攪拌槳組合數(shù)值模擬優(yōu)化及在谷氨酰胺轉胺酶發(fā)酵中的應用

宮磊，周麗，崔文璟，劉中美，周哲敏

（江南大學生物工程學院，江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

攪拌槳組合數(shù)值模擬優(yōu)化及在谷氨酰胺轉胺酶發(fā)酵中的應用

宮磊，周麗，崔文璟，劉中美，周哲敏

（江南大學生物工程學院，江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

攪拌是影響發(fā)酵過程的主要因素之一，組合不同類型攪拌槳、發(fā)揮其各自優(yōu)勢，勢必能夠優(yōu)化攪拌性能、提高微生物發(fā)酵生產(chǎn)效率。本研究采用計算流體力學（CFD）方法，模擬六直葉渦輪槳（DT）和DT、DT和拋物線槳（BT6）、六斜葉槳（CM6）和DT以及CM6和BT6四種攪拌槳組合對流場和混合時間的影響。對模擬得到的混合時間進行實驗驗證。結果表明，最優(yōu)組合為：上槳葉為CM6槳，下槳葉為BT6槳。吸水鏈霉菌WSH03-13產(chǎn)谷氨酰胺轉胺酶（TG）的發(fā)酵實驗結果表明：CM6和BT6槳組合可獲得最高的谷氨酰胺轉胺酶活性和生物量，分別為4.7U/mL和42.9g/L，較優(yōu)化前（DT和DT槳）分別提高了53%和40.9%，說明優(yōu)化后的攪拌槳組合更有利于微生物生長和發(fā)酵。研究結果為組合攪拌槳在微生物發(fā)酵過程中的應用提供了借鑒。

槳葉組合；數(shù)值模擬；谷氨酰胺轉胺酶；發(fā)酵；計算流體力學

攪拌在微生物的發(fā)酵過程中不可或缺，主要體現(xiàn)在三個方面：①加強氣液傳質和分散；②保持發(fā)酵液的均一穩(wěn)定，避免局部菌體或原料濃度過高；③使發(fā)酵過程中產(chǎn)生的熱量快速分散，維持發(fā)酵溫度的穩(wěn)定。不同類型的攪拌槳能夠在發(fā)酵罐中產(chǎn)生不同的流體形態(tài)、剪切力分布、湍流強度、氣含率分布等，進而影響微生物的菌體形態(tài)、生物量甚至產(chǎn)物量。傳統(tǒng)的徑向流圓盤渦輪式攪拌槳湍流程度強，但存在著全罐混合差、槳葉區(qū)剪切力過強、能耗大等缺點。例如，六直葉渦輪槳DT槳和BT6槳屬于典型的徑流式槳。DT槳結構簡單，易于加工，應用較廣泛[1]，但在進行氣液分散時會形成氣穴，氣穴的存在會降低槳葉的泵送能力和氣液傳質能力[2]。多層槳葉組合，底層槳決定氣液分散效率，BT6槳葉采用拋物線設計，常被用作下槳葉來分散氣體，能避免氣體過早的從葉輪區(qū)上升逃逸，并能明顯降低氣穴的生成。另一方面，軸向流攪拌槳能改善全罐混合效果，且剪切力分布較均勻，但對高黏度流體的混合效果較徑向流槳差。CM6槳屬于軸向式流槳葉，對流體具有下壓作用，在實際發(fā)酵中可以增加通入氣體在流體中的停留時間，從而獲得更高的溶解氧，常被用作上槳葉。因此，將不同類型槳葉進行組合，發(fā)揮它們各自的優(yōu)勢，勢必改善攪拌效果。對攪拌槳的研究也逐漸從單一槳葉向組合優(yōu)化方向發(fā)展[3]。李艷等[4]對不同的槳葉組合在非牛頓流體中的各項特性進行比較，得到一種最優(yōu)組合MBTD-MA315-MA315，在提高全罐傳氧效果、增強氣體分散和減少能耗等方面都有顯著優(yōu)越性。郝惠娣等[5]對自吸式攪拌槽中3種不同的槳葉（6P、6DT、6PDTU）進行組合優(yōu)化，提高了氣含率和容積傳氧系數(shù)，更加有利于氣液兩相的傳質。但未見DT、CM6和BT6三種槳葉組合提高發(fā)酵水平的報道。

計算流體力學（computational fluid dynamics，簡稱CFD）是運用計算機數(shù)值計算的方法來研究流體的運動、傳質、傳熱等規(guī)律，它能夠預測不同實驗條件下，反應器內部的流場情況[6]。與傳統(tǒng)半經(jīng)驗半理論的方法相比，其在研究攪拌器方面有兩大優(yōu)勢：①節(jié)省時間和投入；②由于是計算機模擬，所以不受物理模型和實驗模型的限制，并且能給出詳細的流場參數(shù)和一些實驗中無法獲得的數(shù)據(jù)[7]。該方法在生物反應器領域中的應用，為攪拌槳的設計開辟了新的道路。

微生物來源的谷氨酰胺轉胺酶（microbial transglutaminase，EC.2.3.2.13，簡稱MTG），能夠催化體外大部分的蛋白質發(fā)生分子內或分子間的交聯(lián)反應，從而改變蛋白質的功能性質，在食品工業(yè)中應用廣泛[8]。吸水鏈霉菌可發(fā)酵合成較高水平的谷氨酰胺轉胺酶，然而發(fā)酵中后期，發(fā)酵液黏度較高，嚴重影響傳質過程，不利于酶的合成。目前人們對谷氨酰胺轉胺酶的研究多集中在生物化學方面，尚無通過攪拌槳組合優(yōu)化來提高攪拌效率，進而提高谷氨酰胺轉胺酶發(fā)酵水平的報道。

本工作設計了DT+DT、DT+BT6、CM6+DT和CM6+BT6 4種槳葉組合形式，通過CFD模擬，研究其流體力學特征，并通過谷氨酰胺轉胺酶的發(fā)酵過程，對優(yōu)化結果進行實驗驗證。

1 材料方法

1.1 物理模型

發(fā)酵罐為美國NBS公司BioFlow110發(fā)酵罐；DT槳為發(fā)酵罐自帶，CM6槳和BT6槳由常州西瑪公司提供（圖1）。

下槳葉距槽底距離為直徑的1/3[9]。實驗中模擬的4種槳葉組合如圖2。

發(fā)酵罐及各個攪拌槳的尺寸參數(shù)如表1。

1.2 網(wǎng)格劃分

攪拌槳及發(fā)酵罐模型的建立、網(wǎng)格的劃分、邊界條件的確定均采用前處理軟件Gambit○R（Version 2.3，F(xiàn)luent Inc.，USA）。采用分區(qū)域網(wǎng)格劃分方法，槳葉區(qū)采用適應性更好的四面體結構化網(wǎng)格，并進行加密處理；非槳葉區(qū)采用四面體與六面體相結合的網(wǎng)格方法。對不同的網(wǎng)格劃分方案進行計算，得到網(wǎng)格無關解，確定網(wǎng)格方案。最終的網(wǎng)格數(shù)目分別為： DT+DT組合412328； DT+BT6組合503965；CM6+DT組合529200；CM6+BT6組合503279。

圖1 攪拌槳結構示意圖

圖2 不同槳葉組合示意圖

表1 發(fā)酵罐及槳葉參數(shù)

1.3 模擬方法

1.3.1 控制方程

流體的流動遵循質量守恒、能量守恒、動量守恒三大定律以及流體的連續(xù)性方程[10]。本研究不考慮溫度的影響，因此不考慮能量守恒方程。

質量守恒方程如式（1）。

該方程是質量守恒方程的一般形式，適用于不可壓流和可壓流。Sm是廣義源項；ρ是密度；ui是速度矢量。

動量守恒方程如式（2）。

式中，?代表張量積；ρ是密度；v是速度。

1.3.2 計算條件

使用FLUENT○R（Version 2.3，F(xiàn)luent Inc.，USA） 軟件進行計算，液面為壓力出口，攪拌槳、擋板、罐體均為無滑移壁面。采用多重參考系法（multiple reference frame，MRF）處理動槳葉和靜止罐體之間的相互作用，湍流模型為標準k-ε模型[11]。收斂標準設為每步變量的殘差值小于10-4。

1.4 混合時間的測定方法

攪拌槳穩(wěn)定于某一轉速，采用鹽酸作為示蹤劑，在加料點處加入，計算機記錄發(fā)酵液pH值變化，直到pH值重新穩(wěn)定為止。從加入示蹤劑開始到pH值重新穩(wěn)定，這段時間記為混合時間[12]。

1.5 發(fā)酵條件和方法

1.5.1 菌種

吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）WSH03-13由本實驗室保藏。

1.5.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：糊精20g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，CaCl21g/L，MgSO42g/L，K2HPO42g/L，KH2PO42g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油15g/L，葡萄糖10g/L，玉米淀粉10g/L，蛋白胨15g/L，大豆粉20g/L，MgSO42g/L，Na2HPO42g/L，NaH2PO42g/L，CaCO35g/L。

1.5.3 發(fā)酵條件

吸水鏈霉菌孢子接種至50mL種子培養(yǎng)基中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)28 h；以4%（體積比）接種量將種子接種至發(fā)酵罐，初始發(fā)酵培養(yǎng)基體積4 L，初始pH值6.5，通氣量1.25 vvm[vvm表示單位液體體積在單位時間內的通氣量，m3/(m3·min)]，攪拌槳轉速與溶氧偶聯(lián)（控制在200～600r/min），維持溶氧濃度在25%～30%。

1.5.4 谷氨酰胺轉胺酶酶活測定方法

酶活測定方法參照文獻[13]。一個單位谷氨酰胺轉胺酶酶活定義（U/mL）：37℃時每分鐘催化形成 1μmol L-谷氨酸-γ-單羥肟酸的酶量。

1.5.5 菌體干重測定方法

取15mL發(fā)酵液，10000r/min離心10min，去離子水洗3次，105℃烘干至恒重稱量。

2 結果和討論

2.1 4種槳型組合宏觀速度場比較

圖3 不同槳型組合的速度云圖

4種組合的宏觀速度場比較如圖3。由圖3可見，各種組合的高速區(qū)都集中在葉端。低轉速時，DT+DT組合與DT+BT6組合由于都為徑流槳組合，所產(chǎn)生的流體形態(tài)相似，全罐出現(xiàn)速度分層現(xiàn)象嚴重，整體速度較其他兩組小，而將上槳葉更換為軸流槳CM6之后，全罐的混合程度明顯提高，其中CM6+BT6組合的速度分布更加均勻；轉速提高后，DT+DT組合、DT+BT6組合與CM6+DT組合的速度分層現(xiàn)象并無較大改善，而CM6+BT6組合的速度場均勻程度明顯增加。綜上，CM6+BT6組合在高低轉速下都能產(chǎn)生更加均勻的速度場，并且隨著轉速的提高均勻程度增加。

2.2 4種槳型組合速度分布

由圖4可以看出轉速為600r/min時，DT+DT組合的流體流速有90%的區(qū)域集中在0.5m/s以下，且1m/s以上的高速區(qū)域很少；DT+BT6和CM6+DT兩種組合的流體流速絕大多數(shù)集中在0.25～0.75；而CM6+BT6組合有80%處在0.5～1m/s，且在高速區(qū)所占比例在4種槳葉組合中也是最高。這表明在相同轉速條件下，CM6+BT6組合能產(chǎn)生更高且更均勻的速度場分布。

2.3 混合時間比較

圖4 轉速600r/min時各組合罐內速度分布

混合時間是表征攪拌槽內流體混合狀況的重要參數(shù)，能夠反映攪拌槳的性能，指導攪拌反應器的設計及放大。物料的混合主要由主體流動、湍流和分子擴散3種機理共同作用[14]，而由不同的槳型產(chǎn)生的主體流動影響尤為突出。

分別對4種組合的混合時間進行了實驗測定和數(shù)值模擬（圖5）。低轉速時，4種組合的混合時間相差較大，混合時間由DT+DT，CM6+DT，DT+BT6，CM6+BT6依次縮短。隨著轉速的提高而混合時間逐漸縮短，并且不同組合之間的差別縮小。模擬結果與實驗測得數(shù)據(jù)趨勢相吻合。

由不同轉速下的速度場分布（圖3）可見，低轉速時，流體的湍流程度較小，此時的流體形態(tài)對混合起主導作用。其中CM6與BT6的槳型組合混合時間最短，說明此種組合產(chǎn)生的主體流動更有利于罐中流體的混合。當轉速提高后，不同組合下流體的湍流程度都很大，此時湍流大小對混合起主導作用，各組合的混合時間趨向一致。表2給出模擬結果和實驗結果的誤差比較，結果要優(yōu)于文獻值[15]。實驗數(shù)據(jù)較模擬值要小，主要有幾方面原因：①模擬過程所用的標準k-ε模型是針對理想狀態(tài)流體，只適用于各項同性湍流，而實際情況下的流場一直在不斷的變化，這種流場的不穩(wěn)定可以促進傳質，縮短混合時間；②本研究槳葉區(qū)采用非結構化網(wǎng)格，應用此網(wǎng)格時，網(wǎng)格質量會影響計算結果，導致出現(xiàn)誤差；③模擬所取的加料點跟監(jiān)測點會和實驗有所差別。

圖5 混合時間比較

表2 混合時間模擬結果與實驗結果誤差比較

圖6 不同槳葉組合發(fā)酵過程

2.4 不同組合對TG酶發(fā)酵的影響

4種不同槳葉組合的發(fā)酵結果如圖6。發(fā)酵過程中發(fā)酵液的pH值存在先下降后上升的現(xiàn)象，是吸水鏈霉菌產(chǎn)谷氨酰胺轉胺酶的標志[16]。

在吸水鏈霉菌發(fā)酵合成谷氨酰胺轉酶過程中，在發(fā)酵的前中期，為了確保菌絲體的完整性，避免剪切力過大，轉速一般控制在200～400r/min；而在發(fā)酵中后期，菌體黏度很高，溶氧對生物量和產(chǎn)酶量影響很大，需要確保攪拌充分，轉速控制在600r/min。在這兩個階段，與對照槳相比，其他3種組合的流場速度更大、混合時間更短（圖3、圖5），所獲得的發(fā)酵結果也都優(yōu)于原始組合。其中CM6+BT6的組合獲得了最高的酶活和生物量，分別達到4.7U/mL和42.9g/L，較對照槳分別提高了53.0%和40.9%。

野生型吸水鏈霉菌WSH03-13最初的產(chǎn)酶水平僅為1.09U/mL。柏映國等[17]通過優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)條件將產(chǎn)酶水平大幅度提高至4.46U/mL（發(fā)酵40h時）。程力等[18]進一步在發(fā)酵液中添加不同的添加劑，最終將酶活提高至6.61U/mL。本工作以吸水鏈霉菌谷氨酰胺轉胺酶發(fā)酵為例，考察攪拌槳組合優(yōu)化對發(fā)酵過程的影響，僅通過攪拌槳組合優(yōu)化，同樣較大幅度地提高了谷氨酰胺轉胺酶的產(chǎn)酶水平，并縮短發(fā)酵周期至30 h左右，提高了其生產(chǎn)強度。這一優(yōu)化方式對其他發(fā)酵過程有一定的借鑒意義。

圖7 酶活和生物量比較

3 結 論

（1）與DT+DT、DT+BT6、CM6+DT槳葉組合相比，CM6+BT6組合在低轉速和高轉速下都能產(chǎn)生更加均勻的速度場，并且隨著轉速的提高均勻程度增加。

（2）在相同轉速條件下，CM6+BT6組合形成的流體集中分布于更高速度區(qū)。

（3）在低轉速條件下，CM6+BT6的混合時間明顯小于其他槳葉組合；在高轉速條件下，各個組合的混合時間趨向一致。

（4）用CM6+BT6組合進行吸水鏈霉菌谷氨酰胺轉胺酶發(fā)酵，所獲得的最大酶活與最大生物量比原始組合（DT+DT槳）分別提高了53.0%和40.9%，且優(yōu)于其他槳葉組合。

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Numerical simulation of different impellers and its effect on transglutaminase fermentation process

GONG Lei，ZHOU Li，CUI Wenjing，LIU Zhongmei，ZHOU Zhemin
（State Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）

Agitation is one of the main factors affecting fermentation process. To take advantage of advantages of individual impellers，impeller combination is necessary in improving agitation and fermentation efficiency. Four different impeller combinations (DT and DT，DT and BT6，CM6 and DT as well as CM6 and BT6) were simulated with the commercial fluid dynamics (CFD) software Fluent and their flow patterns and mixing times were compared. Mixing time was also validated by experiments. The optimal combination was the CM6 (upper impeller) and BT6 (lower impeller). Using this impeller combination，the maximal transglutaminase activity and biomass ofStreptomyces hygroscopicusWSH03-13 reached 4.7U/mL and 42.9g/L respectively，which were 53% and 40.9% higher than the control group (DT and DT). The optimized impeller combination could promote microbial growth and fermentation process. The results in this study will be useful for further application of impeller combination in microbial fermentation.

impeller combination；numerical simulation；transglutaminase；fermentation；computational fluid dynamics

TQ 027.2

A

1000-6613（2014）10-2570-06

10.3969/j.issn.1000-6613.2014.10.009

2014-01-17；修改稿日期：2014-02-22。

國家自然科學基金（31070711）及教育部科學技術研究重大項目（311023）。

宮磊（1988—），男，碩士研究生。E-mail gonglei0113@ 163.com。聯(lián)系人：周哲敏，博士，教授，研究方向為酶學與酶工程。E-mail zheminzhou@jiangnan.edu.cn。