南果梨葉片離體培養(yǎng)的高效再生體系

孫俊

摘要：為探索一種南果梨葉片離體培養(yǎng)高效再生的方法，以南國梨離體培養(yǎng)試管苗葉片為材料，在MS基本培養(yǎng)基中添加6-BA、NAA、IAA進行離體培養(yǎng)，系統(tǒng)地研究植物生長調節(jié)物質濃度、苗齡、不同部位葉片、接種方向、溫度、pH值及光照強度對南國梨葉片離體培養(yǎng)再生的影響。結果表明，MS+5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+ 7 g/L 瓊脂+30 g/L 蔗糖為南國梨葉片再生芽誘導的適宜培養(yǎng)基，誘導率最高，為46.1%；選擇25～35 d苗齡葉片、近葉柄處遠軸面向上葉片可獲得高再生頻率；南果梨葉片離體再生的適宜條件為：溫度（25±2） ℃，pH值為5.8～64，高光照強度。

關鍵詞：南果梨；葉片再生；離體培養(yǎng)；影響因素

中圖分類號： S661.204+.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0044-03

南果梨（Pyrus ussuriensis Maxim.）屬于薔薇科（Rosaceae）梨亞科（Pomaceae）梨屬（Pyrus L.）植物[1]，是秋子梨（Pyrus ussuriensis Maxim.）中優(yōu)良的地方品種之一[2-3]。該品種果實色澤鮮艷、果肉細膩、爽口多汁，風味香濃，深受人們歡迎，市場發(fā)展前景十分廣闊[4]。但南國梨果實成熟集中，不耐儲運，柜臺壽命短，限制了南國梨的發(fā)展。常規(guī)育種過程相對較慢，難以解決此問題。隨著農業(yè)生物技術的發(fā)展，通過基因工程技術加快南國梨耐儲品種的培育將成為解決南國梨保鮮的一條新捷徑。而在轉基因研究中，成功的基因轉化首先依賴于高效穩(wěn)定的再生系統(tǒng)。原生質體培養(yǎng)與葉片培養(yǎng)是目前運用最廣泛的轉基因植株再生系統(tǒng)[5]。葉圓盤法因能避免對原生質體的繁瑣操作而成為基因轉移中最常用的方法[6]。梨屬植物葉片的再生已有報道[7-12]， 但未有南果梨葉片離體培養(yǎng)再生體系建立及其影響因素研究的報道。本研究以南果梨試管苗葉片為試材，建立高頻穩(wěn)定的葉片離體再生體系為目的，以MS基本培養(yǎng)基添加6-BA、NAA、IAA進行離體培養(yǎng)，系統(tǒng)地進行植物生長調節(jié)物質濃度、苗齡、不同部位葉片、接種方向、溫度、pH值及光照強度對南國梨葉片離體培養(yǎng)再生影響的研究。本試驗旨在研究葉片離體再生不定芽的影響因素，建立簡單、快速、高效的葉片離體再生體系，從而為進一步利用基因工程技術對南國梨進行遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為采自遼寧省鞍山市的大紅南果的一年生枝條，在無菌條件下培育出的試管苗。

1.2 方法

1.2.1 不同激素組合對葉片再生不定芽誘導的影響 取繼代培養(yǎng)25～35 d的試管苗頂部生長健壯、完全展開的幼葉，將其放在無菌濾紙上，然后用解剖刀在葉片背面（遠軸面）垂直中脈橫劃3刀，但不要完全切斷葉片的上表皮。葉片再生芽誘導的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，不同激素組合見表1，附加蔗糖30 g/L，pH值5.8。培養(yǎng)溫度為（25±2） ℃，每天光照 8～10 h，光照強度2 500～3 000 lx。葉片接種后50 d，調查葉片再生效率和再生芽數(shù)。

1.2.2 試驗葉片的苗齡對不定芽誘導的影響 采用離體培養(yǎng)25、35、60、90、120 d組培苗葉片進行葉片苗齡對再生頻率的影響研究。選取上部1～3葉位幼嫩葉片，垂直主脈橫切2刀，將葉塊近軸面向下接種于分化培養(yǎng)基上。

1.2.3 葉片種方方向對葉片再生不定芽的影響 設葉片遠軸面和近軸面接觸培養(yǎng)基2種接種方法處理，接種于MS+ 5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖培養(yǎng)基上，對比觀察不定芽的誘導情況。培養(yǎng)及調查方法同“1.2.1”部分。

1.2.4 葉片不同部位對葉片再生不定芽的影響 取繼代培養(yǎng)35 d的無菌苗葉片。在葉片的基部、中部和尖部垂直于中脈各切1刀，接種在篩選出的含適宜激素的不定芽誘導培養(yǎng)基（MS+5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖）上，每瓶放3張葉片，重復8次。培養(yǎng)及調查方法同“1.2.1”部分。

上述試驗均為每瓶接種9個葉塊（3張葉），隨機區(qū)組試驗設計，每處理10瓶，重復3次。試驗再生培養(yǎng)基為MS+5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖。

1.3 結果調查與統(tǒng)計分析

在葉片接種30 d后對不定芽的再生率和平均每個葉塊的分化不定芽數(shù)進行調查。結果用DPS統(tǒng)計軟件進行方差分析，百分率經(jīng)反正弦轉換。再生頻率=再生不定芽的葉塊數(shù)/接種葉塊數(shù)×100%；葉塊平均再生芽數(shù)（個/葉塊）=葉塊再生不定芽總數(shù)/出芽葉塊數(shù)。

2 結果與分析

2.1 不同激素組合對葉片再生的影響

接種后2周，葉片開始膨脹，邊緣逐漸向中央無規(guī)則卷起，葉片傷口處長出少量的白色愈傷組織，質地松散。3周左右，傷口處形成致密的愈傷組織，顏色由暗黃至深褐，體積迅速增大。5周時，傷口末端的愈傷組織處開始分化出綠色芽點（圖1-A）。7周后，不定芽分化率迅速上升，此后不定芽不斷伸長（圖1-B）。隨著培養(yǎng)時間的延長，葉片再生頻率和再生不定芽數(shù)量開始增加。

表1表明，附加適宜的生長素可提高芽的再生頻率，但不同種類生長素誘導芽的效果不同，IAA效果不如NAA；IAA或NAA濃度一定下，6-BA濃度越大，葉片再生頻率越高，但相同6-BA濃度下，同濃度NAA比IAA效果好。以MS為基本培養(yǎng)基誘導南國梨葉片不定芽再生的最適6-BA濃度為 5 mg/L。在6-BA濃度為5.0 mg/L的條件下，0.2 mg/L NAA的誘導率最高，為46.1%。因此，MS+5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖為南國梨葉片再生芽誘導的適宜培養(yǎng)基。

2.2 苗齡對不定芽誘導的影響

培養(yǎng)中的外植體細胞團由于不斷繼代，其形態(tài)發(fā)生能力可能保持，也可能喪失，產生不正常植株的頻率也會增加。因此，筆者對不同苗齡南果梨葉片離體再生情況進行了研究。結果（表2）表明，25、35 d苗齡的離體再生頻率顯著大于 60 d 苗齡，極顯著大于90、120 d，而25、35 d苗齡間差異不顯著。因此，選擇25～35 d苗齡葉片作為獲得高再生頻率的試材。

3 結論與討論

3.1 外源激素的影響

在不同生長素和細胞分裂素的配合使用中，兩者的比例十分重要。有研究證明，細胞分裂素類似物質腺嘌呤與生長素IAA之間的濃度配比可有效地控制植物組織培養(yǎng)中芽和根器官的發(fā)生。本試驗支持此觀點。本研究以在MS基本培養(yǎng)基上添加 6-BA 與NAA組合較6-BA與IAA組合更有利于不定芽的再生。這與孫清榮等研究結果[8]一致，與劉洪章等的研究結果[13]正好相反。培養(yǎng)基中激素的種類、濃度、配比不同造成生長和分化能力不同，可能是因為它們刺激了不同基因控制的酶類，從而影響內源激素的分布水平，進而在生長和分化上形成差異[14]。

3.2 苗齡的影響

隨著繼代次數(shù)增多，培養(yǎng)中的外植體器官形成的能力會發(fā)生改變。對不同苗齡葉片的再生能力進行比較試驗發(fā)現(xiàn)，苗齡越大，再生頻率越低，苗齡25～35 d的葉片再生能力最強。這可能與葉片的生理狀態(tài)有關，不同苗齡的葉片基因組中代謝基因及其活性不同，導致酶的活性及內源激素水平的差異，在外源激素及其他環(huán)境因素的作用下，表現(xiàn)出不同的再生能力[15]。

3.3 外植體放置方向的影響

以南果梨葉片遠軸面接觸培養(yǎng)基，其再生頻率高于近軸面接觸培養(yǎng)基的處理，這與劉洪章等的研究結果[13，16-17]一致，所以接種時以遠軸面向下為宜。

3.4 培養(yǎng)溫度的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，溫度對南果梨葉片再生芽有明顯影響，27 ℃以上明顯不利于葉片生長，與吳祿平等在蘋果品種試管苗葉片再生不定芽的研究結果[18]一致，造成這種現(xiàn)象的原因可能是溫度過高，使參與新陳代謝酶的活性受到抑制，從而使代謝過程和生長速率受到抑制，進而影響葉片再生。

參考文獻：

[1]曲澤洲，孫云蔚. 果樹種類論[M]. 北京：農業(yè)出版社，1990：50-51.

[2]蒲富慎，黃禮森，孫秉鈞，等. 梨品種[M]. 北京：農業(yè)出版社，1989：83.

[3]農業(yè)部農業(yè)技術推廣總站，張 力，于潤卿. 梨優(yōu)良品種及其豐產優(yōu)質栽培技術[M]. 北京：中國林業(yè)出版社，1993：62-66.

[4]王曉利，任寶君. 以開發(fā)南果梨為突破口大力推進農業(yè)產業(yè)結構調整[J]. 河北農業(yè)科技，2008（7）：55.

[5]王關林，方宏筠. 植物基因工程[M]. 北京：科學出版社，2009.

[6]孫愛君，章 鎮(zhèn)，張新生，等. 蘋果遺傳轉化的研究進展[J]. 遺傳，2001，23（6）：583-587.

[7]曹 霞，柴明良. 砂梨葉片再生不定梢的研究[J]. 果樹學報，2005，22（5）：557-560.

[8]孫清榮，劉慶忠，趙瑞華. 西洋梨葉片直接再生體細胞胚[J]. 園藝學報，2003，30（1）：85-86.

[9]徐凌飛，馬鋒旺，王喆之，等. 八月紅梨葉片不定芽誘導研究[J]. 西北農林科技大學學報：自然科學版，2002，30（4）：73-75.

[10]劉翠瓊. 梨的離體培養(yǎng)與葉片不定梢誘導研究[D]. 雅安：四川農業(yè)大學，2003：32-40.

[11]李海云，王中偉，邢少辰，等. 早梨18號葉片不定芽誘導及植株再生的研究[J]. 北方園藝，2008（9）：151-153.

[12]韓繼成，馮志紅，陳霜瑩. 梨離體葉片誘導不定芽的研究[J]. 河北果樹，1998（2）：12.

[13]劉洪章，譚雪輝，鄭 濤. 山梨葉片再生體系的研究[J]. 吉林農業(yè)大學學報，2008，30（4）：472-476.

[14]黃學林，李筱菊. 高等植物組織培養(yǎng)離體培養(yǎng)的形態(tài)建成及調控[M]. 北京：科學出版社，1995：78-80.

[15]布賴恩特J A. 植物基因表達的分子基礎[M]. 朱至清，譯. 北京：科學出版社，1986：274.

[16]韓清芳，徐凌飛，馬鋒旺，等. 梨葉柄再生不定芽的研究[J]. 西北植物學報，2002，22（6）：1485-1488.

[17]孫清榮，石蔭坪，孫洪雁.梨成熟胚子葉不定梢誘導[J]. 河北農業(yè)大學學報，1999，22（2）：50-52.

[18]吳祿平，張志宏，林麗華，等. 蘋果品種試管苗葉片再生不定芽[J]. 沈陽農業(yè)大學學報，1995，26（2）：131-135.

2.2 苗齡對不定芽誘導的影響

培養(yǎng)中的外植體細胞團由于不斷繼代，其形態(tài)發(fā)生能力可能保持，也可能喪失，產生不正常植株的頻率也會增加。因此，筆者對不同苗齡南果梨葉片離體再生情況進行了研究。結果（表2）表明，25、35 d苗齡的離體再生頻率顯著大于 60 d 苗齡，極顯著大于90、120 d，而25、35 d苗齡間差異不顯著。因此，選擇25～35 d苗齡葉片作為獲得高再生頻率的試材。

3 結論與討論

3.1 外源激素的影響

在不同生長素和細胞分裂素的配合使用中，兩者的比例十分重要。有研究證明，細胞分裂素類似物質腺嘌呤與生長素IAA之間的濃度配比可有效地控制植物組織培養(yǎng)中芽和根器官的發(fā)生。本試驗支持此觀點。本研究以在MS基本培養(yǎng)基上添加 6-BA 與NAA組合較6-BA與IAA組合更有利于不定芽的再生。這與孫清榮等研究結果[8]一致，與劉洪章等的研究結果[13]正好相反。培養(yǎng)基中激素的種類、濃度、配比不同造成生長和分化能力不同，可能是因為它們刺激了不同基因控制的酶類，從而影響內源激素的分布水平，進而在生長和分化上形成差異[14]。

3.2 苗齡的影響

隨著繼代次數(shù)增多，培養(yǎng)中的外植體器官形成的能力會發(fā)生改變。對不同苗齡葉片的再生能力進行比較試驗發(fā)現(xiàn)，苗齡越大，再生頻率越低，苗齡25～35 d的葉片再生能力最強。這可能與葉片的生理狀態(tài)有關，不同苗齡的葉片基因組中代謝基因及其活性不同，導致酶的活性及內源激素水平的差異，在外源激素及其他環(huán)境因素的作用下，表現(xiàn)出不同的再生能力[15]。

3.3 外植體放置方向的影響

以南果梨葉片遠軸面接觸培養(yǎng)基，其再生頻率高于近軸面接觸培養(yǎng)基的處理，這與劉洪章等的研究結果[13，16-17]一致，所以接種時以遠軸面向下為宜。

3.4 培養(yǎng)溫度的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，溫度對南果梨葉片再生芽有明顯影響，27 ℃以上明顯不利于葉片生長，與吳祿平等在蘋果品種試管苗葉片再生不定芽的研究結果[18]一致，造成這種現(xiàn)象的原因可能是溫度過高，使參與新陳代謝酶的活性受到抑制，從而使代謝過程和生長速率受到抑制，進而影響葉片再生。

參考文獻：

[1]曲澤洲，孫云蔚. 果樹種類論[M]. 北京：農業(yè)出版社，1990：50-51.

[2]蒲富慎，黃禮森，孫秉鈞，等. 梨品種[M]. 北京：農業(yè)出版社，1989：83.

[3]農業(yè)部農業(yè)技術推廣總站，張 力，于潤卿. 梨優(yōu)良品種及其豐產優(yōu)質栽培技術[M]. 北京：中國林業(yè)出版社，1993：62-66.

[4]王曉利，任寶君. 以開發(fā)南果梨為突破口大力推進農業(yè)產業(yè)結構調整[J]. 河北農業(yè)科技，2008（7）：55.

[5]王關林，方宏筠. 植物基因工程[M]. 北京：科學出版社，2009.

[6]孫愛君，章 鎮(zhèn)，張新生，等. 蘋果遺傳轉化的研究進展[J]. 遺傳，2001，23（6）：583-587.

[7]曹 霞，柴明良. 砂梨葉片再生不定梢的研究[J]. 果樹學報，2005，22（5）：557-560.

[8]孫清榮，劉慶忠，趙瑞華. 西洋梨葉片直接再生體細胞胚[J]. 園藝學報，2003，30（1）：85-86.

[9]徐凌飛，馬鋒旺，王喆之，等. 八月紅梨葉片不定芽誘導研究[J]. 西北農林科技大學學報：自然科學版，2002，30（4）：73-75.

[10]劉翠瓊. 梨的離體培養(yǎng)與葉片不定梢誘導研究[D]. 雅安：四川農業(yè)大學，2003：32-40.

[11]李海云，王中偉，邢少辰，等. 早梨18號葉片不定芽誘導及植株再生的研究[J]. 北方園藝，2008（9）：151-153.

[12]韓繼成，馮志紅，陳霜瑩. 梨離體葉片誘導不定芽的研究[J]. 河北果樹，1998（2）：12.

[13]劉洪章，譚雪輝，鄭 濤. 山梨葉片再生體系的研究[J]. 吉林農業(yè)大學學報，2008，30（4）：472-476.

[14]黃學林，李筱菊. 高等植物組織培養(yǎng)離體培養(yǎng)的形態(tài)建成及調控[M]. 北京：科學出版社，1995：78-80.

[15]布賴恩特J A. 植物基因表達的分子基礎[M]. 朱至清，譯. 北京：科學出版社，1986：274.

[16]韓清芳，徐凌飛，馬鋒旺，等. 梨葉柄再生不定芽的研究[J]. 西北植物學報，2002，22（6）：1485-1488.

[17]孫清榮，石蔭坪，孫洪雁.梨成熟胚子葉不定梢誘導[J]. 河北農業(yè)大學學報，1999，22（2）：50-52.

[18]吳祿平，張志宏，林麗華，等. 蘋果品種試管苗葉片再生不定芽[J]. 沈陽農業(yè)大學學報，1995，26（2）：131-135.

2.2 苗齡對不定芽誘導的影響

培養(yǎng)中的外植體細胞團由于不斷繼代，其形態(tài)發(fā)生能力可能保持，也可能喪失，產生不正常植株的頻率也會增加。因此，筆者對不同苗齡南果梨葉片離體再生情況進行了研究。結果（表2）表明，25、35 d苗齡的離體再生頻率顯著大于 60 d 苗齡，極顯著大于90、120 d，而25、35 d苗齡間差異不顯著。因此，選擇25～35 d苗齡葉片作為獲得高再生頻率的試材。

3 結論與討論

3.1 外源激素的影響

在不同生長素和細胞分裂素的配合使用中，兩者的比例十分重要。有研究證明，細胞分裂素類似物質腺嘌呤與生長素IAA之間的濃度配比可有效地控制植物組織培養(yǎng)中芽和根器官的發(fā)生。本試驗支持此觀點。本研究以在MS基本培養(yǎng)基上添加 6-BA 與NAA組合較6-BA與IAA組合更有利于不定芽的再生。這與孫清榮等研究結果[8]一致，與劉洪章等的研究結果[13]正好相反。培養(yǎng)基中激素的種類、濃度、配比不同造成生長和分化能力不同，可能是因為它們刺激了不同基因控制的酶類，從而影響內源激素的分布水平，進而在生長和分化上形成差異[14]。

3.2 苗齡的影響

隨著繼代次數(shù)增多，培養(yǎng)中的外植體器官形成的能力會發(fā)生改變。對不同苗齡葉片的再生能力進行比較試驗發(fā)現(xiàn)，苗齡越大，再生頻率越低，苗齡25～35 d的葉片再生能力最強。這可能與葉片的生理狀態(tài)有關，不同苗齡的葉片基因組中代謝基因及其活性不同，導致酶的活性及內源激素水平的差異，在外源激素及其他環(huán)境因素的作用下，表現(xiàn)出不同的再生能力[15]。

3.3 外植體放置方向的影響

以南果梨葉片遠軸面接觸培養(yǎng)基，其再生頻率高于近軸面接觸培養(yǎng)基的處理，這與劉洪章等的研究結果[13，16-17]一致，所以接種時以遠軸面向下為宜。

3.4 培養(yǎng)溫度的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，溫度對南果梨葉片再生芽有明顯影響，27 ℃以上明顯不利于葉片生長，與吳祿平等在蘋果品種試管苗葉片再生不定芽的研究結果[18]一致，造成這種現(xiàn)象的原因可能是溫度過高，使參與新陳代謝酶的活性受到抑制，從而使代謝過程和生長速率受到抑制，進而影響葉片再生。

參考文獻：

[1]曲澤洲，孫云蔚. 果樹種類論[M]. 北京：農業(yè)出版社，1990：50-51.

[2]蒲富慎，黃禮森，孫秉鈞，等. 梨品種[M]. 北京：農業(yè)出版社，1989：83.

[3]農業(yè)部農業(yè)技術推廣總站，張 力，于潤卿. 梨優(yōu)良品種及其豐產優(yōu)質栽培技術[M]. 北京：中國林業(yè)出版社，1993：62-66.

[4]王曉利，任寶君. 以開發(fā)南果梨為突破口大力推進農業(yè)產業(yè)結構調整[J]. 河北農業(yè)科技，2008（7）：55.

[5]王關林，方宏筠. 植物基因工程[M]. 北京：科學出版社，2009.

[6]孫愛君，章 鎮(zhèn)，張新生，等. 蘋果遺傳轉化的研究進展[J]. 遺傳，2001，23（6）：583-587.

[7]曹 霞，柴明良. 砂梨葉片再生不定梢的研究[J]. 果樹學報，2005，22（5）：557-560.

[8]孫清榮，劉慶忠，趙瑞華. 西洋梨葉片直接再生體細胞胚[J]. 園藝學報，2003，30（1）：85-86.

[9]徐凌飛，馬鋒旺，王喆之，等. 八月紅梨葉片不定芽誘導研究[J]. 西北農林科技大學學報：自然科學版，2002，30（4）：73-75.

[10]劉翠瓊. 梨的離體培養(yǎng)與葉片不定梢誘導研究[D]. 雅安：四川農業(yè)大學，2003：32-40.

[11]李海云，王中偉，邢少辰，等. 早梨18號葉片不定芽誘導及植株再生的研究[J]. 北方園藝，2008（9）：151-153.

[12]韓繼成，馮志紅，陳霜瑩. 梨離體葉片誘導不定芽的研究[J]. 河北果樹，1998（2）：12.

[13]劉洪章，譚雪輝，鄭 濤. 山梨葉片再生體系的研究[J]. 吉林農業(yè)大學學報，2008，30（4）：472-476.

[14]黃學林，李筱菊. 高等植物組織培養(yǎng)離體培養(yǎng)的形態(tài)建成及調控[M]. 北京：科學出版社，1995：78-80.

[15]布賴恩特J A. 植物基因表達的分子基礎[M]. 朱至清，譯. 北京：科學出版社，1986：274.

[16]韓清芳，徐凌飛，馬鋒旺，等. 梨葉柄再生不定芽的研究[J]. 西北植物學報，2002，22（6）：1485-1488.

[17]孫清榮，石蔭坪，孫洪雁.梨成熟胚子葉不定梢誘導[J]. 河北農業(yè)大學學報，1999，22（2）：50-52.

[18]吳祿平，張志宏，林麗華，等. 蘋果品種試管苗葉片再生不定芽[J]. 沈陽農業(yè)大學學報，1995，26（2）：131-135.