張盼盼， 朱顏劉瑩， 阿地力江·伊明， 劉鳳霞， 李建勇， 阿萊·巴合提汗， 阿卜杜熱伊木江·如則， 迪麗達(dá)爾·庫德熱提，買買提祖農(nóng)·買蘇爾

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1人體解剖學(xué)教研室， 2病理生理學(xué)教研室， 3微生物學(xué)教研室，烏魯木齊 830011)

陽痿是維吾爾醫(yī)學(xué)(維醫(yī))男科診療的優(yōu)勢病種。在千百年來發(fā)展過程中，維醫(yī)臨床對陽痿的診斷模式不斷成熟，并發(fā)展了獨(dú)特的特色方藥治療手段。陽痿是指男子陰莖不舉或舉而不堅(jiān)為主要特征的病癥，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中稱為陰莖勃起功能障礙(erectile dysfunction,ED)，并可見性欲減低與早泄等癥狀[1]。其維醫(yī)證型按照體液論分為異常黏液質(zhì)型、異常血液質(zhì)型、異常膽液質(zhì)型和異常黑膽質(zhì)型陽痿4種，其中尤以異常黏液質(zhì)型陽痿發(fā)病率最高。經(jīng)典男科維藥伊木薩克片(國藥準(zhǔn)字 Z65020144)是公認(rèn)的異常黏液質(zhì)型陽痿病證的對證藥物,源自1874年出版的維吾爾醫(yī)學(xué)典籍《醫(yī)科思熱愛扎穆》[2],已編入維吾爾醫(yī)學(xué)高校教材《維吾爾醫(yī)成藥學(xué)》中[3]。

本課題組前期研究工作中，以維吾爾醫(yī)學(xué)理論為指導(dǎo)，采取濕寒環(huán)境和濕寒飼料復(fù)合干預(yù)的方法建立了異常黏液質(zhì)證候大鼠模型，并在此基礎(chǔ)上，成功篩選出陽痿病證模型，在對其生殖生物學(xué)基礎(chǔ)進(jìn)行系列研究的過程中，發(fā)現(xiàn)該病證的發(fā)生發(fā)展與性腺軸相關(guān)激素的改變，以及由此引發(fā)的神經(jīng)內(nèi)分泌功能紊亂相關(guān)。本研究從形態(tài)學(xué)角度觀察了異常黏液質(zhì)型陽痿病證性腺軸改變及對證維藥伊木薩克片的影響，以探尋其生殖激素改變和該藥調(diào)節(jié)作用的組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取有正常性功能的雄性(SD)大鼠90只(由交配實(shí)驗(yàn)證實(shí))，雌性大鼠20只，體質(zhì)量(200±20)g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2主要儀器與試劑BIC-400 型人工氣候箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，BS-1105 型電子天平(北京賽多科斯天平有限公司)，DHG-9245A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。阿樸嗎啡(Apomorphine,APO，美國Sigma公司)，黃體酮(浙江仙琚治藥股份有限公司, 批號：120804)，雌二醇(寧波市三生藥業(yè)有限公司，批號：B130613)，伊木薩克片(新疆和田維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：20130501)。

1.3動(dòng)物分組和模型的建立

1.3.1 分組 90只雄性SD大鼠，經(jīng)交配實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有正常性功能后，從中隨機(jī)抽取10只為正常對照組(簡稱正常組)，余80只為造模組。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，大鼠自由飲食水，12/12 h晝夜交替飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(22±2)℃，濕度為(55±5)%，并對大鼠生物學(xué)表征進(jìn)行觀察和記錄，1 w后進(jìn)入造模階段。

1.3.2 濕寒飼料的制備 按每千克大鼠常規(guī)飼料中加入芫荽實(shí)和菠菜實(shí)各150 g。飼料由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心制備，芫荽實(shí)和菠菜實(shí)均購自新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院草藥房。

1.3.3 異常黏液質(zhì)證候模型的建立與分組 正常組用常規(guī)方法飼養(yǎng)，溫度為(22±2)℃，濕度為(55±5)%，每日給500 g普通飼料、1 000 mL水、200 g墊料。造模組放置于人工氣候箱中飼養(yǎng)，溫度(8±2)℃，濕度(85±5)%，于10∶00～20∶00/22∶00～10∶00分2批交替放入。造模組每組每日給濕寒飼料500 g，水與墊料同上。造模組與正常組均隨機(jī)飲食水，12/12 h人工照明，固定每日20∶00～22∶00給予飼料、水，更換墊料，并動(dòng)態(tài)觀測生物學(xué)表征的變化。20 w后，通過APO勃起實(shí)驗(yàn)和交配實(shí)驗(yàn)篩選出陽痿病證模型，將其隨機(jī)分為病證模型組、藥物干預(yù)組。

1.3.4 藥物干預(yù) 分組完畢后，將藥物干預(yù)組于常規(guī)條件下飼養(yǎng)，常規(guī)飲食，并用對證藥物伊木薩克片250 mg/kg灌胃，每天1次，余各組均予以等劑量蒸餾水灌胃，干預(yù)2 w，并行生物學(xué)表征觀測、APO勃起實(shí)驗(yàn)和性行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，通過與正常組和模型組的比較，確定藥物的干預(yù)效果。

1.3.5 取材 干預(yù)2 w后，將所有大鼠用1%戊巴比妥鈉腹腔注射(40 mg/kg)麻醉，取下丘腦、垂體和睪丸，將體積<1 mm3的組織，用4%戊二醛和1%鋨酸雙固定，剩余部分于4%多聚甲醛固定。

1.4觀察指標(biāo)將甲醛固定的下丘腦、垂體和睪丸組織進(jìn)行石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察；將戊二醛和鋨酸雙固定的組織丙酮梯度脫水，Epon環(huán)氧樹脂包埋切片，鉛鈾染色，JEOL JEM1230透視電鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1下丘腦觀察結(jié)果(1)正常組：光鏡下可見神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，胞核清晰，胞漿豐富，間質(zhì)無水腫(圖1-1)。電鏡下神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞基質(zhì)密度均一，細(xì)胞器均正常，核圓形或橢圓形，異染色質(zhì)較多，呈團(tuán)塊位于核膜下(圖2-1)；神經(jīng)元基質(zhì)密度尚可，細(xì)胞內(nèi)有較多游離核糖體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較發(fā)達(dá)(圖2-4)。(2)病證模型組：光鏡下可見血管擴(kuò)張充血，基質(zhì)疏松，呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，部分細(xì)胞核染色較淺，有空泡樣病變，提示有水腫(圖1-2)。電鏡下神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞基質(zhì)密度明顯下降，胞核異染色質(zhì)增多，核周隙增寬，細(xì)胞器較少且分布較散，線粒體水腫呈空泡樣病變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕微擴(kuò)張(圖2-2)；神經(jīng)元核膜界線不清，核形不規(guī)則，異染色質(zhì)增多，線粒體基質(zhì)密度下降，線粒體嵴排列松散，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有輕度擴(kuò)張(圖2-5)。(3)藥物干預(yù)組：光鏡下可見基質(zhì)水腫減輕，細(xì)胞核染色較淡(圖1-3)。電鏡下神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞基質(zhì)密度有所升高，少數(shù)線粒體水腫呈空泡樣變(圖2-3)；神經(jīng)元核膜清晰，核形規(guī)則，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見擴(kuò)張(圖2-6)。

1：正常組下丘腦(×400) 2：病證模型組下丘腦(×400) 3：藥物干預(yù)組下丘腦(×400)

7：正常組睪丸(×400) 8：病證模型組睪丸(×400) 9：藥物干預(yù)組睪丸(×400)

2.2垂體觀察結(jié)果(1)正常組：光鏡下可見腺垂體嗜酸性細(xì)胞呈圓形或橢圓形，嫌色細(xì)胞較小，圓形或多邊形，胞質(zhì)染色淺；神經(jīng)垂體見無髓神經(jīng)纖維，其間有豐富的竇狀毛細(xì)血管(圖1-4)。電鏡下細(xì)胞排列致密，胞核圓形，細(xì)胞內(nèi)有較多分泌顆粒，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較為發(fā)達(dá)(圖2-7)。(2)病證模型組：光鏡下可見腺垂體基質(zhì)疏松，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)邊界不清，神經(jīng)部基質(zhì)疏松明顯，細(xì)胞水腫(圖1-5)。電鏡下細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞內(nèi)有大量分泌顆粒，大部分線粒體空泡變，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯(圖2-8)。(3)藥物干預(yù)組：光鏡下基質(zhì)疏松較輕，細(xì)胞輕度水腫(圖1-6)。電鏡下細(xì)胞排列緊密，部分線粒體空泡變，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張減輕(圖2-9)。

2.3睪丸觀察結(jié)果(1)正常組：光鏡下可見生精小管豐富，管壁薄、管徑大，基膜明顯、完整；生精上皮排列整齊，5～8層可見各級生精細(xì)胞及支持細(xì)胞；生精小管之間可見疏松的間質(zhì)組織，富含血管及淋巴管，間質(zhì)細(xì)胞成群分布，體積大，圓形或多邊形，細(xì)胞核不規(guī)則，染色質(zhì)較淡，胞質(zhì)豐富(圖1-7)。電鏡發(fā)現(xiàn)精原細(xì)胞、支持細(xì)胞緊靠基膜且排列致密，支持細(xì)胞核仁明顯，胞質(zhì)基質(zhì)密度均一，各類生精細(xì)胞層數(shù)較多，精母細(xì)胞核圓，線粒體豐富，精曲小管管腔內(nèi)可見較多精子(圖2-10)。(2)病證模型組：光鏡下可見生精小管萎縮變形或扭曲成不規(guī)則形，管壁上生精細(xì)胞數(shù)量與精子數(shù)量明顯少于正常對照組；間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，核周圍可見空泡(圖1-8)。電鏡下各級生精細(xì)胞數(shù)量明顯減少，排列紊亂，可見有精原細(xì)胞、精母細(xì)胞核固縮，精子細(xì)胞界線模糊不清；支持細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張(圖2-11)。(3)藥物干預(yù)組：光鏡下可見生精小管豐富，基膜完整，生精上皮排列整齊，各級生精細(xì)胞明顯增多，間質(zhì)細(xì)胞成群分布，體積較大(圖1-9)。電鏡下生精細(xì)胞數(shù)量有所增多，支持細(xì)胞可見輕度水腫，管腔內(nèi)精子數(shù)量明顯增加(圖2-12)。

1：正常組下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(×10000) 2：病證模型組下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(×10000) 3：藥物干預(yù)組下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(×10000) 4：正常組下丘腦神經(jīng)元

5：病證模型組下丘腦神經(jīng)元

9：藥物干預(yù)組垂體

3 討論

為了從現(xiàn)代生殖生物學(xué)角度進(jìn)一步認(rèn)識維醫(yī)異常黏液質(zhì)型陽痿,本課題組前期研究基于維醫(yī)體液論和造模理念,成功建立了異常黏液質(zhì)證候動(dòng)物模型,并采用 APO 陰莖勃起實(shí)驗(yàn)與交配實(shí)驗(yàn)結(jié)合的方法,從中篩選出ED模型,對其生物學(xué)表征、性功能與交配行為、性腺軸與 NO-CGMP 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等生殖生物學(xué)方面的改變進(jìn)行了系統(tǒng)研究[4-6]。模型大鼠性腺軸相關(guān)激素水平的檢測結(jié)果顯示，其外周血清睪酮(T)水平顯著降低，而促黃體生成素(LH)、催乳素(PRL)和雌二醇(E2)水平顯著升高[7]，提示在該病證的發(fā)生發(fā)展中，性激素發(fā)生紊亂，并經(jīng)對證維藥伊木薩克片干預(yù)后得到有效調(diào)整，

生物學(xué)表征、勃起功能與交配能力均得到顯著提升，該結(jié)果提示，性腺軸的神經(jīng)內(nèi)分泌改變可能在該病證的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵性作用，而性腺軸可能是伊木薩克片對其治療作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

本研究在此基礎(chǔ)上，觀察了該病證的性腺軸形態(tài)學(xué)改變及對證維藥伊木薩克片的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該病證模型組下丘腦出現(xiàn)血管擴(kuò)張充血、基質(zhì)疏松等改變，部分細(xì)胞核染色較淺，有空泡樣病變，提示有水腫。電鏡下神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞基質(zhì)密度明顯下降，線粒體水腫呈空泡樣病變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕微擴(kuò)張；神經(jīng)元核膜界線不清，核形不規(guī)則，異染色質(zhì)增多，線粒體基質(zhì)密度下降；腺垂體基質(zhì)疏松，細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)邊界不清，神經(jīng)部基質(zhì)疏松明顯，細(xì)胞水腫。電鏡下細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞內(nèi)有大量分泌顆粒，大部分線粒體空泡樣變，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯。睪丸生精小管萎縮變形或扭曲成不規(guī)則形，各級生精細(xì)胞與層數(shù)明顯減少，間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，核周圍有空泡。電鏡下各級生精細(xì)胞數(shù)量明顯減少，排列紊亂，可見有精原細(xì)胞、精母細(xì)胞核固縮，精子細(xì)胞界限模糊不清。支持細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。而經(jīng)伊木薩克片干預(yù)后，下丘腦、垂體和睪丸的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)均得到不同程度的修復(fù)。該結(jié)果為以往研究中該病證的性腺軸相關(guān)激素的改變與伊木薩克片的調(diào)節(jié)機(jī)制提供了組織病理學(xué)與細(xì)胞形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

綜上所述，性腺軸的組織、細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變可能在異常黏液質(zhì)型陽痿病證的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵性作用，而性腺軸可能是伊木薩克片對其治療作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。該藥對性腺軸形態(tài)學(xué)的修復(fù)作用，可能是該藥對異常黏液質(zhì)型陽痿病證性腺軸相關(guān)激素紊亂的調(diào)節(jié)作用的組織與細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，但其具體機(jī)制與方式還需要進(jìn)一步研究并予以驗(yàn)證。

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