張新勝，劉 釗，王 覲，張 永，劉英華，徐 慶，于曉明，楊雪艷，薛長勇

解放軍總醫(yī)院 營養(yǎng)科，北京 100853

基礎研究

中鏈甘油三酯對高膽固醇血癥小鼠膽固醇逆轉運的影響

張新勝，劉 釗，王 覲，張 永，劉英華，徐 慶，于曉明，楊雪艷，薛長勇

解放軍總醫(yī)院 營養(yǎng)科，北京 100853

目的觀察中鏈甘油三酯(medium-chain triglyceride，MCT)對高膽固醇血癥小鼠體質量、體脂、血清脂質水平及其體內膽固醇逆轉運的影響。方法建立高膽固醇血癥小鼠模型，將30只造模成功小鼠隨機分為中鏈甘油三酯組(MCT組)和長鏈甘油三酯(long-chain triglyceride，LCT)組，給予含2% MCT和2% LCT高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)3個月后，腹腔注射富含3H膽固醇的RAW264.7巨噬細胞懸液，單籠飼養(yǎng)3 d，收集每天糞便，腹主動脈取血，測量體長、肝及附睪脂肪組織。測定血清脂質，用液閃計數儀測定血清、肝及糞便中3H膽固醇放射活性。結果實驗結束時，與LCT組相比，MCT組小鼠空腹體質量、體質量增加量、Lee氏指數、附睪脂肪重量及血清TC水平顯著降低(P＜0.05)；兩組血清HDL-C、n-HDL-C和TG差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；與LCT組比較，MCT組血清和肝3H膽固醇水平均顯著降低(P＜0.05)，同時48 h糞便中3H膽固醇流出量及72 h總量顯著增加(P＜0.05)。結論MCT能夠減輕高膽固醇血癥小鼠體質量，減少體脂肪積累和改善膽固醇代謝，且能促進體內膽固醇的逆轉運。

膽固醇逆轉運；中鏈甘油三酯；長鏈甘油三酯；3H-膽固醇

膽固醇逆轉運(reverse cholesterol transport，RCT)是機體將外周巨噬細胞膽固醇通過高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)介導轉運至肝，再通過膽汁排泄到體外的過程。目前，認為RCT是對抗動脈粥樣硬化(artherosclerosis，As)發(fā)生的主要機制之一，因此，RCT也成為對抗AS新的研究靶點[1]。眾所周知膳食因素與心血管疾病的發(fā)生有關，特別是膳食脂肪酸與AS的發(fā)生和發(fā)展密切相關。有研究報道，飽和脂肪酸增加血清低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)水平，促進AS的發(fā)生[2]。而不飽和脂肪酸能夠保護心血管疾病，對抗AS的發(fā)生和發(fā)展，如ω-3脂肪酸(DHA和EPA)[3]。但并不是所有的飽和脂肪酸對心血管疾病都有害。中鏈脂肪酸(medium chain fatty acids，MCFA)為一種特殊的飽和脂肪酸，常見的有辛酸(C8∶0)和癸酸(C10∶0)，主要來源于母乳、牛奶及其制品、棕櫚仁油和椰子油等。我們前期的研究發(fā)現含有MCFA的中鏈甘油三酯(medium-chain triglyceride，MCT)能夠改善高甘油三酯血癥患者及肥胖C57BL/6J小鼠血清TC、TG、LDL-C及HDL-C水平，減少體脂肪蓄積，還能促進糞便的膽固醇和膽汁酸的排泄[4-6]。本研究以高膽固醇血癥小鼠模型為研究對象，觀察MCT對該小鼠體質量、體脂、血清脂質水平及其體內膽固醇逆轉運的影響，進一步探討MCT在防治AS發(fā)生及發(fā)展中的作用。

材料和方法

1 細胞及材料 RAW264.7巨噬細胞株由北京協(xié)和醫(yī)科大學細胞庫提供；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司；3H-膽固醇購自Perkin Elmer公司；氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)購自中國科學院協(xié)和生化研究所；中鏈甘油三酯和大豆油由日清奧利友(中國)投資有限公司提供，脂肪酸組成見文獻[7]。

2 C57BL/6J高膽固醇血癥小鼠模型的建立 70只雄性C57BL/6J小鼠(10周齡)，由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供，許可證號SCXK京2009-0007。普通飼料適應喂養(yǎng)1周后，按空腹體質量隨機選擇10只喂飼普通飼料AIN-96G(ND組)，余60只喂飼高脂高膽固醇飼料(HFC組)，4周后稱量空腹體質量，頜下靜脈采血檢測血清膽固醇，選擇體質量及血清膽固醇均高于普通飼料組小鼠2倍標準差的個體，即造模成功。

3 小鼠分組及干預 選取造模成功的C57BL/6J高膽固醇血癥小鼠30只，按照血清膽固醇和體質量隨機分為2組，每組15只，分別喂給高脂高膽固醇飼料+ 2% LCT(LCT組)、高脂高膽固醇飼料+ 2% MCT(MCT組)，飼料配方見表1。喂養(yǎng)12周后，每只小鼠腹腔注射制備好的富含3H膽固醇的巨噬細胞混懸液0.5 ml，之后單籠飼養(yǎng)3 d，分別收集每天糞便。第3天用1%的硫噴妥鈉0.1 ml腹腔注射麻醉后，腹主動脈取血，1 200 r/min離心5 min，取20 μl血清直接進行液閃計數，計算血清占注射總量的百分比。

4 細胞培養(yǎng)及干預 RAW264.7巨噬細胞培養(yǎng)條件：37℃，5% CO2，100%濕度培養(yǎng)箱，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。同位素標記細胞混懸液制備：取15 ml離心管加入終濃度為50 mg/L ox-LDL，再加入3H-膽固醇(干預濃度5 mCi/L)，37℃孵育30 min，最后加入DMEM培養(yǎng)基混勻，將制備好的干預液細胞培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱培育48 h。加入胰酶使貼壁細胞脫落和分散，DMEM沖洗2遍，用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將調整細胞數為10×106/ml后，細胞懸液轉移至1 ml注射器(置于冰上)，剩余的細胞懸液分別測定細胞及上清液中的放射活性，保證細胞放射活性所占比例＞95%。

表1 飼料成分表Tab. 1 Composition of feed for different groups (%)

5 小鼠體質量、體脂測量及血脂檢測 飼養(yǎng)期間每4周測1次空腹體質量(禁食不禁水12 h)，同時每隔1 d更換墊料和水，稱量飼料消耗量。實驗結束后，測量體質量、體長，分離肝及附睪脂肪組織并用萬分之一天平稱量。用酶法測定血清血脂包括TC、TG、HDL-C及n-HDL-C。

6 糞便的處理及放射活性測定 小鼠腹腔注射富含3H膽固醇的巨噬細胞混懸液后，分別測量第1、2、3天小鼠糞便膽固醇放射活性，并計算3 d總放射活性占注射總量的百分比。糞便的處理：用鑷子揀取小鼠糞便并稱重，將糞便轉移至組織勻漿器中，加入50%乙醇溶解糞便使?jié)舛葹?.114 kg/L，充分混勻1 ～ 2 min，取50 μl混勻液至2 ml液體閃爍液，振蕩混勻，過夜。第2天再振蕩液閃瓶，并進行液閃計數，計算糞便總放射活性及占注射總量的百分比。

7 肝脂質抽提及放射活性測定 準確稱取部分冷凍組織(約100 mg)放入玻璃勻漿器，加入正己烷/異丙醇(3∶2)，充分混勻10 min，1 200 r/min離心5 min，收集上清液，再重復抽提2遍，真空干燥，將干燥脂質溶于2 ml閃爍液，充分振搖混勻即可進行液閃計數，計算肝總放射活性及占注射總量的百分比。

8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理數據，數據均采用以±s表示。采用t檢驗進行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 C57BL/6J肥胖合并高膽固醇血癥小鼠模型的建立 HFC組和ND組小鼠分別給予高脂高膽固醇飼料和基礎飼料喂養(yǎng)4周后，HFC組和ND組小鼠平均體質量分別為(24.37±1.29) g和(22.39±0.66) g；HFC組和ND組小鼠血清總膽固醇水平分別為(3.6±0.38) mmol/L和(2.62±0.23) mmol/L。C57BL/ 6J高膽固醇血癥小鼠動物模型成功率達63%左右。

2 飼料攝入量情況 MCT組與LCT組比較，實驗期第4周、8周、12周飼料攝入量、飼料平均攝入量和能量平均攝入量差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表2。

3 兩組小鼠體質量及體脂變化 MCT組與LCT組比較，于0周、4周、8周空腹體質量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；但12周時MCT組空腹體質量、實驗期間體質量增加量、Lee氏指數以及附睪脂肪重量均低于LCT組(P＜0.05)。見表3。

表2 兩組小鼠飼料攝入量Tab. 2 Feed consumption during the experiment

表3 MCT對小鼠體質量、體脂、肝重及Lee氏指數的影響Tab. 3 Effect of MCT on body weight, body fat, liver weight and Lee's index

4 兩組小鼠血脂比較 實驗結束后MCT組血清TC水平明顯低于LCT組(P＜0.05)，但兩組血清HDL-C、n-HDL-C和TG差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表4。

5 肝、糞便、血清中3H-膽固醇的分布 實驗結束后，MCT組小鼠血清和肝3H膽固醇水平均明顯低于LCT組(P＜0.05)。此外，MCT組于注射3H膽固醇后48 h糞便中膽固醇流出量及72 h合計的膽固醇流出量均高于后者(P＜0.05)。見表5。

表4 兩組小鼠血脂比較Tab. 4 Effects of MCT and LCT on blood lipid and lipoprotein

表5 兩組小鼠體內3H膽固醇分布比較Tab. 53H cholesterol distribution after intraperitoneal injection of RAW264.7 macrophages with labeling of3H cholesterol in various groups

討 論

RCT是排除機體過多膽固醇的有效途徑之一，也是對抗AS形成的重要機制。早在1973年Glomset和Norum[8]就提出了這一概念，但沒有適當的方法檢測膽固醇逆轉運效率。本文參考Zhang等[9]的方法給小鼠腹腔注射富含3H膽固醇的巨噬細胞后，通過檢測血清、肝及糞便中3H膽固醇的放射活性來反映膽固醇的逆轉運效率。本方法3H放射能量低，對實驗操作者損害較小，而且檢測膽固醇逆轉運準確性和可靠性較高。

本研究成功建立了高膽固醇血癥小鼠模型，再給予富含MCT和LCT的飼料干預后，MCT組小鼠空腹體質量、實驗期間體質量增加量、Lee氏指數以及附睪脂肪重量均低于LCT組小鼠，并且血清膽固醇水平也顯著下降，這與我們前期研究的結果一致[10]。腹腔注射富含3H膽固醇的細胞混懸液后，MCT組小鼠血清和肝3H膽固醇水平均明顯低于LCT組。此外，MCT組小鼠糞便中膽固醇流出量明顯高于后者。這也說明了MCT較LCT明顯促進肥胖合并高膽固醇血癥小鼠體內膽固醇逆轉運，能夠防治AS的發(fā)生和發(fā)展。人們一直認為飽和脂肪酸能夠提高血清LDL-C水平、促進AS的形成，而不飽和脂肪酸卻能夠降低AS的發(fā)生。有研究報道，亞油酸能夠降低血清膽固醇水平而降低AS的發(fā)生，魚油能夠增強肝排出巨噬細胞及HDL來源的膽固醇而促進RCT[2,11]。本實驗同樣發(fā)現MCT能夠促進RCT，促進糞便膽固醇的排出，對AS具有一定保護作用。

RCT是一個復雜的轉運過程，主要包括膽固醇的流出、酯化和清除3個環(huán)節(jié)，并且受到多種酶及受體的調節(jié)。其中ATP結合盒轉運體超家族(ABCA1、ABCG1)及清道夫受體B族(SR-B1)介導了細胞膽固醇的流出，流出的膽固醇在卵磷脂膽固醇?；D移酶的催化下膽固醇酯化，使新生的HDL轉變?yōu)槌墒斓腍DL，肝表面SR-BI受體接受HDL中的膽固醇，主要在ABCG5及ABCG8的調控下促進合成膽汁酸，大部分進入肝腸循環(huán)，小部分隨著糞便排出體外。Marmillot等[12]報道魚油能夠增強HDL的運載能力而促進膽固醇的流出，亞麻酸能夠抑制固醇酰輔酶A脫氫酶1而降低膽固醇在泡沫細胞內的聚集[13]。也有研究報道稱雖然多不飽和脂肪酸能夠影響膽固醇的內平衡，但它們并不能改變ABCA1及肝X受體α基因的表達，也許和其他蛋白或基因表達相關[14]。關于MCT是如何促進RCT過程，我們研究小組細胞實驗發(fā)現中鏈脂肪酸C8∶0能夠促進THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇的流出(結果尚未發(fā)表)，MCT是否能夠調節(jié)RCT的相關蛋白或基因的表達，還需要進一步的探討。另外，MCT是否能夠影響AS的形成和發(fā)展還需要動物及臨床試驗進一步驗證。

總之，眾多基礎和臨床研究已經證實MCT能夠降低體質量、減少體脂及改善血脂代謝。本研究也證實了MCT能夠改善高膽固醇血癥小鼠體質量、體脂肪和血清膽固醇水平，而且能夠促進其體內膽固醇逆轉運，降低AS的發(fā)生。

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13 Zhang J， Kris-Etherton PM， Thompson JT， et al. Alpha-linolenic acid increases cholesterol efflux in macrophage-derived foam cells by decreasing stearoyl CoA desaturase 1 expression： evidence for a farnesoid-X-receptor mechanism of action［J］. J Nutr Biochem，2012， 23（4）： 400-409.

14 Salehipour M， Javadi E， Reza JZ， et al. Polyunsaturated fatty acids and modulation of cholesterol homeostasis in THP-1 macrophagederived foam cells［J］. Int J Mol Sci， 2010， 11（11）： 4660-4672.

Effects of medium-chain triglyceride on reverse cholesterol transport in mice with hypercholesterolemia

ZHANG Xin-sheng, LIU Zhao, WANG Jin, ZHANG Yong, LIU Ying-hua, XU Qing, YU Xiao-ming, YANG Xue-yan, XUE Changyong
Department of Nutrition, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

XUE Chang-yong. Email: cnxcy@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of medium-chain triglyceride (MCT) on reverse cholesterol transport in mice with hypercholesterolemia.MethodsThirty mice with hypercholesterolemia induced by feeding high-fat and cholesterol were randomly divided into 2 groups (MCT group and LCT group, n=15), and they were fed high-fat and cholesterol diets with 2% MCT or 2% long-chain triglyceride (LCT), respectively. Three months later, macrophage reverse cholesterol transport (RCT) was assessed by injecting3H-cholesterol labeled RAW264.7 macrophages intraperitoneally. After 3 days, feces were collected and the body length, liver and epididymides tissues were measured. The serum lipid was measured and the activity of3H-tracer in serum, liver and feces were determined by liquid scintillation method.ResultsAt the end of study, the body weight, weight gain, liver weight, Lee's index, epididymides fat weight and serum levels of TC were significantly lower in MCT group than those in LCT group (P＜0.05), while no significant difference showed in serum levels of HDL-C, n-HDL-C and TG between the two groups (P＞0.05). Compared with the LCT group, the3H-cholesterol in serum and liver were much lower in MCT group (P＜0.05), while the total3H-cholesterols in feces in 3 days experiment and at 48h after the injection of3H-cholesterol labeled RAW264.7 macrophages increased significantly (P＜0.05).ConclusionMCT can reduce the body weight and body fat, and it also can improve cholesterol metabolism and promote RCT in mice with hypercholesterolemia.

reverse cholesterol transport; medium-chain triglyceride; long-chain triglyceride;3H-cholesterol

R 589.2

A

2095-5227(2014)11-1133-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.11.015網絡出版時間：2014-09-18 09:50 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140918.0950.002.html

2014-05-14

國家自然科學基金項目(81172667)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(8117 2667)

張新勝，男，在讀碩士，主治醫(yī)師。Email: zhangxin sheng198431@126.com

薛長勇，男，碩士，主任醫(yī)師，碩士生導師，主任。Email: cnxcy@163.com