[GSTM1（+）=0，GSTM1（-）=1；GSTT1（+）=0，GSTT1（-）=1；GSTP1AA=0，GSTP1AG/GG=1]，上述化療中性粒細胞減低為因變量（0～Ⅱ=0，Ⅲ～Ⅳ=1），行非條件Logistic回歸分析，結(jié)果顯示采用紫杉類藥物化療患者攜帶GSTP1 AG/GG基因型是發(fā)生Ⅲ～Ⅳ度中性粒細胞減低的危險因素，見表5。

Tab.5 Unconditional Logistic regression of 3 gene polymorphisms with neutropenia of breast cancer patients receiving Paclitaxel-based chemotherapy表5 3個基因多態(tài)性與乳腺癌患者接受紫杉類藥物化療血液毒性關(guān)系的非條件Logistic回歸分析

2.3 蒽環(huán)聯(lián)合紫杉類藥物化療 70例患者中發(fā)生0～Ⅱ度中性粒細胞減低毒性占45.7％（32/70），發(fā)生Ⅲ～Ⅳ度中性粒細胞減低毒性占54.3％（38/70）。GSTP1AG/GG攜帶者Ⅲ～Ⅳ度中性粒細胞減低發(fā)生率高于GSTP1AA攜帶者（P＜0.01）。GSTM1（+）和GSTM1（-）、GSTT1（+）和GSTT1（-）患者Ⅲ～Ⅳ度血液毒性的發(fā)生率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；GSTP1AA和GSTP1AG/GG患者Ⅲ～Ⅳ度白細胞減低、血紅蛋白減低及血小板減低的發(fā)生率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表6。

Tab.6 Association between 3 gene polymorphisms with hematologic toxicities of breast cancer patients receiving Anthracycline-Paclitaxel-based chemotherapy表6 GSTM1、GSTT1和GSTP1(rs1695)基因多態(tài)性與乳腺癌患者接受蒽環(huán)類聯(lián)合紫杉類方案化療血液毒性的關(guān)系 例

按結(jié)果2.2中相同的變量賦值方法行非條件Logistic回歸，結(jié)果顯示采用蒽環(huán)聯(lián)合紫杉類藥物化療患者攜帶GSTP1 AG/GG基因型是發(fā)生Ⅲ～Ⅳ度中性粒細胞減低的危險因素，見表7。

Tab.7 Unconditional logistic regression of 3 gene polymorphisms with neutropenia of breast cancer patients receiving Anthracycline-Paclitaxel-based chemotherapy表7 3個基因多態(tài)性與乳腺癌患者接受蒽環(huán)聯(lián)合紫杉類藥物化療血液毒性關(guān)系的非條件Logistic回歸分析

3 討論

3.1 GSTM1、GSTT1及GSTP1(rs1695)基因生物學(xué)功能和作用機制 蒽環(huán)類和（或）紫杉類藥物均經(jīng)肝臟GST家族（GSTs）代謝活化，GSTs是人體內(nèi)的Ⅱ相代謝酶，通過催化親電子物質(zhì)與還原型谷胱甘肽結(jié)合發(fā)揮解毒效應(yīng)[5]。GSTs催化阿霉素與還原型谷胱甘肽結(jié)合，增加其水溶性，從膽汁和尿液排出體外[5]；抗微管藥物通過GSTs與促細胞分裂原活化蛋白激酶（MAPK）之間的c-jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK1）通路相連接而產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)和細胞凋亡[6]。GSTM1、GSTT1和GSTP1基因是GSTs家族重要組成成員，分別編碼GST-μ、GST-θ和GST-π同工酶。GSTM1(+)和GSTT1(+)基因型的個體可防御內(nèi)外源性物質(zhì)對細胞的損傷；而GSTM1(-)和GSTT1 (-)基因型編碼的酶無活性[1]，從而增加機體對腫瘤的易感性和化療藥物的損傷[7]。GSTP1第5外顯子上A313→G（Ile105→Val）改變（SNP位點rs1695），可導(dǎo)致其編碼的蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性下降和特異性催化活性降低[2]。本研究GSTM1、GSTT1及GSTP1(rs1695)基因型分布頻率與文獻報道一致[8]。

3.2 GSTM1、GSTT1和GSTP1(rs1695)基因多態(tài)性與乳腺癌患者化療的關(guān)系 多數(shù)研究顯示GSTM1、GSTT1和GSTP1(rs1695)基因多態(tài)性與以蒽環(huán)類和（或）紫杉類藥物化療療效[4，9]、毒性[10]及預(yù)后[11]密切相關(guān)。Yao等[10]采用基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDITOF）的方法研究乳腺癌患者接受以環(huán)磷酰胺+吡柔比星/表柔比星+氟尿嘧啶（CAF/CEF）為主方案化療的結(jié)果顯示，與GSTP1AA基因型相比，至少含有1個GSTP1 G基因的患者易發(fā)生Ⅲ～Ⅳ度中性粒細胞毒性（OR=0.63,95％CI 0.41～0.97）和白細胞毒性（OR= 0.59,95％CI 0.39～0.89）。本研究顯示：采用紫杉類方案化療、蒽環(huán)聯(lián)合紫杉類藥物化療，GSTP1(rs1695) AG/GG基因型患者Ⅲ～Ⅳ度中性粒細胞減低發(fā)生率高于GSTP1(rs1695)AA基因型。中性粒細胞減低為骨髓抑制的敏感指標(biāo)，說明GSTP1(rs1695)基因多態(tài)性可預(yù)測乳腺癌患者采用紫杉類藥物發(fā)生骨髓抑制的可能性。GSTP1(rs1695)AA基因型可保護正常造血系統(tǒng)免受化療藥物的攻擊，GSTP1(rs1695)GG/AG基因型的患者，因解毒化療藥物的能力降低，導(dǎo)致有效血藥濃度增高，加之化療藥物對靶腫瘤的特異殺傷作用低下，在獲得高化療有效率的同時也對正常組織構(gòu)成威脅，在聯(lián)合化療時其不良反應(yīng)尤為明顯。因此根據(jù)基因型與體表面積給予合適的化療劑量是一個值得探索的方向。

綜上所述，GSTP1基因SNP可作為預(yù)測乳腺癌患者采用紫杉類藥物化療發(fā)生骨髓抑制的標(biāo)志。因此，通過檢測外周血GSTP1(rs1695)基因多態(tài)性，在采用紫杉類藥物化療后24 h，給予攜帶GSTP1 (rs1695)GG/AG基因型患者注射粒細胞集落刺激因子可預(yù)防化療相關(guān)重度骨髓抑制的發(fā)生，保障患者如期完成化療。

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（2013-09-25收稿 2014-03-10修回）

（本文編輯 李鵬）

Correlation between Polymorphisms of GSTM1,GSTT1 and GSTP1(rs1695)on Hematologic Toxicities with Anthracycline/Paclitaxel-Based Chemotherapy in Breast Cancer

LIU Xinlan,ZHAO Yanjiao,HUANG Yin,JIANG Min
The General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004，China

ObjectiveTo examine the effects of genetic polymorphisms in GSTM1,GSTT1 and GSTP1(rs1695) genes on hematologic toxicities of breast cancer patients receiving Anthracycline/Paclitaxel-based chemotherapy.MethodsMultiply PCR technique and High Resolution Melting method were used to examine these 3 genes polymorphsim in female breast cancers(n=252).ResultsThe GSTP1(rs1695)AG/GG genotype was a risk factor forⅢ-Ⅳdegree of neutrophil toxicity when patients

Paclitaxel-based chemotherapy and Anthracycline-Paclitaxel-based chemotherapy (OR=6.111,95％CI 1.526-24.469,P＜0.05 and OR=9.257,95％CI 2.903-29.522,P＜0.01).There were no statistic difference onⅢ-Ⅳdegree hematologic toxicities rates between GSTM1(+)and GSTM1(-),GSTT1(+)and GSTT1(-)patients after they receiced Paclitaxel-based chemotherapy and Anthracycline-Paclitaxel-based chemotherapy(P＞0.05);There was no statistic difference onⅢ-Ⅳdegree hematologic toxicities rates between GSTM1(+)and GSTM1(-),GSTT1(+)and GSTT1(-), GSTP1AA and GSTP1AG/GG patients after they receiced Anthracycline-based chemotherapy(P＞0.05).ConclusionThe genetic polymorphisms in GSTP1(rs1695)can be used as a gene marker for forecasting the chemotherapy,inducing neutropenia toxicities in breast cancer patients receiving Paclitaxel-based chemotherapy.

breast neoplasms;antineoplastic combined chemotherapy protocols；glutathione transferase;polymorphism，genetic;polymerase chain reaction;glutathione S-transferase;chemotherapy toxicities;high resolution melting

R737.9，R730.53

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.002

寧夏回族自治區(qū)銀川市應(yīng)用研究開發(fā)計劃項目（2011029）

寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院（郵編750004）