楊旭，屈小玄，郭慶賀，蘭雪萍，呂遠平

(四川大學(xué)食品工程系，成都 610065)

0 引 言

蛋白凝塊現(xiàn)象是牛奶儲存過程中較為常見的質(zhì)量問題[1，2]。研究表明，蛋白凝塊是由牛奶中的蛋白酶水解乳蛋白生成肽、氨基酸所引起的[3-5]。為了控制蛋白酶引起的質(zhì)量問題，需要對牛奶中蛋白酶活力進行測定。

醬曲、糙米、豆粕等的蛋白酶活力測定已有成熟的方法[6-8]，而牛奶中蛋白酶活力的測定始終沒有統(tǒng)一的標準和方法。據(jù)文獻報道，采用的測定方法有甲醛法[9]、鄰苯二甲醛衍生法[10]和福林試劑法[11]，但對于不同測定方法的比較卻鮮有報道。

本研究選用福林法、鄰苯二甲醛衍生法和甲醛法這三種方法對牛奶中蛋白酶活力進行測定，評價選擇出更適合牛奶中蛋白酶活力的測定方法，為生產(chǎn)控制和產(chǎn)品質(zhì)量檢測提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售UHT利樂磚純牛奶；福林試劑，L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，酪素(化學(xué)純)，無水碳酸鈉，三氯乙酸，十二烷基磺酸鈉(SDS)，四硼酸鈉(分析純)，鄰苯二甲醛(化學(xué)純)，-巰基乙醇(分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901紫外可見分光光度計，LD4-2A低速離心機，HWS-26電熱恒溫水浴鍋，78HW-1恒溫磁力攪拌器，XK96-A快速混勻器，PHS-3C pH計。

1.3 方法

1.3.1 福林法測定牛奶中蛋白酶活力

參考GB/T 23527-2009的方法略作修改[12]。此方法原理是蛋白酶在一定的溫度和pH下能夠水解酪素底物，產(chǎn)生含有酚基的氨基酸如酪氨酸，在堿性條件下與福林試劑反應(yīng)，生成鉬藍與鎢藍，通過紫外分光光度計測定，從而計算出蛋白酶的活力[13]。

分別取不同質(zhì)量濃度的酪氨酸標準溶液(0，10，20，30，40，50 mg/L)各1 mL，加入濃度為0.4 mol/L的碳酸鈉溶液5 mL，福林試劑溶液1 mL，顯色反應(yīng)在(40±0.2)℃中持續(xù)20 min。將反應(yīng)液取出后，在680 nm下測定其吸光度。根據(jù)酪氨酸不同濃度對應(yīng)的吸光度值繪制標準曲線。

取1 mL待測牛奶樣品，加入10 g/L的酪素溶液1 mL，在(40±0.2) ℃下反應(yīng)10 min，取出靜置后過濾。再取濾液1 mL，與5 mL的碳酸鈉溶液、1 mL的福林試劑混合后，在(40±0.2) ℃下顯色20 min，于680 nm下測定其吸光度?？瞻捉M測定方法相同，只是在加入酪素之前先加入三氯乙酸使蛋白酶失活。牛奶中蛋白酶活力為

X=AK×4/10，

式中：X為牛奶樣品的蛋白酶活力(u/mL)；A為牛奶樣品的吸光度；K為吸光常數(shù)(即根據(jù)回歸方程計算出當吸光度為1時的酪氨酸的量)；4為反應(yīng)試劑的總體積；10為反應(yīng)時間。

1.3.2 鄰苯二甲醛衍生比色法測定牛奶中蛋白酶活力

參考Church[14]和張艷[10]的方法略作修改。此方法的原理是鄰苯二甲醛衍生試劑在堿性介質(zhì)中與游離氨基酸反應(yīng)生成異吲哚衍生物，在340 nm下有特征吸收，通過測定吸光度計算出牛奶中游離氨基氮的濃度，以此反映出蛋白酶的活力。

將40 mg的鄰苯二甲醛溶于1 mL甲醇中，分別加入25 mL濃度為100 mmol/L的四硼酸鈉、2.5 mL10%的SDS、100 L的 -巰基乙醇，加水定容至50 mL，即為鄰苯二甲醛衍生試劑(OPA)。

分別取不同濃度的苯丙氨酸標準溶液(0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4 mmol/L) 各150 μL， 加入3 mL的OPA試劑，室溫下反應(yīng)2 min，340 nm下測定其吸光度值。根據(jù)苯丙氨酸不同濃度對應(yīng)的吸光度繪制標準曲線。

取10 mL待測的牛奶樣品在4 000 r/min下離心分離20 min，以脫去脂肪。取脫脂后的牛奶樣品2.5 mL，分別加入5 mL質(zhì)量分數(shù)為12%的三氯乙酸、0.5 mL蒸餾水，在2 000 r/min下離心15 min。取清液150 μL，加入3 mL的OPA試劑，室溫下反應(yīng)2 min，340 nm下測定其吸光度值。根據(jù)苯丙氨酸標準曲線計算出牛奶中游離氨態(tài)氮的濃度。

1.3.3 甲醛法測定牛奶中蛋白酶活力

采用康小紅[9]的方法并進行修改。此方法是通過測定牛奶中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度來反映蛋白酶的活力。其原理是利用了氨基酸的兩性作用，甲醛能夠固定氨基的堿性，使氨基酸的羧基顯示出酸性，通過氫氧化鈉標準溶液滴定來定量，以酸度計測定滴定終點。

具體方法：取60 mL待測的牛奶樣品于200 mL錐形瓶中，開動磁力攪拌器，用濃度為0.05 mol/L的氫氧化鈉標準溶液進行滴定，至pH值為8.2時記下消耗的氫氧化鈉標準溶液的毫升數(shù)，此數(shù)據(jù)可反映出牛奶中的總酸質(zhì)量濃度。加入10 mL甲醛溶液后，再用濃度為0.05 mol/L的氫氧化鈉標準溶液繼續(xù)滴定至pH值為9.2，記下此時消耗的氫氧化鈉標準溶液的毫升數(shù)，以此計算出牛奶樣品中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度。以水為空白對照。牛奶樣品中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度按以下公式計算：

式中：X為牛奶樣品中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度；V1為牛奶中加入甲醛后消耗的氫氧化鈉標準溶液的體積；V2為空白組加入甲醛后消耗的氫氧化鈉標準溶液的體積；V3為牛奶樣品的取用量；c為氫氧化鈉標準溶液的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 福林法測定牛奶中蛋白酶活力的結(jié)果

以酪氨酸為標準品，根據(jù)酪氨酸不同濃度所對應(yīng)的吸光度值繪制標準曲線，如圖1所示。所得標準曲線的回歸方程為y=0.01043x-0.00714，R2=0.9975，式中y為吸光度，x為酪氨酸濃度。

在680 nm下測定牛奶空白對照組和試驗組的吸光度值，根據(jù)回歸方程計算牛奶中蛋白酶活力，結(jié)果見表1。為了驗證方法的重現(xiàn)性，進行四次重現(xiàn)性試驗，測定的牛奶中蛋白酶活力分別為1.4291，1.3905，1.4291，1.4291 u/mL，運用統(tǒng)計學(xué)相關(guān)知識對數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果如表2所示。此方法的平均相對誤差為0.0102，相對標準偏差為0.0136，說明福林法的精確度高，數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性好。而且每次測定時同一牛奶樣品的平行值重復(fù)性好。從測定結(jié)果可以看出，反應(yīng)后牛奶吸光度的微小變化也會引起測定結(jié)果的改變，說明此方法的靈敏性很高。向牛奶樣品中分別加入不同量的酪氨酸標準溶液，測定回收率以確定福林法的準確度，結(jié)果如表3所示。福林法的回收率在96.19%～99.05%之間，平均回收率為97.54%，相對標準偏差為0.0120，表明福林法的準確度高，符合分析標準。

表1 福林法對牛奶中蛋白酶活力的測定結(jié)果

表2 福林法測定結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析

表3 福林法回收率實驗結(jié)果

2.2 鄰苯二甲醛衍生比色法測定牛奶中蛋白酶活力的結(jié)果

以苯丙氨酸為標準品，根據(jù)苯丙氨酸不同濃度所對應(yīng)的吸光度值繪制標準曲線，如圖2所示。所得標準曲線的回歸方程為y=0.22387x-0.02451，R2=0.9973，式中y為吸光度，x為苯丙氨酸濃度。

在340 nm下測定經(jīng)過反應(yīng)后的牛奶的吸光度值，根據(jù)回歸方程計算牛奶中游離氨基氮的濃度，結(jié)果如表4所示。進行了4次重現(xiàn)性驗證，測得牛奶中蛋白酶活力分別為0.5 472，0.5 383，0.5 294，0.5 338 mmol/L。由于SDS溶解性受溫度的影響較大，不同環(huán)境溫度引起SDS溶解性變化可能是造成吸光度差異的主要原因，進而對牛奶中蛋白酶活力的測定結(jié)果產(chǎn)生影響。通過統(tǒng)計學(xué)分析(表5)得出此方法的平均相對誤差為0.0104，相對標準偏差為0.0142，說明鄰苯二甲醛衍生比色法也具有較高的精確度，結(jié)果重現(xiàn)性較好。每次測定時同一牛奶樣品的平行值重復(fù)性好。從試驗結(jié)果分析，吸光度的微小變化同樣會引起所測蛋白酶活力的變化，說明此方法的靈敏度也很高。向牛奶樣品中分別加入不同量的苯丙氨酸標準溶液，測定回收率以確定鄰苯二甲醛衍生比色法的準確度，結(jié)果見表6。鄰苯二甲醛衍生比色法的回收率在94.88%～98.70%之間，平均回收率為96.33%，相對標準偏差為0.0173，表明此方法的準確度高，同樣符合分析標準。

2.3 甲醛法測定牛奶中蛋白酶活力的結(jié)果

用濃度為0.005 mol/L的氫氧化鈉標準溶液進行滴定，分別測定原樣品和加入甲醛后的樣品消耗氫氧化鈉的量，以此計算出牛奶中蛋白酶的活力，測定結(jié)果如表7所示。從重現(xiàn)性驗證試驗的結(jié)果來看，甲醛法結(jié)果重現(xiàn)性較差，4次測定的氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度分別為0.0 308，0.0 325，0.0 333，0.0 306 g/100 mL，且每次滴定時同一牛奶樣品消耗氫氧化鈉的平行值差異較大。表8為四次重現(xiàn)性試驗結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)，此方法的平均相對誤差和相對標準偏差分別為0.1 407和0.040 9，表明相較于福林法和鄰苯二甲醛衍生比色法，甲醛法的精確度明顯較低。向牛奶樣品中分別加入不同量的苯丙氨酸標準溶液，測定回收率以確定甲醛法的準確度，結(jié)果見表9。甲醛法的回收率在88.84%～100.25%之間，平均回收率為95.23%，相對標準偏差為0.0497，說明此方法較前兩種方法的準確度低。

表4 鄰苯二甲醛衍生比色法對牛奶中蛋白酶活力的測定結(jié)果

表5 鄰苯二甲醛衍生比色法測定結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析

表6 鄰苯二甲醛衍生比色法回收率實驗結(jié)果

表7 甲醛法對牛奶中蛋白酶活力的測定結(jié)果

表8 甲醛法測定結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析

表9 甲醛法回收率實驗結(jié)果

2.4 3種測定方法的比較

從測定原理來看，福林法、鄰苯二甲醛衍生比色法和甲醛法這3種測定蛋白酶活力的方法都是以測定產(chǎn)物氨基酸的量來表示蛋白酶活力。但是，福林法是對蛋白酶分解酪素產(chǎn)生的含有酚基的氨基酸進行測定，以酪氨酸的量來表示牛奶中氨基酸的量，鄰苯二甲醛比色法是通過對與鄰苯二甲醛衍生試劑反應(yīng)的游離氨基酸進行測定，以苯丙氨酸的量來表示牛奶中氨基酸的量，甲醛法則是通過消耗堿液的量來測定氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度，以氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度來表示牛奶中氨基酸的量。3種測定方法和表達方式有所不同，但福林法從原理上能夠更為實際地反映出牛奶中蛋白酶的活力。

從檢測過程來看，福林法反應(yīng)條件苛刻，試劑大多需要現(xiàn)配現(xiàn)用，操作復(fù)雜；鄰苯二甲醛衍生比色法反應(yīng)時間最短，操作較甲醛法稍顯復(fù)雜，測定過程中溫度對SDS溶解性影響較大，SDS的溶解性對吸光度又有直接影響，因而在測定中對溫度的控制增加了操作的復(fù)雜性；甲醛法是3種方法中操作最為簡便的，反應(yīng)時間適中。

從測定結(jié)果來看，福林法精確度和準確度高，3次重復(fù)實驗中結(jié)果重現(xiàn)性好；鄰苯二甲醛衍生比色法精確度和準確度也高，3次重復(fù)試驗中結(jié)果重現(xiàn)性較福林法較差，這可能是由于測定中環(huán)境的溫度變化引起吸光度的差異；甲醛法精確度和準確度均較低，3次重復(fù)試驗中結(jié)果重現(xiàn)性較差。將3種方法測定的結(jié)果進行比較分析，其所測得牛奶中蛋白酶活力的表達方式不同，福林法得到的酶活力單位為u/mL，鄰苯二甲醛法得到的酶活力是以每升牛奶中游離氨基氮的毫摩數(shù)來表示，而甲醛法測得的酶活力是以100 mL牛奶中氨基酸態(tài)氮的克數(shù)來表示，很難直接進行數(shù)值比較。因此，對牛奶樣品進行稀釋，分別用3種方法測定稀釋后牛奶的蛋白酶活力，結(jié)果如表10所示。運用統(tǒng)計學(xué)的相關(guān)分析(t檢驗：成對雙樣品均值分析)對三組數(shù)據(jù)進行處理，福林法和鄰苯二甲醛衍生比色法測定結(jié)果的相關(guān)系數(shù)為0.986，福林法和甲醛法測定結(jié)果的相關(guān)系數(shù)為0.956，鄰苯二甲醛衍生比色法和甲醛法測定結(jié)果的相關(guān)系數(shù)為0.983，表明3種方法的變化趨勢是一樣的，都可以從不同角度反映出牛奶中蛋白酶的活力，結(jié)果之間可以進行比較客觀的比較。

表10 3種方法對不同濃度的牛奶中蛋白酶活力的測定結(jié)果

3 結(jié) 論

試驗對福林法、鄰苯二甲醛衍生比色法和甲醛法這3種測定牛奶中蛋白酶活力的方法進行比較，從相關(guān)性結(jié)果來看，3種方法均能從不同角度反映出牛奶中蛋白酶活力。福林法雖然操作復(fù)雜，但其測定結(jié)果能夠直接客觀的反應(yīng)出牛奶中蛋白酶活力，精確度、準確度和靈敏度高，重復(fù)實驗結(jié)果的重現(xiàn)性好，適合于牛奶中蛋白酶活力的精密測定；鄰苯二甲醛衍生比色法測定的蛋白酶活力是以1 L牛奶中游離氨態(tài)氮的毫摩數(shù)來表示，精確度和準確度好，靈敏度高，反應(yīng)時間短，但測定過程中由溫度引起的SDS溶解性問題對測定結(jié)果影響較大，適合于不同樣品間蛋白酶活力的精確比較；甲醛法是以100 mL牛奶中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量來表征蛋白酶活力的，操作簡單，但是準確性和精確度都較低，重復(fù)實驗時結(jié)果的重現(xiàn)性不好，適合于粗略性和比較性測定。

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