陸敏佳等

摘要：為了快速獲取高質(zhì)量的藜麥基因組DNA，采用改良的CTAB法、SDS法和高鹽低pH值法等3種方法分別提取藜麥不同組織（葉、莖、根部）的基因組DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法測定比較所提DNA的質(zhì)量和產(chǎn)量，同時進(jìn)行了PCR-SSR、SSCP等分子檢測。用不同方法提取藜麥不同組織部位DNA的結(jié)果表明：不同提取方法的凝膠檢測條帶均比較清晰，且無明顯降解；改良的CTAB法所提取的DNA產(chǎn)率最高，SDS法其次，而高鹽低pH值法最低；不同方法提取的葉片DNA產(chǎn)率均明顯高于根部和莖部；改良的CTAB法和高鹽低pH值法所提取的DNA質(zhì)量較好，多酚類化合物和多糖等雜質(zhì)去除得比較完全。PCR-SSR和SSCP檢測結(jié)果表明：不同方法和不同組織所提取的DNA均能跑出良好的條帶，適合進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)研究。

關(guān)鍵詞：藜麥；DNA提取方法；分子檢測；SSR；SSCP

中圖分類號： S512.901 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0042-04

收稿日期：2013-08-10

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31301372）；浙江省重大科技專項計劃（編號：2011C12030）；浙江農(nóng)林大學(xué)創(chuàng)新訓(xùn)練計劃（編號：201301004）。

作者簡介：陸敏佳（1992—），女，浙江嘉興人，研究方向為種子科學(xué)。E-mail：1035660826@qq.com。

通信作者：蔣玉蓉，博士，主要從事植物分子育種和種質(zhì)創(chuàng)新研究。E-mail：yurongjiang746@126.com。藜麥（Chenopodium quinoa Willd），又稱南美藜、藜谷、奎奴亞藜等，是一年生的藜科草本作物，原產(chǎn)于南美洲安第斯山脈海拔2 800～4 200 m的地區(qū)，分布于12°N～39°S的范圍，在安第斯山脈已有5 000多年的種植歷史，被印加人稱為“谷物之母”[1]。藜麥蛋白質(zhì)含量高，具有近乎完美的氨基酸組成，含有較高的鈣磷鐵，是聯(lián)合國FAO唯一認(rèn)定的完美營養(yǎng)食品，被譽為“未來的超級谷物”“營養(yǎng)黃金”“有機谷類之王”等[2-3]。研究表明，長期食用藜麥，對心臟病、高血壓、高血糖、高血脂等有很好輔助治療作用，此外還有增強免疫力、修復(fù)體力、補充營養(yǎng)、減肥等功效[4-5]。聯(lián)合國大會宣布2013為“國際藜麥年”，旨在讓世界更多地關(guān)注藜麥的生物多樣性和營養(yǎng)價值在提供糧食和營養(yǎng)安全等方面所發(fā)揮的作用。藜麥的營養(yǎng)和開發(fā)利用價值在最近幾十年才得到人們的廣泛認(rèn)識和重視。目前，藜麥的研究主要集中在生物學(xué)特性[6-7]、化學(xué)成分[8-9]、抗逆性等生理學(xué)特性[10-11]方面。與國外相比，我國對藜麥的研究還較少，尤其在藜麥分子生物學(xué)方面的研究幾近空白。獲取高質(zhì)量的DNA樣品是植物分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，而研究者對不同植物以及相同植物不同部位的DNA提取、處理方法又有所區(qū)別[12-16]，目前尚無關(guān)于藜麥基因組DNA提取方法的報道。本研究用改良的CTAB法、SDS法、高鹽低pH值法3種不同方法分別提取藜麥的幼葉、莖、根部基因組DNA，同時進(jìn)行SSR和SSCP等分子標(biāo)記檢測，旨在篩選出一種快速、簡便且可獲得高質(zhì)量DNA分子的提取方法，為進(jìn)一步開展藜麥分子生物學(xué)研究提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為藜麥品種PI596293，由浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。葉片的采集：取種植于田間的藜麥幼嫩葉片。莖、根部的采集：取PI596293種子置于發(fā)芽紙上，在25 ℃氣候箱中培養(yǎng)12 d，分別取莖、根部用于DNA提取。

1.2主要試劑

試驗試劑：EDTA、Tris、CTAB、PVP 40、SDS、β-巰基乙醇等均購自Sigma 公司；無水乙醇、氯仿、異丙醇、氯化鈉、醋酸鈉、醋酸鉀等為國產(chǎn)分析純；TaqDNA聚合酶、dNTP、DL2000 DNA Marker 購自TaKaRa 公司；引物由華大基因公司合成。

1.3DNA提取方法

分別取約0.15 g藜麥幼嫩的葉、莖、根于2 mL離心管中（設(shè)3次重復(fù)），用長柄鑷子夾住離心管管蓋放入液氮中速凍5 s，取出并用插有玻璃棒的電鉆快速充分研磨。

1.3.1CTAB法加入600 μL預(yù)熱的CTAB提取液[含0.1 mol/L Tris-HCl（pH值8.0）、0.02 mol/L EDTA（pH值8.0）、2%CTAB、2%PVP40、1 mol/L NaCl、0.2%β-巰基乙醇]，置于65 ℃水浴50～60 min，期間顛倒混勻數(shù)次；冷卻至室溫后加入等體積的氯仿-異戊醇-無水乙醇（76 ∶4 ∶20），顛倒混勻后于10 000 r/min離心10 min；吸上清液，加2倍體積的冰乙醇顛倒混勻，再將絮狀DNA挑出并用70%乙醇洗滌2次；風(fēng)干后加入80 μL ddH2O溶解，4 ℃冰箱保存。

1.3.2SDS法加入800 μL預(yù)熱的提取緩沖液[含 0.5 mol/L NaCl、0.1 mol/L Tris-HCl（pH值8.0）、0.05 mol/L EDTA（pH值8.0）、0.01 mol/Lβ-巰基乙醇]，再加入80 μL 20%SDS（使終濃度為2%），振蕩混勻后置于65 ℃水浴中 30 min，不停顛倒混勻；取出靜置至室溫，加入0.3 mL 5 mol/L 的醋酸鉀混勻，冰浴20 min后在 10 000 r/min 條件下離心10 min；加入等體積氯仿-異戊醇（24 ∶1），顛倒混勻后于12 000 r/min離心10 min；取上清液，加入0.7倍體積的預(yù)冷冰異丙醇，輕輕顛倒混勻后于-20 ℃放置20 min；12 000 r/min、常溫離心10 min，收集沉淀，用70%乙醇洗2次；風(fēng)干DNA并溶于60 μLddH2O中，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?

1.3.3高鹽低pH值法加入預(yù)熱的1 mL提取緩沖液（含0.1 mol/L NaAc、0.05 mol/L EDTA、0.5 mol/L NaCl、25% PVP、3% SDS、1%β-巰基乙醇），于65 ℃水浴30 min；取出靜置至室溫后于10 000 r/min離心10 min；取上清液，加入 2/3 體積的25 mol/L KAC（pH值4.8），冰上放置30 min后于10 000 r/min離心10 min；取上清液，加入等體積的氯仿-異戊醇（24 ∶1），反復(fù)顛倒混勻后于10 000 r/min離心10 min；取上清液，加入0.6倍體積的-20 ℃異丙醇，輕輕混勻后置于-20 ℃沉淀20 min；8 000 r/min離心10 min，所得沉淀用70%乙醇洗2次；DNA風(fēng)干后溶于60 μL ddH2O中，置于 4 ℃ 冰箱備用。

1.4DNA純度、濃度及得率檢測

用NanoDrop/ND1000核酸蛋白質(zhì)分析儀分別測定DNA樣品濃度、D260 nm/D280 nm值（≈1.8表示為純DNA；>1.9表示有RNA污染；<1.6表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染）。同時計算產(chǎn)率，即DNA得率，公式為：DNA得率（μg/g）=DNA量（μg）/取材量（g）。各取3 μLDNA溶液，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。

1.5基因組DNA的PCR檢測

參考Jarvis等的研究結(jié)果[17]，設(shè)計了SSR引物KCAA003、KAAT009。引物KCAA003的上游序列（5′→3′）為ACCTTTCGGCTGCTCAGATA，下游序列（5′→3′）為TGCTGATGTTGTTGCAGATG；引物KAAT009的上游序列（5′→3′）為AGTTGCCAACATGCAGAGC，下游序列（5′→3′）為CGACGACGCAAGACATTAGA。PCR反應(yīng)體系：1.5 μL 10×PCR buffer、1 μL模板DNA、0.3μL SSR引物、0.25 μL dNTPs（10 mmol/L）、0.15 μL Taq酶、11.5 μL ddH2O。擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min：94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物用15%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.6SSR分子檢測

取1 μL PCR擴增產(chǎn)物用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測，恒功率80 W，檢測時間30 min。電泳結(jié)束后，將膠浸入固定液（10%乙醇、0.05%冰醋酸）中，在搖床上固定10 min，用蒸餾水沖洗2遍；然后用0.2% AgNO3染色 20 min，再用蒸餾水漂洗1～2次（不得超過30 s）；最后用顯色液（含30 g/L NaOH，13.6 mL/L甲醛）顯色至條帶清晰，再用蒸餾水洗脫3次停顯。

1.7SSCP分子檢測

將PCR擴增產(chǎn)物與變性上樣液（含98%去離子甲酰胺、pH值為8.0的10 mmol/L EDTA、0.025%二甲苯氰、0.025%溴酚藍(lán)）按1 ∶5的比例加入0.5 mL微量離心管中，混勻。將樣品在98 ℃變性10 min后立即取出，置于冰浴中驟冷 10 min。取約5 μL變性樣品上樣，用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠于4 ℃恒溫電泳（恒功率80 W，12 h）檢測。然后進(jìn)行固定、銀染和顯影，方法步驟同上。

2結(jié)果與分析

2.1DNA質(zhì)量的凝膠電泳檢測

用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量是一種常用的檢測手段[18]。由圖1可以看出：用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測不同方法提取的藜麥基因組DNA的結(jié)果表明，不同組織中提取的DNA都能擴增出明顯的條帶，但葉片中的DNA濃度明顯高于莖和根。3種方法所提取的DNA樣品的濃度、純度及得率見表1。綜合分析試驗可知：改良的CTAB法提取的DNA得率最高，葉片、莖、根中的DNA得率分別為824.5、209.3、254.1 μg/g；改良的SDS法提取的DNA得率次之，分別為4960、207.2、231.4 μg/g；而高鹽低pH值法提取的DNA得率最低，分別為322.6、112.0、156.2 μg/g。3種方法提取的葉片DNA得率均為莖、根部的2倍以上，凝膠檢測結(jié)果與分光光度計的檢測結(jié)果一致。由表1還可以看出：CTAB法提取的DNA D260 nm/D280 nm介于1.7～1.8之間，說明蛋白、酚類、多糖等雜質(zhì)和RNA都去除得較干凈；SDS法提取的DNA D260 nm/D280 nm值表明，該法提取的基因組DNA質(zhì)量較好，基本無RNA和蛋白混雜；而高鹽低pH值法的D260 nm/D280 nm值表明，該法提取的葉片DNA可能有RNA污染或有降解。

2.2分子檢測

2.2.2SSCP分析SSCP（single strand conformation polymorphism，單鏈構(gòu)象多態(tài)性）是以構(gòu)象為基礎(chǔ)的檢測基因組中單核苷酸變異（SNP）的一種方法，具有快速、簡便、靈敏等特點，可將雙鏈水平無法檢測的DNA微小差異在單鏈水平上檢測出來[19]。由圖4可見，通過顯影，不同方法提取的不同組織DNA的PCR產(chǎn)物在變性后均能在12%凝膠中跑出清晰條帶。

3結(jié)論與討論

植物基因組DNA的提取方法目前有CTAB、SDS、高鹽低pH值法、尿素法、檸檬酸鈉法等[20]。建立簡單快速且能獲得高質(zhì)量DNA的提取方法，對利用SSR和SSCP等分子標(biāo)記研究和揭示藜麥種質(zhì)資源遺傳多樣性和遺傳特征顯得尤為重要。藜麥含有多糖、多酚及其他次生代謝產(chǎn)物[21-23]，這些次生物質(zhì)在DNA提取過程中會與核酸形成復(fù)合物，影響DNA的質(zhì)量和產(chǎn)量。本試驗結(jié)果表明，改良的CTAB、SDS和高鹽低pH值法提取的藜麥不同組織部位的DNA均能滿足 PCR-SSR 和SSCP等后繼的分子生物學(xué)分析。但不同方法提取葉片DNA的產(chǎn)率顯著高于根和莖部，因此宜采用葉片進(jìn)行藜麥基因組DNA的提取。

本研究表明，改良的CTAB法提取的基因組DNA產(chǎn)率最高，且較有效地去除了蛋白質(zhì)和多糖物質(zhì)，能夠獲得較純的DNA，這與在其他植物中DNA提取方法比較的研究結(jié)果一致[20，24-26]。本試驗在改良的CTAB和高鹽低pH值提取液中加了PVP-40、PVP（聚乙烯吡咯烷酮），它們是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，因而能夠有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它們可以與多糖結(jié)合，因此通過離心可以有效去除多糖，從而提高DNA的純度[27]，然而后者提取的DNA產(chǎn)率相比較低。

本研究所用的3種方法都用電鉆粉碎取代了手工研磨，節(jié)約了勞動力和成本。相比而言，改良的CTAB法葉片的DNA得率高，而提取時間比其他2種方法少20～30min左右，可大量節(jié)省科研工作時間，對將來開展藜麥圖譜構(gòu)建、QTL分析等有很好的輔助作用。本研究提取的對象是藜麥幼嫩組織，下一步將對其老葉的DNA提取方法作改進(jìn)研究。

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