王正冠，劉一凡，李芮冰，徐舒敏，郭宇妮，王成彬，陳宜鴻

解放軍總醫(yī)院，北京 1008531醫(yī)學保障部；2臨床檢驗科

依達拉奉對吸入性肺損傷大鼠肺組織的保護作用

王正冠1，劉一凡2，李芮冰2，徐舒敏2，郭宇妮2，王成彬2，陳宜鴻1

解放軍總醫(yī)院，北京 1008531醫(yī)學保障部；2臨床檢驗科

目的探討依達拉奉對黑火藥煙霧所致吸入性肺損傷大鼠的保護作用。方法將24只雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組(C組)、吸入性肺損傷組(S組)和依達拉奉組(E組)，每組8只。除正常對照組外，其余各組大鼠使用自制發(fā)煙裝置構(gòu)建吸入性肺損傷模型。造模成功后依達拉奉組按9 mg/kg腹腔注射依達拉奉注射液；正常對照組、吸入性肺損傷組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液12 ml/kg。于第7天從大鼠腹主動脈取血，檢測各組大鼠動脈血氣；肺濕/干重比(lung wet-todry weight ratio，W/D)；留取各組大鼠腹主動脈血液樣本，離心取血清，待檢測腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)含量。留取肺組織，制備肺組織勻漿后測定髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。取部分右肺組織，經(jīng)4%甲醛溶液固定后做病理蘇木精-伊紅(HE)染色切片，光鏡觀察。結(jié)果與S組相比，E組大鼠動脈中PaO2水平升高(P＜0.01)，大鼠血清中IL-6、TNF-α水平降低并降低肺組織中MPO活性及MDA含量(P＜0.01)。光鏡下觀察，E組肺組織較S組肺組織水腫減輕，炎性細胞浸潤減少。結(jié)論依達拉奉可能通過抑制自由基的產(chǎn)生及減少部分炎性介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，減輕煙霧吸入性肺損傷大鼠體內(nèi)炎性反應，對肺組織起到一定的保護作用。

依達拉奉；吸入性肺損傷；大鼠

在戰(zhàn)爭或軍事演習等特殊環(huán)境中常使用大量火藥，軍事人員極易因長期暴露于此環(huán)境而引發(fā)急性呼吸道和肺損傷，如化學性肺水腫、吸入性肺炎等，嚴重者甚至發(fā)展為呼吸衰竭[1]。森林大火以及日常發(fā)生的民用設施火災所致人員死亡中，約80%是由于吸入燃燒產(chǎn)生的有毒氣體致死而非燒傷[2]。大量煙霧進入肺部后，可引起肺組織發(fā)生過度炎癥反應，造成機體組織損傷，其中氧自由基、細胞因子等起重要作用[3]。吸入性損傷發(fā)生后，系統(tǒng)性炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)及缺氧中毒等因素可導致其他臟器繼發(fā)性損傷，最終導致多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction failure，MODF)發(fā)生[4]。依達拉奉是一種有效的氧自由基清除劑，具有抑制脂質(zhì)過氧化的抗氧化能力，可以抑制腦細胞(血管內(nèi)皮細胞和神經(jīng)細胞)的過氧化作用，延遲神經(jīng)細胞死亡，臨床主要用于腦缺血以及腦缺血引起的腦水腫和組織損傷[5]。急性肺損傷時自由基、細胞因子等炎性介質(zhì)的大量產(chǎn)生是加重肺組織損傷的重要因素，自由基清除劑可能對煙霧引起的急性肺損傷有治療作用。本研究擬探討依達拉奉對煙霧所致急性肺損傷的治療作用及其機制。

材料和方法

1 實驗動物 健康成年雄性Wistar大鼠24只，體質(zhì)量200 ～ 220 g，由本院實驗動物中心提供，合格證號SCXK(京)2012-0001。大鼠于清潔房中飼養(yǎng)，溫度21 ～ 24℃，濕度50% ～ 60%。

2 主要藥物及試劑 依達拉奉(規(guī)格：5 ml，10 mg，南京先聲東元制藥有限公司，批準文號：國藥準字H20031342)，硝酸鉀、碳粉、硫磺粉(純度99.9%，200目，北京西四化工原料公司)，大鼠IL-6ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) ELISA試劑盒(美國R&D公司)，大鼠髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)試劑盒、大鼠丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京建成公司)，微量加樣器(Eooendorf)，光學顯微鏡(OLYMPUS)，酶標儀(美國AWARENESS)

3 實驗分組及動物模型制備 將24只雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組(C組)、吸入性肺損傷組(S組)和依達拉奉組(E組)，每組8只?？瞻讓φ战M大鼠暴露于動物煙熏箱的空氣中8 min，依達拉奉組、煙熏組置于動物煙熏箱中，并在10 g火藥產(chǎn)生的煙霧中暴露8 min，制作黑火藥煙霧吸入性肺損傷的大鼠模型。依達拉奉組大鼠暴露后按9 mg/kg腹腔注射依達拉奉注射液；正常對照組，吸入性肺損傷組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液12 ml/kg。所有大鼠均于暴露后第7天處死。

4 動脈血氣分析 麻醉大鼠并取腹主動脈血1 ml，于30 min內(nèi)采用羅氏Cobasb血氣分析儀進行動脈血氣分析。

5 計算肺濕/干重比(lung wet-to-dry weight ratio，W/D)值 處死大鼠后取右肺前葉及中葉，拭干表面血液后稱濕重并記錄，然后放入60℃烘箱烘烤48 h至恒重并記錄干重，計算W/D值。

6 肺組織MPO活性及肺組織MDA含量測定 取肺組織100 mg，置于液氮中研磨后以1∶9比例加入0.9氯化鈉注射液，制成10%的肺組織勻漿，采用MPO及MDA試劑盒，按照試劑盒說明書測定肺組織MPO活性及MDA含量。

7 血清IL-6、TNF-α含量 大鼠麻醉后腹主動脈取血，3 000 r/min離心15 min后取上清液，用ELISA方法按照說明書測定大鼠血清中IL-6、TNF-α含量。

8 肺組織病理學檢查 觀察肺組織大體病理改變，取右肺后葉浸入4%中性緩沖甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，常規(guī)HE染色后光鏡下觀察。

9 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布及方差齊性的計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，與對照組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 動脈血氣分析 與C組比較，S組PaO2明顯降低，PaCO2明顯升高(P＜0.01)。給予依達拉奉處理后，E組較S組PaO2升高(P＜0.05)且與C組無統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，E組較S組PaCO2降低但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

2 肺W/D值 S組W/D值顯著高于C組(P＜0.01)，E組W/D值顯著低于S組(P＜0.01)。見表1。

3 大鼠肺組織MPO活性、MDA含量比較 S組MPO、MDA值顯著高于C組(P＜0.01)，E組MPO、MDA值顯著低于S組(P＜0.01)。S組與C組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.01)。見表1。

表1 各組大鼠PaO2、PaCO2、W/D值，肺組織MPO活性、肺組織MDA含量及血清TNF-α、IL-6水平Tab. 1 PaO2, PaCO2and W/D value, MPO activity and MDA content in lung tissue and levels of TNF-α and IL-6 in serum (±s，n=8)

表1 各組大鼠PaO2、PaCO2、W/D值，肺組織MPO活性、肺組織MDA含量及血清TNF-α、IL-6水平Tab. 1 PaO2, PaCO2and W/D value, MPO activity and MDA content in lung tissue and levels of TNF-α and IL-6 in serum (±s，n=8)

aP＜0.05, vs group C;bP＜0.05, vs group S;cP＜0.01, vs group C;dP＜0.01, vs group S

Group (n=8)PaO2(mmHG)PaCO2(mmHG)W/DMPO (U/g)MDA (nmol/mg prot)IL-6 (pg/ml)TNF-α(pg/ml) C87.37±3.6943.82±2.574.23±0.080.81±0.081.23±0.1523.21±1.6820.60±2.60 S59.60±9.86ac58.25±3.87ac5.95±0.46ac1.66±0.20ac2.16±0.21ac55.18±6.78ac61.88±4.91acE79.02±9.57abd53.92±8.22ac4.63±0.62abd0.91±0.12bd1.46±0.35bd34.86±4.18abcd27.24±3.32abd

4 大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 S組TNF-α、IL-6水平顯著高于C組(P＜0.01)，E組TNF-α、IL-6水平顯著低于S組(P＜0.01)。E組IL-6水平較C組顯著升高(P＜0.01)，E組TNF-α水平較C組顯著升高(P＜0.05)。見表1。

5 病理學表現(xiàn) 活體解剖大鼠后觀察大鼠肺組織顏色、柔軟度及彈性。C組顏色呈微粉紅色，質(zhì)地柔軟，彈性佳。在光鏡下觀察肺組織病理切片，可見C組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，肺泡間隔一致，無炎細胞浸潤(圖1A)。S組整體呈微黑色，且有少量出血斑塊，肺泡腔增大，肺泡間隔增厚，可見炎細胞浸潤，彈性較差(圖1B)。E組大鼠肺呈肉紅色，彈性尚可。病理切片顯示肺泡間質(zhì)炎性浸潤均較S組明顯減輕，肺泡腔未見滲出(圖1C)。

討 論

當人體吸入熱力物質(zhì)、有毒氣體或刺激性物質(zhì)后，會引起吸入性肺損傷，導致單核巨噬細胞及中性粒細胞等的活化和積聚，釋放髓過氧化物酶、氧自由基及多種炎性細胞因子等。同時會導致肺部微血管被中性粒細胞和血管內(nèi)皮細胞黏附從而阻塞，加重局部組織缺血缺氧，使得血管內(nèi)皮通透性增加，進一步加速肺組織水腫的發(fā)生，加重肺部炎癥反應[6-7]。目前，初步使用的急性肺損傷治療藥物有血管舒張劑的吸入治療(一氧化氮吸入、前列環(huán)素吸入等)、腎上腺糖皮質(zhì)激素、非甾體類抗炎藥物、酮康哇等，但總體療效不甚滿意。因此，迄今尚無安全有效的早期藥物干預和遏制疾病進展的強力治療手段。依達拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮)是強效的自由基清除劑，可通過電子轉(zhuǎn)移作用清除自由基[8]。可減輕中性粒細胞浸潤及細胞膜脂質(zhì)過氧化連鎖反應，抑制脂質(zhì)自由基生成，促炎細胞因子表達下調(diào)[9-10]。張中軍等[11]用依達拉奉治療燒傷休克肺損傷大鼠，用藥后6 h血漿MDA明顯降低，SOD、GSH、GSHPX明顯升高，與模型組比較有統(tǒng)計學差異。Fang等[12]的研究發(fā)現(xiàn)對重度燒傷大鼠給予依達拉奉可以改善嚴重燒傷引起的肺水腫和氧合減低。

本實驗使用實驗室自制黑火藥發(fā)煙裝置建立大鼠吸入性肺損傷模型，使用依達拉奉進行干預[13]。血氣結(jié)果表明，依達拉奉可顯著改善吸入性肺損傷大鼠的PaO2(P＜0.01)，使之恢復正常水平，同時降低了PaCO2水平，但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。肺組織W/D值可衡量肺部發(fā)生炎癥后水腫情況。本研究結(jié)果顯示，與S組比較，E組可有效降低W/D值(P＜0.01)。MPO活性可間接反映組織中性粒細胞浸潤的嚴重程度[14]。本實驗結(jié)果顯示，依達拉奉能顯著降低吸入性肺損傷大鼠的MPO活性(P＜0.01)，且與正常組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。提示依達拉奉能有效抑制中性粒細胞的滲出及MPO的釋放，減輕肺組織的損傷。MDA是脂質(zhì)過氧化反應的最終產(chǎn)物，其含量可反映組織中自由基的多少及脂質(zhì)過氧化程度[15]。S組MDA含量增加表明吸入黑火藥煙霧可破壞肺組織細胞膜結(jié)構(gòu)，依達拉奉可降低MDA含量(P＜0.01)且與正常組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，表明依達拉奉具有抗氧化作用。

煙霧吸入性損傷使肺泡巨噬細胞過度刺激，產(chǎn)生大量氧自由基、IL-6、TNF-α等，使肺毛細血管通透性增加，導致肺水腫程度加重[16]。TNF-α等多種炎性介質(zhì)以及細胞因子，致使血管通透性增高，導致肺水腫形成，氣道阻塞[17]。血漿中IL-6在炎性疾病中被視為預示多臟器功能衰竭及死亡的重要標志[18]。本實驗通過血清TNF-α和IL-6水平間接反映肺組織炎性損傷的程度。根據(jù)本實驗結(jié)果，煙霧吸入性損傷后，血清中TNF-α和IL-6水平均升高，依達拉奉能有效降低由煙霧吸入性損傷引起的促炎因子IL-6、TNF-α水平(P＜0.01)。

圖 1 大鼠肺組織HE染色組織學觀察(HE×100) A： 正常組； B： 煙熏組； C：依達拉奉組Fig. 1 Histology of HE-stained lung tissue (HE×100) A: normal group; B: smoke group; C: edaravone group

綜上所述，由于依達拉奉能夠減輕氧自由基或活性氧的破壞作用，所以依達拉奉對吸入性肺損傷的肺組織也應有保護作用[19]。本研究結(jié)果顯示，依達拉奉可通過調(diào)節(jié)炎性因子的平衡及抗氧化對黑火藥煙霧所致大鼠肺損傷發(fā)揮保護作用。

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Protective effect of Edaravone on inhalation lung injury caused by black gunpowder smoke in rats

WANG Zheng-guan, LIU Yi-fan, LI Rui-bing, XU Shu-min, GUO Yu-ni, WANG Cheng-bin, CHEN Yi-hong
1Department of Medical Security;2Department of Clinical Laboratory Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

WANG Cheng-bin. Email: wangcb301@126.com; CHEN Yi-hong. Email: 9578CYH@sina.com

ObjectiveTo explore the protective effect of Edaravone on inhalation lung injury caused by black gunpowder smoke in rats.MethodsTwenty four male Wistar rats were randomly divided into three groups (n=8): normal control group (C), inhalation lung injury group (S), Edaravone group (E). The rat model of inhalation lung injury was reproduced by a self-made smoke generator. Rats in E group were given 9 mg/kg of Edaravone by intraperitoneal injection. And at the same time the control group (C) and inhalation group (S) were injected normal saline (12 ml/kg). The animals were sacrificed seven days later, and the arterial blood gas values, lung wet-to-dry weight ratio (W/D) were tested. The blood samples were centrifugalized and the content of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) in serum were determined. The content of myeloperoxidase (MPO) activity and malondialdehyde (MDA) in lung tissue were detected. And the right lung tissue which was fixed by 4% of formaldehyde solution was observed by HE.ResultsThe level of PaO2in group E were higher than in group S (P＜0.01), however, TNF-α, IL-6 in serum, MPO activity in lung tissue and MDA content in group E were lower than in group S (P＜0.01). Histopathological observation showed less inflammatory exudates and infiltrations in group E than in group S.ConclusionEdaravone shows a protective effect on inhalation lung injury caused by black gunpowder smoke in rats by inhibiting the production of free radical and the release of inflammatory mediators.

edaravone; inhalation lung injury; rats

R 563.9

A

2095-5227(2014)11-1151-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.11.0191222221

時間：2014-07-15 14:45 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140715.1445.008.html

2014-05-11

全軍“十二五”醫(yī)學科研基金面上項目(CWS12J021)

Supported by the "12th Five-Year" Medical Science Research Foundation of PLA(CWS12J021)

王正冠，男，在讀碩士。研究方向：戰(zhàn)時煙霧吸入致肺損傷的炎癥反應機制及預防治療措施。Email: 672354871@qq.com

王成彬，男，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導師。Email: wangcb301@126.com；陳宜鴻，男，博士，主任藥師，碩士生導師。Email: 9578CYH@sina.com