摘要：中華紅葉楊外植體在固體培養(yǎng)過程中褐變嚴(yán)重，因此針對(duì)培養(yǎng)基的pH值、無機(jī)鹽濃度、培養(yǎng)基硬度、蔗糖濃度及活性炭添加量進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明：在一定pH值范圍（5.0～6.5）內(nèi)，pH值越低，褐化率越低；無機(jī)鹽濃度低，褐化率低；在瓊脂濃度為5.0～6.5 g/L時(shí)，瓊脂濃度越高，培養(yǎng)基越硬，褐化率越低；低蔗糖濃度有利于降低褐化率；活性炭對(duì)褐化率的影響與添加量有關(guān)，適宜的添加量有利于降低褐化率。

關(guān)鍵詞：中華紅葉楊；外植體；褐變

中圖分類號(hào)： S792.110.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）01-0044-02

收稿日期：2013-05-05

作者簡介：李樹麗（1974—），女，山東沾化人，講師，主要從事植物組織培養(yǎng)方面的教學(xué)與研究。E-mail：bzlishuli@163.com。楊樹是世界各國普遍栽培的樹種，其栽培歷史悠久。楊樹具有生長迅速、輪伐期短、適應(yīng)性強(qiáng)、易繁殖等特點(diǎn)，各地廣泛用作行道樹、防護(hù)林及速生用材樹種。中華紅葉楊（Populus euramericana cv.Zhonghuahongye）是近幾年才發(fā)展起來的一個(gè)楊樹新品種，它不僅保持了楊樹的速生特性，而且其葉色隨季節(jié)呈現(xiàn)不同的變化，具有較高的觀賞性，是集觀賞與用材于一身的優(yōu)良樹種，發(fā)展?jié)摿薮?。?yīng)用組織培養(yǎng)方法實(shí)現(xiàn)植物離體快繁的突出優(yōu)點(diǎn)是快速、遺傳背景均一、不受季節(jié)和地區(qū)等限制、重復(fù)性好，應(yīng)用這種方法已實(shí)現(xiàn)了多種苗木的快速繁殖。但中華紅葉楊在組織培養(yǎng)過程中由于外植體的褐變影響了試管苗的分化及生長，因此本試驗(yàn)就培養(yǎng)基中不同因素對(duì)中華紅葉楊外植體褐變的影響進(jìn)行探索。

1材料與方法

1.1材料

中華紅葉楊：選自惠民紅葉楊發(fā)展公司的紅葉楊生產(chǎn)基地。外植體：選取中華紅葉楊一年生的枝條，將其切割成適當(dāng)大小的莖段。

1.2儀器

電子分析天平，上海天平儀器廠生產(chǎn)；立式高壓蒸汽滅菌鍋，日本三洋公司生產(chǎn)；超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司生產(chǎn)。

1.3試劑

鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純；pH試紙，上海三愛思試劑有限公司生產(chǎn)；精密pH計(jì)（PHS-3C型），上海雙贏科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。

1.4方法

基本培養(yǎng)基：除特殊說明外，基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，蔗糖濃度為30 g/L，瓊脂濃度為5.5 g/L，pH值為5.8。

1.4.1pH值對(duì)褐變的影響分別配制pH值為5.0、5.5、60、6.5的培養(yǎng)基（其他同基本培養(yǎng)基），每種pH值的培養(yǎng)基接種10瓶。接種后每5 d觀察1次。每處理重復(fù)3次。

1.4.2無機(jī)鹽濃度對(duì)褐變的影響設(shè)置3組處理，每組處理接種10瓶。接種后每5 d觀察1次。每處理重復(fù)3次。處理1：采用改良MS培養(yǎng)基（大量元素減半）；處理2：采用 1/2MS 培養(yǎng)基；處理3：采用MS培養(yǎng)基（對(duì)照）。

1.4.3培養(yǎng)基硬度對(duì)褐變的影響分別配制瓊脂含量為50、5.5、6.0、6.5 g/L的培養(yǎng)基（其他同基本培養(yǎng)基）每種培養(yǎng)基接種10瓶。接種后每5 d觀察1次。每處理重復(fù)3次。

1.4.4蔗糖濃度對(duì)褐變的影響分別配制蔗糖濃度為20%、2.5%、3.0%、4.0%的培養(yǎng)基（其他同基本培養(yǎng)基），每種培養(yǎng)基接種10瓶。接種后每5 d觀察1次。每處理重復(fù)3次。

1.4.5活性炭添加量對(duì)褐變的影響設(shè)置4組處理，每組處理接種10瓶。接種后每5 d觀察一次。4組處理分別重復(fù)3次。處理1：基本培養(yǎng)基，不添加活性炭（對(duì)照）；處理2：基本培養(yǎng)基，添加1 g/L的活性炭；處理3：基本培養(yǎng)基，添加3 g/L的活性炭；處理4：基本培養(yǎng)基，添加5 g/L的活性炭。

2結(jié)果與分析

2.1pH值對(duì)褐化率的影響

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，不同pH值培養(yǎng)基上培養(yǎng)的外植體的褐化率都逐步提高。外植體的褐化率隨pH值變化也呈規(guī)律性的變化，在相同的觀察時(shí)間內(nèi)，pH值越低，褐化率越低，隨著pH值的增加，褐化率也增加，不同處理之間差異顯著。說明不同的pH值對(duì)褐化率有明顯影響。從圖1可以看出，pH值5.0水平下的褐化率最低，說明低的pH值可以在一定程度上抑制褐變。

2.2無機(jī)鹽濃度對(duì)褐化率的影響

接種后5 d，改良MS培養(yǎng)基和1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)的外植體褐化率較低，而且水平相當(dāng)；而MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)的外植體褐化率較高。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，3種處理褐化率都逐步增加，其中，MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)的外植體褐化率一直處于最高水平，改良MS培養(yǎng)基和1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)的外植體的褐化率在整個(gè)培養(yǎng)過程中水平相當(dāng)，兩者與MS培養(yǎng)基（對(duì)照）間差異顯著（圖2），說明無機(jī)鹽濃度對(duì)褐化率有影響。

2.3培養(yǎng)基硬度對(duì)褐化率的影響

外植體的褐化率隨瓊脂濃度的增加呈現(xiàn)規(guī)律性的變化，瓊脂濃度越低，褐化率越高，隨瓊脂濃度的增加，褐化率逐漸

降低。不同處理之間差異顯著（圖3），說明培養(yǎng)基硬度對(duì)褐化率有顯著影響。雖然在一定范圍內(nèi)瓊脂濃度越高，外植體的褐化率越低，但瓊脂濃度過高，會(huì)造成培養(yǎng)基過硬，在接種時(shí)，外植體較難插入，還容易造成培養(yǎng)基的裂縫和分塊現(xiàn)象，同時(shí)培養(yǎng)基過硬，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)和激素難以運(yùn)輸，影響外植體的生長。

2.4蔗糖濃度對(duì)褐化率的影響

在蔗糖濃度的處理試驗(yàn)中，接種第5 d時(shí)，4種處理都出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象，含2%蔗糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的外植體褐化率最低；而含4%蔗糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的外植體褐化率最高，兩者差異較大。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，各組處理的褐化率都隨之增加，含2%蔗糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的外植體的褐化率一直處于最低水平，而含4%蔗糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的外植體的褐化率一直處于最高水平，不同處理之間差異顯著（圖4）。說明蔗糖濃度對(duì)褐化率影響較大，低的蔗糖濃度有利于抑制褐化。

2.5活性炭添加量對(duì)褐化率的影響

圖5顯示，培養(yǎng)基中加入活性炭后外植體的褐化率明顯低于培養(yǎng)基中不加活性炭的。培養(yǎng)基中活性炭添加量影響外植體的褐化率，培養(yǎng)基中加入1 g/L的活性炭，外植體的褐化率從不添加活性炭對(duì)照的76.7%降到40.0%；培養(yǎng)基中加入

3 g/L的活性炭，外植體的褐化率最低，為23.3%；而培養(yǎng)基中加入5 g/L的活性炭，外植體的褐化率反而增加。

3討論

3.1pH值對(duì)褐變的影響

pH值能影響外植體的褐變，在一定范圍內(nèi)（pH值 5.0～6.5），pH值越高，褐化現(xiàn)象越嚴(yán)重，低的pH值能明顯地抑制褐變。其原因可能是培養(yǎng)基中低pH值可降低PPO活性和底物利用率，從而抑制褐變[1]。在水稻體細(xì)胞培養(yǎng)中，pH值為4.5～5.0時(shí)MS液體培養(yǎng)基可保持愈傷組織處于良好的生長狀態(tài)，其表面呈黃白色，而pH值為55～6.0時(shí)，愈傷組織嚴(yán)重褐變[2]。

3.2無機(jī)鹽濃度對(duì)褐變的影響

無機(jī)鹽濃度影響外植體的褐化率，低的無機(jī)鹽濃度能減輕褐變現(xiàn)象，其原因可能是培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度過高可引起酚類物質(zhì)的大量產(chǎn)生，導(dǎo)致外植體褐變，降低鹽濃度則可減少酚類外溢，減輕褐變[1]。鄒英寧等在中國李的組織培養(yǎng)中也認(rèn)為改良MS培養(yǎng)基的褐化率低于MS培養(yǎng)基[3]。張妙霞等在柿樹組織培養(yǎng)防止褐變所進(jìn)行的試驗(yàn)中，培養(yǎng)基以改良MS培養(yǎng)基（大量元素減半）和1/2MS培養(yǎng)基的效果最好，MS培養(yǎng)基的效果較差，表明低濃度的無機(jī)鹽可促進(jìn)外植體生長與分化，減輕外植體褐變程度[4]。

3.3培養(yǎng)基硬度對(duì)褐變的影響

在一定范圍內(nèi)（瓊脂5.0～ 65 g/L），瓊脂用量越大，培養(yǎng)基硬度越大，褐變?cè)捷p，這與金堅(jiān)敏在水稻上的試驗(yàn)結(jié)果[2]一致，其原因可能是培養(yǎng)基的硬度影響了酚類物質(zhì)擴(kuò)散速度的緣故。但培養(yǎng)基過硬，也影響外植體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)和激素的吸收，造成外植體生長不良。

蔗糖濃度對(duì)褐變的影響：蔗糖濃度明顯地影響外植體的褐變，蔗糖濃度越高，褐化率越高，低的蔗糖濃度有利于減輕褐變。王苑等在植物組織培養(yǎng)的褐變現(xiàn)象及研究進(jìn)展中指出過高的糖濃度會(huì)加劇褐變[5]。

活性炭對(duì)褐變的影響：培養(yǎng)基中加入一定量的活性炭能明顯地抑制褐變，因?yàn)榛钚蕴磕芪酵庵搀w產(chǎn)生的有害物質(zhì)，從而減輕褐變。曹鴻斌等在對(duì)龍眼外植體褐變的研究中也證實(shí)加入活性炭能較好地抑制褐化[6]。但活性炭加入的量要適宜，因?yàn)榛钚蕴康奈阶饔檬菬o選擇性的，它在吸附有害物質(zhì)的同時(shí)，也吸附了營養(yǎng)物質(zhì)和激素，從而影響外植體生長。

除培養(yǎng)基外，影響外植體褐變的因素還有很多，如外植體的生理狀態(tài)、溫度、光照等，需要進(jìn)一步研究探討。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉慶昌，吳國良. 植物細(xì)胞組織培養(yǎng)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2003：40.

[2]金堅(jiān)敏，張靜蘭，唐定臺(tái). 水稻幼穗和成熟種子誘導(dǎo)胚狀體時(shí)的有關(guān)因子探討[J]. 植物學(xué)通報(bào)，1992，9（2）：53-54.

[3]鄒英寧，李國懷，吳強(qiáng)盛.中國李組織培養(yǎng)過程中褐變的抑制研究[J]. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2007，26（6）：508-512.

[4]張妙霞，孔祥生，郭秀璞，等. 柿樹組織培養(yǎng)防止外植體褐變的研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，33（1）：87-91.

[5]王苑，謝凝子. 植物組織培養(yǎng)中的褐變現(xiàn)象及抗褐變研究進(jìn)展[J]. 黔西南民族師范高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2007（3）：109-113.

[6]曹鴻斌，劉魁英，趙宗蕓，等. 龍眼組培的褐變抑制研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（8）：3132-3133.駱美蓉，江明鋒，張鵬，等. 山羊分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：46-49.

2.5活性炭添加量對(duì)褐化率的影響

圖5顯示，培養(yǎng)基中加入活性炭后外植體的褐化率明顯低于培養(yǎng)基中不加活性炭的。培養(yǎng)基中活性炭添加量影響外植體的褐化率，培養(yǎng)基中加入1 g/L的活性炭，外植體的褐化率從不添加活性炭對(duì)照的76.7%降到40.0%；培養(yǎng)基中加入

3 g/L的活性炭，外植體的褐化率最低，為23.3%；而培養(yǎng)基中加入5 g/L的活性炭，外植體的褐化率反而增加。

3討論

3.1pH值對(duì)褐變的影響

pH值能影響外植體的褐變，在一定范圍內(nèi)（pH值 5.0～6.5），pH值越高，褐化現(xiàn)象越嚴(yán)重，低的pH值能明顯地抑制褐變。其原因可能是培養(yǎng)基中低pH值可降低PPO活性和底物利用率，從而抑制褐變[1]。在水稻體細(xì)胞培養(yǎng)中，pH值為4.5～5.0時(shí)MS液體培養(yǎng)基可保持愈傷組織處于良好的生長狀態(tài)，其表面呈黃白色，而pH值為55～6.0時(shí)，愈傷組織嚴(yán)重褐變[2]。

3.2無機(jī)鹽濃度對(duì)褐變的影響

無機(jī)鹽濃度影響外植體的褐化率，低的無機(jī)鹽濃度能減輕褐變現(xiàn)象，其原因可能是培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度過高可引起酚類物質(zhì)的大量產(chǎn)生，導(dǎo)致外植體褐變，降低鹽濃度則可減少酚類外溢，減輕褐變[1]。鄒英寧等在中國李的組織培養(yǎng)中也認(rèn)為改良MS培養(yǎng)基的褐化率低于MS培養(yǎng)基[3]。張妙霞等在柿樹組織培養(yǎng)防止褐變所進(jìn)行的試驗(yàn)中，培養(yǎng)基以改良MS培養(yǎng)基（大量元素減半）和1/2MS培養(yǎng)基的效果最好，MS培養(yǎng)基的效果較差，表明低濃度的無機(jī)鹽可促進(jìn)外植體生長與分化，減輕外植體褐變程度[4]。

3.3培養(yǎng)基硬度對(duì)褐變的影響

在一定范圍內(nèi)（瓊脂5.0～ 65 g/L），瓊脂用量越大，培養(yǎng)基硬度越大，褐變?cè)捷p，這與金堅(jiān)敏在水稻上的試驗(yàn)結(jié)果[2]一致，其原因可能是培養(yǎng)基的硬度影響了酚類物質(zhì)擴(kuò)散速度的緣故。但培養(yǎng)基過硬，也影響外植體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)和激素的吸收，造成外植體生長不良。

蔗糖濃度對(duì)褐變的影響：蔗糖濃度明顯地影響外植體的褐變，蔗糖濃度越高，褐化率越高，低的蔗糖濃度有利于減輕褐變。王苑等在植物組織培養(yǎng)的褐變現(xiàn)象及研究進(jìn)展中指出過高的糖濃度會(huì)加劇褐變[5]。

活性炭對(duì)褐變的影響：培養(yǎng)基中加入一定量的活性炭能明顯地抑制褐變，因?yàn)榛钚蕴磕芪酵庵搀w產(chǎn)生的有害物質(zhì)，從而減輕褐變。曹鴻斌等在對(duì)龍眼外植體褐變的研究中也證實(shí)加入活性炭能較好地抑制褐化[6]。但活性炭加入的量要適宜，因?yàn)榛钚蕴康奈阶饔檬菬o選擇性的，它在吸附有害物質(zhì)的同時(shí)，也吸附了營養(yǎng)物質(zhì)和激素，從而影響外植體生長。

除培養(yǎng)基外，影響外植體褐變的因素還有很多，如外植體的生理狀態(tài)、溫度、光照等，需要進(jìn)一步研究探討。

參考文獻(xiàn)：

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[3]鄒英寧，李國懷，吳強(qiáng)盛.中國李組織培養(yǎng)過程中褐變的抑制研究[J]. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2007，26（6）：508-512.

[4]張妙霞，孔祥生，郭秀璞，等. 柿樹組織培養(yǎng)防止外植體褐變的研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，33（1）：87-91.

[5]王苑，謝凝子. 植物組織培養(yǎng)中的褐變現(xiàn)象及抗褐變研究進(jìn)展[J]. 黔西南民族師范高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2007（3）：109-113.

[6]曹鴻斌，劉魁英，趙宗蕓，等. 龍眼組培的褐變抑制研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（8）：3132-3133.駱美蓉，江明鋒，張鵬，等. 山羊分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：46-49.

2.5活性炭添加量對(duì)褐化率的影響

圖5顯示，培養(yǎng)基中加入活性炭后外植體的褐化率明顯低于培養(yǎng)基中不加活性炭的。培養(yǎng)基中活性炭添加量影響外植體的褐化率，培養(yǎng)基中加入1 g/L的活性炭，外植體的褐化率從不添加活性炭對(duì)照的76.7%降到40.0%；培養(yǎng)基中加入

3 g/L的活性炭，外植體的褐化率最低，為23.3%；而培養(yǎng)基中加入5 g/L的活性炭，外植體的褐化率反而增加。

3討論

3.1pH值對(duì)褐變的影響

pH值能影響外植體的褐變，在一定范圍內(nèi)（pH值 5.0～6.5），pH值越高，褐化現(xiàn)象越嚴(yán)重，低的pH值能明顯地抑制褐變。其原因可能是培養(yǎng)基中低pH值可降低PPO活性和底物利用率，從而抑制褐變[1]。在水稻體細(xì)胞培養(yǎng)中，pH值為4.5～5.0時(shí)MS液體培養(yǎng)基可保持愈傷組織處于良好的生長狀態(tài)，其表面呈黃白色，而pH值為55～6.0時(shí)，愈傷組織嚴(yán)重褐變[2]。

3.2無機(jī)鹽濃度對(duì)褐變的影響

無機(jī)鹽濃度影響外植體的褐化率，低的無機(jī)鹽濃度能減輕褐變現(xiàn)象，其原因可能是培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度過高可引起酚類物質(zhì)的大量產(chǎn)生，導(dǎo)致外植體褐變，降低鹽濃度則可減少酚類外溢，減輕褐變[1]。鄒英寧等在中國李的組織培養(yǎng)中也認(rèn)為改良MS培養(yǎng)基的褐化率低于MS培養(yǎng)基[3]。張妙霞等在柿樹組織培養(yǎng)防止褐變所進(jìn)行的試驗(yàn)中，培養(yǎng)基以改良MS培養(yǎng)基（大量元素減半）和1/2MS培養(yǎng)基的效果最好，MS培養(yǎng)基的效果較差，表明低濃度的無機(jī)鹽可促進(jìn)外植體生長與分化，減輕外植體褐變程度[4]。

3.3培養(yǎng)基硬度對(duì)褐變的影響

在一定范圍內(nèi)（瓊脂5.0～ 65 g/L），瓊脂用量越大，培養(yǎng)基硬度越大，褐變?cè)捷p，這與金堅(jiān)敏在水稻上的試驗(yàn)結(jié)果[2]一致，其原因可能是培養(yǎng)基的硬度影響了酚類物質(zhì)擴(kuò)散速度的緣故。但培養(yǎng)基過硬，也影響外植體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)和激素的吸收，造成外植體生長不良。

蔗糖濃度對(duì)褐變的影響：蔗糖濃度明顯地影響外植體的褐變，蔗糖濃度越高，褐化率越高，低的蔗糖濃度有利于減輕褐變。王苑等在植物組織培養(yǎng)的褐變現(xiàn)象及研究進(jìn)展中指出過高的糖濃度會(huì)加劇褐變[5]。

活性炭對(duì)褐變的影響：培養(yǎng)基中加入一定量的活性炭能明顯地抑制褐變，因?yàn)榛钚蕴磕芪酵庵搀w產(chǎn)生的有害物質(zhì)，從而減輕褐變。曹鴻斌等在對(duì)龍眼外植體褐變的研究中也證實(shí)加入活性炭能較好地抑制褐化[6]。但活性炭加入的量要適宜，因?yàn)榛钚蕴康奈阶饔檬菬o選擇性的，它在吸附有害物質(zhì)的同時(shí)，也吸附了營養(yǎng)物質(zhì)和激素，從而影響外植體生長。

除培養(yǎng)基外，影響外植體褐變的因素還有很多，如外植體的生理狀態(tài)、溫度、光照等，需要進(jìn)一步研究探討。

參考文獻(xiàn)：

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[3]鄒英寧，李國懷，吳強(qiáng)盛.中國李組織培養(yǎng)過程中褐變的抑制研究[J]. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2007，26（6）：508-512.

[4]張妙霞，孔祥生，郭秀璞，等. 柿樹組織培養(yǎng)防止外植體褐變的研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，33（1）：87-91.

[5]王苑，謝凝子. 植物組織培養(yǎng)中的褐變現(xiàn)象及抗褐變研究進(jìn)展[J]. 黔西南民族師范高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2007（3）：109-113.

[6]曹鴻斌，劉魁英，趙宗蕓，等. 龍眼組培的褐變抑制研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（8）：3132-3133.駱美蓉，江明鋒，張鵬，等. 山羊分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：46-49.