韓鐫竹，蘇崴藝，李欣南

(遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，沈陽(yáng)110016)

0 引 言

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展人民生活水平日益提高，牛奶已經(jīng)成為人們餐桌上必不可少的食物之一，隨之產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)效益也越來(lái)越高。一些不法商販為謀取暴利，在牛奶中違法添加有毒有害物質(zhì)，摻假造假現(xiàn)象嚴(yán)重，牛奶的質(zhì)量安全問(wèn)題已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)與重點(diǎn)[1-4]。由于大豆價(jià)格低廉，蛋白含量高，通用蛋白測(cè)定方法難以從牛奶中區(qū)分開(kāi)[5]，在牛奶中摻入大豆已成為摻假的主要手段之一。目前牛奶中摻雜植物蛋白的研究很少，有研究羊奶中摻雜的牛奶[6]；熒光PCR方法實(shí)時(shí)檢測(cè)牛奶中摻雜大豆成分[7]的實(shí)驗(yàn)等，但是復(fù)式PCR還是一個(gè)比較嶄新的領(lǐng)域。復(fù)式PCR具有敏感、特異、快速等特點(diǎn)，檢測(cè)大批樣本效率較傳統(tǒng)方法高數(shù)倍，成本低，可以更加準(zhǔn)確的檢測(cè)出牛奶中摻雜的大豆源性物質(zhì)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CF16RX高速低溫冷凍離心機(jī)，TC-512PCR儀，DYY-6C型電泳儀，170-8170型紫外凝膠成像系統(tǒng)，AL 104-IC電子天平。

1.2 試劑與材料

基因組DNA提取試劑盒，TritonX-100、異硫氰酸胍(分析純)，牛奶、豆?jié){粉(市售)；試驗(yàn)所用引物均為南京金斯瑞生物科技有限公司合成，序列如表1所示。

表1 引物序列

2 方 法

2.1 不同體積分?jǐn)?shù)豆?jié){的牛奶的配制(是按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)配置的豆?jié){牛奶)

準(zhǔn)確稱取3.0 g豆?jié){粉溶于30 mL溫開(kāi)水中，制成豆?jié){溶液，分別配制體積分?jǐn)?shù)為3%，4%，5%，10%豆?jié){的牛奶。

2.2 牛奶和大豆的基因組DNA提取方法

2.2.1 熱解法提取基因組DNA

分別取2.1制備樣品10 mL于50 mL離心管中，4℃，4 000 r/mim離心10 mim，用棉簽擦去管壁上的乳蛋白和乳脂，重復(fù)離心擦拭步驟3次。加入10 mL的PBS(8.0g NaCl+0.2g KCl+1.44g Na2HPO4+0.24 g KH2PO4定容至1 000 mL)重新懸浮，輕輕震蕩，重復(fù)離心擦拭步驟一次。

分別取200 μL上述樣品于1.5 mL的Eppendorf管中，加入440 μL TEN(1mL濃度1 mol/L的Tris+0.2 mL濃度0.5 mol/L的EDTA+0.5844 g的NaCl定容至100 mL)和60 μL 0.2 mol/L NaOH,劇烈振蕩，直到沉淀完全懸浮，取600 μL上述裂解液置于1.5 mL Eppend orf管中，95℃水浴8 min，冷卻后離心取上清液。加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，混勻，4 ℃，12 000 r/min，離心10 min，取上清液。加入3 μL RNaseA，37℃水浴30 min。加入0.8倍體積異丙醇，-20℃沉淀30 min,70%乙醇洗滌沉淀，室溫干燥10 min，加入30 μL TE(121.14 mg+37.224 mg EDTA,加HCl調(diào)pH至8.0，定容至100 mL)溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 異硫氰酸胍法提取基因組DNA

從離心管中分別取200 μL 2.1制備樣品于1.5 mL Eppendorf管中，加入400 μL異硫氰酸胍裂解液，混勻，室溫放置10 min，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，充分混勻，12 000 r/min離心10 min。 取上清，加入0.8倍體積異丙醇，-20℃沉淀30 min，12 000 r/min離心10 min，棄上清，用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇洗滌沉淀，室溫干燥20 min，加入30 μL TE溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 基因組DNA提取試劑盒法

用棉簽沾取樣品于2 mL離心管中，加入400 μL的Buffer GR。 加入20 μL Proteinase K和400 μL Buffer GL，立即渦旋震蕩15 s，充分混勻，56℃水浴10 min，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。

將上步所得溶液和沉淀分兩次加入到已裝入收集管的吸附柱中，一次最多不超過(guò)700 μL。8 000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。向吸附柱中加入500 μL Buffer GW1,8 000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。向吸附柱中加入500 μL Buffer GW2,14 000 r/min離心3 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

14 000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，干燥處理。將吸附柱置于一個(gè)1.5 mL的新離心管中，向吸附柱的中間部位懸空加入50 μL Buffer GE， 室溫放置2～5 min，8 000 r/min離心1 min,收集DNA溶液，-20℃保存。

2.2.4 熱解-異硫氰酸胍聯(lián)用法提取基因組DNA

取10 mL 2.1制備樣品于離心管中，4℃，4 000 r/mim離心10 min，用棉簽擦去管壁上的乳蛋白和乳脂，重復(fù)離心擦拭步驟三次。加入10 mLPBS重新懸浮，輕輕震蕩，重復(fù)離心擦拭步驟一次。

分別取200 μL樣品于1.5 mL Eppendorf管中，加入400 μL異硫氰酸胍裂解液，混勻，室溫放置10 min，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，充分混勻，12 000 r/min離心10 min。取上清，加入0.8倍體積異丙醇，-20 ℃沉淀30 min，12 000 r/min離心10 min，棄上清，70%乙醇洗滌沉淀，室溫干燥20 min，加入30 μL TE溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 復(fù)式PCR反應(yīng)及檢測(cè)

20 μL反應(yīng)體系中含10 μL 2×Taq PCR Master Mix，引物( 濃度為20 μmol/L)0.5 μL, 模板2 μL, 雙蒸水至20 μL。 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；25個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。 取10 μL PCR 產(chǎn)物，2.0%瓊脂糖凝膠110 V電泳40 min,凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 熱解法提取結(jié)果

采用熱解法提取樣品中基因組DNA，結(jié)果經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳，如圖1中所示。由圖1可以看出，泳道1在300 bp左右出現(xiàn)一條目的條帶，由此可以證明已提取牛奶基因組；而泳道2、3、4號(hào)上均沒(méi)有出現(xiàn)300 bp和433 bp目的條帶，說(shuō)明沒(méi)有提取出相應(yīng)的基因組，推測(cè)是大豆的存在干擾了牛奶基因組的檢測(cè)。由此可見(jiàn)，該方法不適于對(duì)牛奶和大豆基因組DNA的提取。

圖1 熱解法凝膠電泳結(jié)果

3.2 異硫氰酸胍法提取結(jié)果

圖2為異硫氰酸胍法擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果。由圖2中可以看出，大豆基因組提取效果良好，但牛奶基因組提取量不足，甚至無(wú)法檢出。

3.3 試劑盒法提取結(jié)果

圖3為試劑盒法擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果。由圖3可以看出，牛奶和大豆基因組均未提出，說(shuō)明該方法不適用于提取牛奶和大豆基因組提取。

3.4 熱解-異硫氰酸胍聯(lián)用法提取結(jié)果

圖4為熱解-異硫氰酸胍聯(lián)用法擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果。由圖4可以看出，該方法對(duì)牛奶和大豆的基因組提取效果都非常好，隨著大豆?jié)舛鹊倪f增各擴(kuò)增帶逐漸增強(qiáng),檢出限為3%豆?jié){摻入量，針對(duì)豆?jié){摻入量大于5%以上才能達(dá)到盈利的目的[8]，本方法可完全達(dá)到檢測(cè)要求。

圖2 異硫氰酸胍法電泳結(jié)果

圖3 試劑盒法凝膠電泳結(jié)果

圖4 熱解-異硫氰酸胍聯(lián)用法凝膠電泳結(jié)果

3.5 實(shí)際樣品測(cè)定

用本方法對(duì)20份牛奶進(jìn)行了檢測(cè)，按2.2.4中方法操作，制備樣品，在2.3條件下進(jìn)樣PCR，電泳。各樣品中均未檢出大豆源性物質(zhì)，說(shuō)明測(cè)定的20份牛奶品質(zhì)較好。

4 討 論

4.1 復(fù)式PCR方法的確定

復(fù)式PCR是在傳統(tǒng)PCR基礎(chǔ)上同時(shí)擴(kuò)增兩種DNA片段，能同時(shí)檢測(cè)出兩種物質(zhì)的存在。復(fù)式PCR是對(duì)傳統(tǒng)的PCR技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，建立并完善PCR步驟，通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)退火溫度、瓊脂糖凝膠濃度和電泳電壓3個(gè)因素進(jìn)行3水平的優(yōu)化，最終確定最佳的條件，進(jìn)一步確定檢測(cè)的可能性。因此，本實(shí)驗(yàn)建立的復(fù)式PCR檢測(cè)系統(tǒng)，易于操作、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確性高、適于推廣，可用于牛奶中摻雜大豆源性成分的檢測(cè)。

4.2 牛奶與豆?jié){基因組提取效果

如圖4中泳道3，4，5，6所示：433 bp處目的條帶明顯比300 bp產(chǎn)物含量高，表明該法提取大豆的基因組含量比牛奶高。分析這一現(xiàn)象的原因，主要是異硫氰酸胍的作用，相關(guān)文獻(xiàn)表明異硫氰酸胍法主要是針對(duì)大豆基因組DNA提取的。因此，當(dāng)使用該法同時(shí)提取牛奶和大豆基因組時(shí)，牛奶的基因組提取量要少于大豆的基因組提取量。

4.3 基因組提取方法的選擇

本研究主要研究采用熱解法、異硫氰酸胍法、基因組DNA提取試劑盒法及熱解法-異硫氰酸胍聯(lián)合法四種方法提取牛奶和大豆中基因組DNA，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)復(fù)試PCR方法獲取目的基因片段，比較四種方法對(duì)于牛奶中摻有大豆源提取基因組DNA的靈敏度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熱解法僅可提取少許牛奶基因組，異硫氰酸胍法則只能提取大豆基因組，而基因組DNA提取試劑盒法則沒(méi)有提取出牛奶和大豆基因組。分析原因可能是牛奶和大豆是兩種不同來(lái)源的蛋白質(zhì)，大豆是屬于植物源性蛋白；牛奶是屬于動(dòng)物源性蛋白，并且脂肪含量極高。熱解法是針對(duì)動(dòng)物源性蛋白提取的方法，異硫氰酸胍法無(wú)法去除乳蛋白和乳脂，針對(duì)這種情況，本研究采用熱解法-異硫氰酸胍聯(lián)合法，與其他三種方法比較，該法能夠有效的提取牛奶及其摻雜的大豆源成分的基因組DNA，結(jié)果準(zhǔn)確，方便操作。

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