張寧，蔣劍春，楊靜，衛(wèi)民，趙劍，童婭娟

（中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室；國家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)工程重點開放性實驗室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，江蘇南京 210042）

N＋注入誘變選育纖維素酶高產(chǎn)菌株及發(fā)酵產(chǎn)酶營養(yǎng)因子優(yōu)化研究

張寧，蔣劍春*，楊靜，衛(wèi)民，趙劍，童婭娟

（中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室；國家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)工程重點開放性實驗室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，江蘇南京 210042）

應(yīng)用低能氮離子（N＋）注入技術(shù)對纖維素酶產(chǎn)生菌里氏木霉（Trichoderma reesei）進(jìn)行誘變選育，在能量為10 keV，注量為150×1014和200×1014N＋／cm2的條件下分別篩選得到3株纖維素酶高產(chǎn)菌株，連續(xù)5代遺傳穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，所得到的高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性較好，羧甲基纖維素酶活力均提高到3.300 IU／mL以上，較出發(fā)菌株（2.698 IU／mL）提高了20.0%以上。采用Plackett-Burman實驗設(shè)計法和旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計法系統(tǒng)地研究高產(chǎn)菌株150-1-1發(fā)酵營養(yǎng)因子組成，得到了纖維素酶產(chǎn)量隨葡萄糖、麩皮和微晶纖維素等營養(yǎng)因子的變化規(guī)律及相應(yīng)的響應(yīng)面分析圖。實驗結(jié)果表明，葡萄糖、麩皮和微晶纖維素濃度與纖維素酶活存在顯著的相關(guān)性，當(dāng)葡萄糖濃度為4.9 g／L，麩皮濃度為23.0 g／L，微晶纖維素濃度為7.7 g／L時，150-1-1纖維素酶濾紙酶活力達(dá)到2.439 IU／mL，較優(yōu)化前（2.000 IU／mL）提高了22.0%。

N＋離子注入；里氏木霉；纖維素酶

纖維素酶在食品、釀造、紡織、飼料、造紙、石油開采和資源再生等方面具有廣泛應(yīng)用和發(fā)展前景。近年來，隨著能源和環(huán)境問題日益嚴(yán)峻，利用纖維素酶降解纖維素原料生產(chǎn)燃料乙醇新型能源［1］、利用纖維素酶輔助秸稈還田［2］等命題也日益受到關(guān)注。然而，目前纖維素酶產(chǎn)酶菌株的活力還較低，導(dǎo)致纖維素酶生產(chǎn)成本過高，限制了其廣泛而有效的應(yīng)用。因此，選育高產(chǎn)、酶性質(zhì)優(yōu)良的纖維素酶產(chǎn)酶菌株始終是人們關(guān)注的熱點。里氏木霉（Trichoderma reesei）是一種高產(chǎn)纖維素酶的絲狀真菌，它對人無毒性，在產(chǎn)酶條件下也不產(chǎn)生真菌毒素和抗生素，因其纖維素酶產(chǎn)量高，易于培養(yǎng)和控制，產(chǎn)纖維素酶穩(wěn)定性好，產(chǎn)生的胞外纖維素酶易于分離純化，培養(yǎng)及代謝產(chǎn)物安全無毒等特點，常作為生產(chǎn)纖維素酶的菌種。本研究利用低能N＋注入誘變技術(shù)［3－5］篩選得到3株纖維素酶高產(chǎn)突變株，其產(chǎn)酶能力得到顯著提高，并對其發(fā)酵產(chǎn)酶營養(yǎng)因子進(jìn)行優(yōu)化研究。

1 實驗

1.1 菌種

里氏木霉T.reesei CICC 40358購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。CK-1、CK-2、CK-3和CK-4為T.reesei CICC 40358復(fù)壯分離得到的菌株。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 固體培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基［6］：馬鈴薯200 g／L，葡萄糖20 g／L，瓊脂20 g／L，pH值自然。

1.2.2 種子培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g／L，葡萄糖20 g／L，pH值自然，于121℃滅菌30 min，冷卻備用。

1.2.3 選擇出發(fā)菌株發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖10.0 g／L，磷酸二氫鉀8.0 g／L，磷酸氫二鉀3.0 g／L，蛋白胨2.0 g／L，硫酸胺1.5 g／L，酵母膏0.5 g／L，氯化鈣0.3 g／L，硫酸鎂0.3 g／L，土溫－80 0.2 g／L，于121℃滅菌30 min，冷卻備用。

1.2.3 篩選高產(chǎn)菌株發(fā)酵培養(yǎng)基 麩皮40.0 g／L，微晶纖維素10.0 g／L，葡萄糖10.0 g／L，磷酸二氫鉀8.0 g／L，磷酸氫二鉀3.0 g／L，蛋白胨2.0 g／L，硫酸胺1.5 g／L，酵母膏0.5 g／L，氯化鈣0.3 g／L，硫酸鎂0.3 g／L，土溫－80 0.2 g／L，于121℃滅菌30 min，冷卻備用。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子培養(yǎng)方法 在250 mL搖瓶中裝入50 mL種子培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)好的固體培養(yǎng)基上的孢子制備成孢子懸液，接種3 mL（約2.0×108個孢子）到種子培養(yǎng)基中，于28℃，150 r／min震蕩培養(yǎng)24 h，制成種子培養(yǎng)液。

1.3.2 發(fā)酵方法 在250 mL搖瓶中裝入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液以10%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃，150 r／min震蕩培養(yǎng)96 h，得到纖維素酶發(fā)酵液。

1.4 高產(chǎn)菌株的篩選方法

1.4.1 篩選高產(chǎn)菌株 以N＋作為注入離子，以10 keV為注入能量（低能離子束能量范圍為10～100 keV），150×1014N＋／cm2為注量，對出發(fā)菌株進(jìn)行注入處理。處理后的孢子用無菌生理鹽水洗脫，涂布到固體培養(yǎng)基上，在28℃下培養(yǎng)1～2 d，挑選單菌落分別轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d，用于種子培養(yǎng)及纖維素酶發(fā)酵實驗。發(fā)酵結(jié)束后測定羧甲基纖維素酶活力，篩選單位體積發(fā)酵液中羧甲基纖維素酶活力高的菌株。

1.4.2 遺傳穩(wěn)定性考察 為了確保篩選到的高產(chǎn)菌的遺傳穩(wěn)定性，對其遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行考察。每代實驗過程為：高產(chǎn)菌株自然分離→選單菌落→斜面培養(yǎng)→種子培養(yǎng)→發(fā)酵，測定纖維素酶的活力。共傳5代，每代均做3個平行樣。

1.5 羧甲基纖維素酶活力的測定及濾紙纖維素酶活力測定

將發(fā)酵液在4 000 r／min條件下離心10 min，分別取上清液1 mL，參考文獻(xiàn)［7］方法測定羧甲基纖維素酶活力（CMCase）及濾紙纖維素酶活力（FPase）。其中CMCase反映纖維素酶內(nèi)切酶活力，測定所需時間較短，所以在菌種誘變篩選過程中以此為測定指標(biāo)，篩選CMCase高的菌株，提高篩選效率；FPase反映纖維素酶的總酶活，測定所需時間較長，將此作為營養(yǎng)因子優(yōu)化的衡量指標(biāo)，以提高纖維素酶的總活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 出發(fā)菌株的選擇

纖維素酶是誘導(dǎo)酶，必須在誘導(dǎo)劑的作用下才能大量表達(dá)，而葡萄糖作為非誘導(dǎo)劑，在培養(yǎng)基中可以促進(jìn)菌體生長，但過量存在則會抑制纖維素酶的表達(dá)［8］。本研究在選擇出發(fā)菌株時培養(yǎng)基中不加入誘導(dǎo)劑，以考察菌株在沒有誘導(dǎo)的情況下自身產(chǎn)酶的能力，選擇自身產(chǎn)酶能力高的作為出發(fā)菌株。從結(jié)果可以看出，原始出發(fā)菌株里氏木霉T.reesei CICC 40358經(jīng)復(fù)壯后分離得到的菌株CK-1、CK-2、CK-3和CK-4的CMCase基本保持在0.50～0.80 IU／mL之間，F(xiàn)Pase基本保持在0.07～0.10 IU／mL之間，見表1。實驗選取酶活力最高的CK-2作為誘變選育的出發(fā)菌株。

表1 出發(fā)菌株產(chǎn)酶活力比較Table 1 Comparison of cellulase activity produced by different original strains

2.2 高產(chǎn)菌株的篩選

2.2.1 篩選譜系 以CK-2作為誘變選育的出發(fā)菌株，在培養(yǎng)基中加入麩皮和微晶纖維素，誘導(dǎo)纖維素酶的表達(dá)。從實驗結(jié)果可以看出，加入誘導(dǎo)劑后纖維素酶的活力顯著提高。整個誘變過程的誘變篩選圖譜見圖1。圖譜中菌種編號的首組數(shù)字表示N＋注量，第2組數(shù)字表示誘變次數(shù)，接著是菌株的編號。如250-2-6表示在注量為250×1014N＋／cm2條件下，在第2輪誘變中挑出的第6株高產(chǎn)突變株。經(jīng)過3次反復(fù)注入誘變，獲得3株高產(chǎn)突變菌株150-1-1，150-2-2和250-2-6（見粗箭頭）。將菌株的羧甲基纖維素酶活力從2.698 IU／mL提高到3.300 IU／mL以上（見表2）。其中150-2-2是突變菌株150-1-1又經(jīng)過N＋注入得到的高產(chǎn)菌株，說明N＋注入不僅可以作為誘變技術(shù)誘變篩選高產(chǎn)菌株，還可以作為篩選手段維持菌株的遺傳穩(wěn)定性。

圖1 纖維素酶高產(chǎn)突變株誘變篩選圖譜Fig.1 The mutational spectrum of high-yielding cellulase producing strains

2.2.2 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性 在工業(yè)生產(chǎn)中所用的菌株，必須具備穩(wěn)定的遺傳特性。對誘變選育得到3株高產(chǎn)突變株進(jìn)行連續(xù)5代遺傳穩(wěn)定性實驗，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，3株菌均很好的保持了穩(wěn)定高產(chǎn)的能力，羧甲基纖維素酶活力維持在3.300 IU／mL以上，較出發(fā)菌株CK-2增加了20%以上。

表2 高產(chǎn)突變菌株遺傳穩(wěn)定性結(jié)果Table 2 Stability of cellulase production（IU·mL－1）in screened mutants during five generations

2.2.3 高產(chǎn)菌株的發(fā)酵特性 高產(chǎn)突變菌株與出發(fā)菌株的發(fā)酵曲線見圖2。發(fā)酵前期（0～24 h）原始出發(fā)菌株與突變菌株的發(fā)酵水平相當(dāng)，突變菌株產(chǎn)酶能力略高于出發(fā)菌株；但發(fā)酵中后期高產(chǎn)突變菌株產(chǎn)酶能力表現(xiàn)突出，明顯高于原始出發(fā)菌株，在96～120 h達(dá)到發(fā)酵終點，羧甲基纖維素酶活力維持在3.300 IU／mL以上。

2.3 發(fā)酵產(chǎn)酶營養(yǎng)因子優(yōu)化

2.3.1 Plackett-Burman實驗設(shè)計 以篩選得到的高產(chǎn)菌株里氏木霉T.reesei 150-1-1為實驗菌株，采用未經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)基（1.2.3節(jié)）發(fā)酵此菌株，所得到的濾紙酶活力維持在2.000 IU／mL。根據(jù)經(jīng)驗數(shù)據(jù)［9］選擇發(fā)酵培養(yǎng)基中微晶纖維素（X1）、麩皮（X2）、磷酸二氫鉀（X4）、磷酸氫二鉀（X5）、蛋白胨（X6）、硫酸銨（X8）和葡萄糖（X9）7個因素進(jìn)行考察，而其他成分由于用量較少不在本研究中進(jìn)行優(yōu)化。每個因素?。?和1兩個水平，高水平取低水平的2倍，進(jìn)行實驗次數(shù)N＝12的實驗，響應(yīng)值為濾紙酶活力。另設(shè)2個虛擬列X3和X7，對應(yīng)表3中的第3列和第7列，以考察實驗誤差。

圖2 高產(chǎn)突變菌株與出發(fā)菌株的發(fā)酵曲線Fig.2 Fermentation curves of mutant stains and original strain

表3 N＝12的Plackett-Burman實驗設(shè)計與結(jié)果1）Table 3 Plackett-Burman design and its results

2.3.2 Plackett-Burrman實驗篩選影響產(chǎn)酶主要營養(yǎng)因子 根據(jù)里氏木霉生長所需營養(yǎng)要素的基本原則和發(fā)酵影響因素的一般規(guī)律，結(jié)合相關(guān)的文獻(xiàn)報道［10］和作者的前期實驗結(jié)果選取微晶纖維素、麩皮等7個因素進(jìn)行Plackett-Burman實驗，并對實驗結(jié)果進(jìn)行分析，得出各因素的T值和可信度水平［11］。實驗設(shè)計及實驗結(jié)果見表3，各因素主效應(yīng)分析結(jié)果見表4。由表4的顯著性分析結(jié)果可知，在T.reesei產(chǎn)纖維素酶過程中，葡萄糖、麩皮和微晶纖維素對產(chǎn)酶影響顯著，可考慮作為主要因素進(jìn)行下一步實驗；此外在上述7個影響產(chǎn)酶的相關(guān)因素中，只有磷酸氫二鉀呈正效應(yīng)，在下一步實驗中，將其取值固定在高水平，其他因素取值則固定在低水平。

表4 Plackett-Burman實驗設(shè)計的因素水平及效應(yīng)分析Table 4 Level，code of variable and results of Plackett-Burman design

2.3.3 最陡爬坡實驗 根據(jù)Plackett-Burrman實驗結(jié)果設(shè)計主要影響因素的最陡爬坡路徑，其中葡萄糖、麩皮和微晶纖維素均呈負(fù)效應(yīng)（見T檢驗結(jié)果），應(yīng)減小。根據(jù)這3個因素效應(yīng)大小的比例設(shè)定它們的變化方向及步長進(jìn)行實驗，設(shè)計及結(jié)果如表5所示。由結(jié)果可知，最優(yōu)發(fā)酵條件可能在實驗3與實驗4之間，故以實驗3的條件為響應(yīng)面實驗的中心點。

表5 最陡爬坡實驗設(shè)計及其實驗結(jié)果Table 5 Path of the steepest ascent experiment design and its result

2.3.4 響應(yīng)面分析實驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)因子組成 依據(jù)Plackett-Burrman實驗和最陡爬坡實驗確定的顯著影響T.reesei產(chǎn)酶發(fā)酵的因子及水平，采用旋轉(zhuǎn)中心組合實驗設(shè)計法對其顯著影響因子進(jìn)行3因素5水平的響應(yīng)面分析實驗，以葡萄糖（X′1）、麩皮（X′2）和微晶纖維素（X′3）濃度為自變量，以濾紙酶活為響應(yīng)值，實驗設(shè)計及結(jié)果見6。

分析后的實驗結(jié)果以如下的二階經(jīng)驗?zāi)Ｐ蛯ψ兞康南鄳?yīng)行為進(jìn)行表征：

式中：Y——系統(tǒng)相應(yīng)；β0——偏移項；βi——線性偏移系數(shù)；βii——二階偏移系數(shù)；βij——交互效應(yīng)系數(shù)；X′i——各因素水平值。

按照上述設(shè)計的方案進(jìn)行2組實驗，取濾紙酶活的平均值作為實驗結(jié)果。應(yīng)用Statistica軟件，將表中16個實驗點的結(jié)果進(jìn)行回歸分析，確定葡萄糖、麩皮和微晶纖維素濃度3個因子對T.reesei 150-1-1產(chǎn)酶的影響，方程如下：

式中：X′1——葡萄糖的編碼水平；——麩皮的編碼水平；——微晶纖維素的編碼水平。上述回歸方程式中、和的系數(shù)均為負(fù)值，拋物線的開口朝下，具有極大值點。對方程進(jìn)行方差分析，經(jīng)F檢驗，回歸方程中一次項、二次項對纖維素酶產(chǎn)量影響顯著（大于F值的概率小于0.05），另外，回歸方程的R2＝0.966 3，表明了96%的實驗數(shù)據(jù)變異性可用此回歸模型來解釋，說明所擬合的回歸方程擬合度良好，失擬較小，可以用該方程替代實驗點結(jié)果進(jìn)行分析。通過上述回歸方程繪制三維響應(yīng)面圖，見圖3，圖中所示的響應(yīng)面證實了擬合面有真實的最大值，即各具體因子都有一個最適宜的濃度。對上述濾紙酶活的二次回歸方程取一階偏導(dǎo)，令其等于零并整理得：X′1＝－0.556，X′2＝－0.695，X′3＝0.871，即當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度4.9 g／L，麩皮23.0 g／L和微晶纖維素7.7 g／L時，理論最大濾紙酶活為2.450 IU／mL。

表6 纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基旋轉(zhuǎn)中心組合實驗設(shè)計及其結(jié)果Table 6 Experimental design and results of central composite rotatable design（CCRD）for cellulase fermentation medium

圖3 各因素交互作用交互對濾紙酶活力的影響Fig.3 Effects of interaction of several factors on FDase

2.3.5 纖維素酶最優(yōu)發(fā)酵營養(yǎng)因子組成及驗證實驗 根據(jù)優(yōu)化實驗結(jié)果得到最優(yōu)的發(fā)酵營養(yǎng)因子組成為：葡萄糖4.9 g／L，麩皮23.0 g／L，微晶纖維素7.7 g／L，磷酸二氫鉀8.0 g／L，磷酸氫二鉀3.0 g／L，蛋白胨2.0 g／L，硫酸銨1.5 g／L，酵母膏0.5 g／L，氯化鈣0.3 g／L，硫酸鎂0.3 g／L，土溫－80 0.2 g／L。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行驗證實驗，3批搖瓶發(fā)酵實驗測得的纖維素酶濾紙酶活力分別為2.43、2.48和2.41 IU／mL，平均值為2.44 IU／mL，實驗值與模擬值相差0.45%，可見該模型可以較好的預(yù)測實際發(fā)酵情況；優(yōu)化后T.reesei 150-1-1濾紙酶活力較優(yōu)化前（2.00 IU／mL）提高了22.0%，從而也證明了響應(yīng)面優(yōu)化纖維素酶發(fā)酵條件的可行性。

3 結(jié)論

低能離子注入技術(shù)對纖維素酶產(chǎn)生菌T.reesei具有較好的誘變效果，合適的注量可以使纖維素酶產(chǎn)生菌的產(chǎn)酶能力得到明顯的提高。

3.1 應(yīng)用低能N＋注入技術(shù)對纖維素酶產(chǎn)生菌T.reesei進(jìn)行誘變選育，在能量為10 keV，注量為150×1014和250×1014N＋／cm2的條件下分別篩選得到3株纖維素酶高產(chǎn)菌株，即150-1-1、150-2-2和250-2- 6；連續(xù)5代遺傳穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，所得到的高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性較好，羧甲基纖維素酶活力均提高到3.300 IU／mL以上，較出發(fā)菌株（2.698 IU／mL）提高20%以上。

3.2 應(yīng)用Plackett-Burman實驗設(shè)計法和旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計法優(yōu)化高產(chǎn)菌株150-1-1發(fā)酵營養(yǎng)因子組成，最優(yōu)的發(fā)酵營養(yǎng)因子組成為：葡萄糖4.9 g／L，麩皮23.0 g／L，微晶纖維素7.7 g／L，磷酸二氫鉀8.0 g／L，磷酸氫二鉀3.0 g／L，蛋白胨2.0 g／L，硫酸銨1.5 g／L，酵母膏0.5 g／L，氯化鈣0.3 g／L，硫酸鎂0.3 g／L，土溫－80 0.2 g／L，在此優(yōu)化條件下T.reesei 150-1-1濾紙酶活力達(dá)到2.439 IU／mL，較優(yōu)化前（2.000 IU／mL）提高22.0%。

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Screening of High-producing Cellulase Strain by Low Energy N＋I(xiàn)mplantation and Optimization of Fermentation Nutrient Factors

ZHANG Ning，JIANG Jian-chun，YANG Jing，WEI Min，ZHAO Jian，TONG Ya-juan
（Institute of Chemical Industry of Forest Products，CAF；National Engineering Lab.for Biomass Chemical Utilization；Key and Open Lab.of Forest Chemical Engineering，SFA；Key Lab.of Biomass Energy and Material，Jiangsu Province，Nanjing 210042，China）

Cellulase producing strain Trichoderma reesei was mutated by low energy N＋implantation.When the implantation energy was 10 keV，and the implantation doses were 150×1014and 200×1014N＋／cm2，three high yield mutant strains were obtained.Their cellulase yield reached 3.300 IU／mL，and improved over 20.0%than that of original strain（2.698 IU／mL）.Furthermore，mutant strains had better heredity stability after five passages.Plackett-Burman and central composite rotatable design experiment were applied to optimize the concentration of nutrient factors for cellulase production.The changing patterns of glucose，wheat bran and microcrystalline cellulose were obtained，and the corresponding response surface analysis diagram were also obtained.Experimental results showed that glucose，wheat bran and microcrystalline cellulose had an individual significant influence on cellulose production.The optimum concentration of nutrient factors for cellulase production was 4.9 g／L of glucose，23.0 g／L of wheat bran，and 7.7 g／L of microcrystalline cellulose.Under the optimized conditions，the cellulase yield of T.reesei 150-1-1 reached 2.439 IU／mL，with a 22%increase than that before optimization.

N＋ion implantation；Trichoderma reesei；cellulase

TQ 352；Q815

A

1673-5854（2014）04-0028-07

10.3969／j.issn.1673-5854.2014.04.006

2014-01-23

國家自然科學(xué)基金資助項目（31100429）

張寧（1978—），女，吉林白城人，副研究員，博士，主要從事生物質(zhì)能源及工業(yè)微生物研究工作

*通訊作者：蔣劍春（1955—），男，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，從事林產(chǎn)化學(xué)加工和生物質(zhì)能源開發(fā)技術(shù)研究；E-mail：bio-energy＠163.com。